2. Obiettivi : Perché è utile l’analisi del DNA ed attuali metodiche Quali sono i reperti che consentono l’analisi del DNA a fini di identificazione personale
3.
4.
5. Brief History of Forensic DNA Typing In April 1953 Watson and Crick published a model of the DNA helix in a one page letter to ‘Nature’. It began with the now famous under statement: “We wish to suggest a structure for the salt of deoxyribose nucleic acid (D.N.A.). This structure has novel features which are of considerable biological interest”. 1984 Alec Jefferies and colleagues develop genetic fingerprinting - using DNA to positively identify individuals. 1986 The polymerase chain reaction (PCR) is first described in scientific literature. PCR enabled scientists to rapidly multiply small areas of DNA. 1987 In the UK forensic investigators use DNA testing to help solve the ‘Black Pad’ murders and to identify the killer as Colin Pitchfork, who later confessed to the crimes. This marks the first case in which DNA evidence is used to determine the identity of a murderer and it also involved a mass screen. In addition this also marks the first case in which a prime suspect was exonerated due to DNA evidence. 1994 Dublin laboratory began using DNA technology.The first case involving DNA evidence is heard in the Irish courts. DPP V Mark Lawlor. 1995 PCR and DNA fingerprinting play a starring role in the O.J. Simpson murder trial. The Forensic Science Service starts the UK National DNA database. 1998 The FBI launches its national database. 2003 The Irish Attorney General requested the Law Reform Commission to consider the establishment of a National DNA Database. 2007 Legislation dealing with the establishment of a database before Dáil Éireann. 2010 New Criminal Justice (Forensic Evidence and DNA Database System) Bill 2010 published by the Minster for Justice, Equality and Law Reform, Mr. Dermot Ahern T.D.
6. Perchè il DNA? Profilo unico ed individuale (eccetto i gemelli monozigoti) Presente in tutti i tessuti (ossa, formazioni pilifere, sangue, saliva e altri fluidi e tessuti) Ereditarietà (Paternità, Maternità, resti scheletrici)
7. cellule bianche del sangue spermatozoi cellule della mucosa buccale
10. Il termine deriva dal greco e significa molte forme Un sistema si dice polimorfico quando ammette almeno due forme possibili (alleli) e la frequenza dell’allele secondo per incidenza e’ superiore a 0,01 POLIMORFISMO
11. DNA in the Cell Target Region for PCR chromosome cell nucleus Double stranded DNA molecule Individual nucleotides
12. ATTIVITA’ DEL GENETISTA FORENSE RICERCA E RACCOLTA DELLE TRACCE RICOSTRUZIONE DEL FATTO (FORMA E POSIZIONE DELLE TRACCE) DETERMINAZIONE DELLA NATURA DELLE TRACCE DETERMINAZIONE DEL SESSO E DELL ’ ORIGINE DEL DNA (tracce, altro) CATENA DI CUSTODIA, QUESTIONI TECNICO-GIURIDICHE
13. ATTIVITA’ DEL GENETISTA FORENSE RICERCA E RACCOLTA DELLE TRACCE RICOSTRUZIONE DEL FATTO (FORMA E POSIZIONE DELLE TRACCE) DETERMINAZIONE DELLA NATURA DELLE TRACCE DETERMINAZIONE DEL SESSO E DELL ’ ORIGINE DEL DNA (tracce, altro) CATENA DI CUSTODIA, QUESTIONI TECNICO-GIURIDICHE
14. SOPRALLUOGO GIUDIZIARIO Ispezione di luoghi e cose per accertare le tracce e gli altri effetti materiali che il reato abbia lasciato (Clemente Puccini) AMBIENTE CADAVERE SOGG. VIVENTE COMPLESSITA’ DELL’INTERVENTO DI SOPRALLUOGO COORDINAMENTO DEI VARI ESPERTI (medico legale, botanico, genetista, ecc.) TRAINING DEGLI ESPERTI MANTENERE INALTERATA LA SCENA RACCOLTA DATI (immagini, reperti)
15. Tecniche di repertamento Evitare contaminazione : utilizzo di guanti e cambio degli stessi nel passare da un reperto all’altro Repertare il più presto possibile , la probabilità di raccogliere tracce utili diminuisce col passare del tempo Assicurarsi che i campioni siano confezionati, conservati e trasportati correttamente. In generale campioni fluidi devono essere congelati, tutto il materiale umido deve essere essiccato. Contrassegnare accuratamente con pennarello indelebile Mantenere la continuità della catena di custodia , documentare ogni trasferimento
16. ATTIVITA’ DEL GENETISTA FORENSE RICERCA E RACCOLTA DELLE TRACCE RICOSTRUZIONE DEL FATTO (FORMA E POSIZIONE DELLE TRACCE) DETERMINAZIONE DELLA NATURA DELLE TRACCE DETERMINAZIONE DEL SESSO E DELL ’ ORIGINE DEL DNA (tracce, altro) CATENA DI CUSTODIA, QUESTIONI TECNICO-GIURIDICHE
19. ATTIVITA’ DEL GENETISTA FORENSE RICERCA E RACCOLTA DELLE TRACCE RICOSTRUZIONE DEL FATTO (FORMA E POSIZIONE DELLE TRACCE) DETERMINAZIONE DELLA NATURA DELLE TRACCE DETERMINAZIONE DEL SESSO E DELL ’ ORIGINE DEL DNA (tracce, altro) CATENA DI CUSTODIA, QUESTIONI TECNICO-GIURIDICHE
20. La traccia “forense” può . . . Identificare il reo Ricostruire l’evento criminoso Collegare il sospetto alla vittima o alla scena del delitto Escludere persone innocenti
21. L’APPROCCIO MEDICO-LEGALE ALLO STUDIO DELLA TRACCIA Diagnosi GENERICA: è sangue/sperma/capello? Diagnosi DI SPECIE UMANA : è umano? Diagnosi DI SESSO : maschile/femminile? Diagnosi INDIVIDUALE : DNA-confronto
22. TRACCE BIOLOGICHE L’individuazione e l’identificazione di fluidi biologici sulla scena del crimine sono un aspetto molto importante in campo forense, in quanto hanno come fine ultimo l’identificazione del soggetto da cui proviene la sostanza. Ogni fluido biologico ha una composizione unica e la presenza di specifiche componenti è alla base dei test di identificazione. La determinazione del fluido biologico non deve andare a compromettere la tipizzazione del DNA per l’individuazione del profilo genetico, si devono utilizzare metodiche che non richiedano una grande quantità di materiale per evitare di consumare tutta la traccia a disposizione o che permettano di utilizzare il frammento per più analisi I test di identificazione si possono dividere in: Test orientativi : molti tessuti possiedono sostanze caratteristiche specifiche, ma non sono uniche (falsi positivi) Test di certezza : caratteristiche specifiche ed uniche per quel tessuto
23. Test orientativi SANGUE: Test rapidi per la loro semplicità, dotati di una grande sensibilità, ma su di essi grava l’aspecificità per cui possono solo indirizzare e fornire elementi utili che dovranno poi essere confermati con metodi specifici. Quasi tutti sono test colorimetrici dove il viraggio di colorazione può essere un segnale della presenza della sostanza interessata, ma anche un falso positivo, viceversa la mancanza di viraggio determina già l’assenza della sostanza interessata. Si possono ricordare quelli basati sull’utilizzo di leucobasi, sostanze indicatrici incolori e perossido di idrogeno, il luminol. LIQUIDO SEMINALE: test basati sulla componente enzimatica, ma molto aspecifici. Si può ricordare la lampada di Wood. SALIVA: test basati sulla presenza dell’enzima α -amilasi, ma aspecifico perché è presente in molti tessuti.
27. Test di certezza Sono metodi più complessi, ma molto specifici e sensibili. Tale determinazione avviene per mezzo di una reazione antigene anticorpo specifica per ogni tessuto da analizzare.
30. Interpretazione dei risultati Il risultato negativo è dato dalla colorazione del solo Test in posizione della T, in quanto la concentrazione della sostanza da analizzare è inferiore al valore soglia (4ng/ml). Il risultato positivo è data dalla doppia banda e la concentrazione della sostanza è superiore alla soglia. Se la linea del controllo non si è visualizzata il test è invalidato e si deve ripetere Negativo Positivo 4ng/ml Invalidato NEGATIVE POSITIVE 4ng/ml INVALID
31. SOSPETTA TRACCIA EMATICA Diagnosi generica di sangue Diagnosi di specie Diagnosi regionale (sangue mestruale) Diagnosi individuale Profilo genetico Situazioni complesse: Profilo misto DNA degradato (drop‑out allelico) Presenza di inibitori della reazione di amplificazione (emoglobina )
32.
33.
34. Sospetta traccia seminale Diagnosi di sperma umano Estrazione del DNA che prevede la separazione delle eventuali cellule femminili (lisi differenziale) Polimorfismi del DNA Situazioni complesse: Indumento lavato Contaminazione della traccia con materiale fecale o altri inibitori Nei casi di violenza sessuale con più di un aggressore e più di un profilo genetico nella traccia
35. Identificazione dello sperma Cosa è lo sperma? Mistura semi-fluida costituita da: Cellule Enzimi altre molecole organiche ed inorganiche Le cellule spermatozoarie sono i componenti più importanti. Ma lo sono anche le cellule epiteliali di sfaldamento nel soggetto azoospermico
36.
37. Prostate-Specific Antigen (PSA or p30) PSA è la proteina prodotta dalla ghiandola prostatica PSA + può confermare la presenza di liquido seminale anche in soggetti azoospermici Reazione antigene anticorpo
38. Tracce di saliva Da mozziconi di sigaretta Da buste e francobolli Da passamontagna nella regione della bocca Dalla cute Tracce di sudore Tracce all'interno di guanti in lattice
39.
40. Il DNA dalle impronte digitali Problema del Low copy number (LCN) • possibilità di typing misti da contaminazione • possibilità di artefatti da amplificazione
41. Resti scheletrici Esame antropometrico dei resti Estrazione del DNA Tecniche di decontaminazione Tipizzazione del DNA genomico Tipizzazione del DNA mitocondriale Risultati in funzione dei fattori ambientali e del tempo Caso Romanov Ricostruzione attraverso il DNA mitocondriale dei discendenti *Il DNA mitocondriale si trasmette solo per via materna
42. Formazioni pilifere Esame macroscopico (lunghezza, colore, morfologia) Esame microscopico Stato della radice pilifera: Fase anagen Fase catagen Fase telogen Diagnosi regionale Estrazione del DNA Tipizzazione del DNA genomico se presente la radice Tipizzazione del solo DNA mitocondriale da fusto Situazioni complesse: Presenza di inibitori (tinture per capelli) DNA degradato se radice in fase telogen Eteroplasmia del DNA mitocondriale e sua diversa rappresentazione nelle formazioni pilifere
44. Metodi di Estrazione del DNA Ogni cellula nucleata contiene DNA: sangue, saliva, ossa, spermatozoi, cell. epiteliali, capelli. Chelex : resina chelante che mantiene il DNA a singola elica che può essere utilizzato per la PCR Metodi organici : fenolo/cloroformio Kit del commercio Tali metodiche devono garantire: massima quantità possibile di DNA estratto minore degradazione possibile migliore qualità o purezza dell’estratto
45.
46.
47.
48. Christmas Tree Stain Esame microscopico per le cellule spermatiche La colorazione aiuta a distinguere gli spermatozoi dalle cellule epiteliali 2 i colori utilizzati: Verde – citoplasma cellule epiteliali Rosso – nuclei cellulari e acrosoma
49.
50. STR ( S hort T andem R epeat) regioni non espresse, presenti negli introni, con un elevato grado di polimorfismo di lunghezza ripetizioni in tandem di corte catene oligonucleotidiche formate da 2-6 paia basi struttura tri-tetramerica per ottenere una tipizzazione più precisa degli alleli abbondanti lungo il genoma e presenti su cromosomi diversi resistenti alla degradazione dovuto alla ridotta dimensione molecolare dei frammenti (100-300bp) che rende possibile l’amplificazione del DNA da reperti biologici (tessuti in via di decomposizione, inclusi in paraffina o formalina, reperti archeologici) PCR multiplex partendo da esigue quantità di DNA estratto presenza di più alleli per ogni STR analizzato = alta variabilità allelica nelle varie popolazioni
51.
52. Reazione a catena della polimerasi PCR ( P olymerase C hain R eaction) Introdotta nel 1985 da Mullis e Saiki , la PCR è una tecnica “in vitro” utilizzata per amplificare una specifica regione del DNA di lunghezza e sequenza definita a partire da piccole quantità di estratto. Nel 1986, negli USA fu introdotta per la prima volta in campo forense
53. Amplificazione mediante PCR Denaturazione : aumento della temperatura fino a 94°C per separare i filamenti di DNA Annealing : raffreddamento del sistema (50°C-60°C) per permettere ai primers di attaccarsi alla regione complementare Estensione : gli oligonucleotidi, grazie alla Taq polimerasi, a 72°C si saldano e formano un nuovo filamento di DNA
54. A G A C C G A G A C T T A T Taq DNA MgCl 2 MgCl 2 MgCl 2 MgCl 2 MgCl 2 Buffer Buffer Buffer Buffer R F H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O H 2 O
55.
56. VANTAGGI Tecnicamente gli STR, a confronto con altri marcatori, presentano il vantaggio di essere: numerosi equamente distribuiti in tutta la parte eucromatica del genoma altamente polimorfici e quindi informativi analizzabili facilmente tramite PCR Questa relativa facilit à di studio ha portato ad un rapido incremento del numero degli STRs esaminati
57.
58. PCR svantaggi sensibilità (rischio di contaminazioni-falsi positivi) variabile efficienza di amplificazione a seconda della sequenza richiede conoscenza di base delle sequenze da amplificare e messa a punto per coppie di oligonucleotidi di innesco (primers) può sintetizzare frammenti relativamente corti la sintesi è imprecisa e introduce errori nella sequenza (la Taq pol non possiede attività 3’->5’ esonucleasica )
59. Inibitori della PCR agenti inibenti che agiscono sulla Taq coloranti o tessuti particolari (denim) emoglobina che interferisce con la Taq polimerasi degradazione del DNA
61. Contaminazione della PCR contaminazione dei campioni da esaminare con DNA umano estraneo (dell’operatore o presente nell’ambiente) contaminazione nel laboratorio di prodotto di PCR (altamente volatile) derivato da precedenti reazioni di amplificazione
62. Metodi per eliminare il pericolo di contaminazione separazione delle aree di estrazione, amplificazione ed analisi post PCR, utilizzando strumenti per ciascuna area l’uso di reagenti separati ed aliquotati allestire sempre controlli positivi e negativi utilizzare guanti e camici sterili, puntali con filtro e provette sterili irradiazione ultravioletta dell’area PCR e pulizia con appositi detergenti
63. CODIS Nel 1990, l’FBI decide di utilizzare loci caratteristici per le indagini forensi. Durante questi anni il numero dei loci analizzato è aumentato; oggi il CODIS ( CO mbined D NA I ndex S istem) analizza 13 loci altamente polimorfici; tra questi, 11 si trovano su cromosomi differenti, 2 sullo stesso. Tutti i loci sono localizzati in regioni non codificanti. L’utilizzo di medesimi loci nelle varie popolazioni permette di avere informazioni sulla frequenza di un determinato allele nella popolazione in esame. Il CODIS è utilizzato in tutti i laboratori forensi americani.
64.
65.
66. Sequenziatore automatico L’elettroforesi capillare su sequenziatore automatico sta diventando un metodo preferenziale per l’analisi dei campioni marcati in fluorescenza. L’uso del sequenziatore piuttosto del gel, permette una veloce separazione dei frammenti di DNA, una maggiore risoluzione e minimizza gli errori manuali dovuti all’operatore ( RIPRODUCIBILITÀ DEI RISULTATI )
67.
68.
69.
70.
71.
72. Si applica corrente elettrica Il Dna negativo migra verso il polo positivo I frammenti di DNA amplificati vengono iniettati elettro-cineticamente all’interno del capillare Il DNA è separato in base al size: piccoli STRs corrono più veloci grandi STRs corrono più lenti STRs* passano davanti alla finestra e vengono eccitati dal raggio laser Detector Window
80. LARGE SMALL Degradazione quando il campione biologico è esposto a condizioni ambientali avverse, si degrada: caldo, umido, luce solare, tempo la degradazione rompe il DNA a random estese porzioni del DNA sono attaccate per prima
81.
82.
83. TRACCE MISTE Nel caso di violenza con piu’ aggressori Nel caso di commistione tra fluidi biologici appartenenti a piu’ individui Valutazione dei profili e dell’altezza dei picchi
84. Sample Mixture Example Profiler Plus data D5S818 D13S317 D7S820 D8S1179 D21S11 D18S51 Amel VWA FGA D3S1358 blue panel green panel yellow panel Relative Fluorescence Units Più alto di una stutter band “ Stutter” nella posizione sbagliata Imbalance tra X e Y 4 picchi in un singolo locus
