ݺߣ

ݺߣShare a Scribd company logo

Bioteknologi kesehatan (insulin)

•Download as DOC, PDF•
•
Dea Amallya
Dea Amallya

Pembuatan Insulin

1 of 12
BAB I Pendahuluan 1.1. Latar Belakang Pada tahun 1965, insulin manusia telah berhasil disintesis secara kimia. Secara tradisional, insulin untuk pengobatan pada manusia diisolasi dari pankreas sapi atau babi. Walaupun insulin hewan secara umum cukup memuaskan tetapi untuk penggunaan pada manusia dapat menimbulkan masalah yaitu adanya perbedaan kecil dalam asam amino penyusunnya dan menimbulkan efek samping berupa alergi pada beberapa penderita. Seiring perkembangan zaman, pada tahap bioteknologi generasi ke tiga pertengahan tahun 1970-an berkembang pesat pemanfaatan teknologi rekayasa genetika untuk memanipulasi dan memperbaiki sifat organisme sebagai “agen yang berperan penting dalam bioproses”. Kemajuan bioteknologi khususnya bidang kesehatan telah menemukan suatu teknologi berupa sintesis insulin dengan bantuan bakteri yang biasa terdapat di usus besar manusia Escherichia coli, proses ini disebut dengan teknologi plasmid. Teknologi plasmid bertujuan untuk proses mengidentifikasi dan mengisolasi DNA dari suatu sel hidup atau mati dan memasukkannya dalam sel hidup lainnya. Rekayasa genetika merupakan suatu cara memanipulasikan gen untuk menghasilkan makhluk hidup baru dengan sifat yang diinginkan. Rekayasa genetika disebut juga pencangkokan gen atau rekombinasi DNA. Teknologi DNA rekombinan, insulin diproduksi menggunakan sel mikroba yang tidak patogen. Pada proses rekayasa genetika organisme yang sering digunakan adalah bakteri E. coli. Bakteri E. coli dipilih karena paling mudah dipelajari pada taraf molekuler, mudah dikembangbiakan dan waktu reproduksinya cukup cepat. Insulin hasil rekayasa genetika ini mempunyai efek samping yang relatif sangat rendah dibandingkan dengan insulin yang diperoleh dari ekstrak pankreas hewan yang dapat menimbulkan efek samping berupa alergi oleh karena itulah keuntungan dari insulin hasil rekayasa genetik ini adalah insulin tersebut bebas dari protein hewan yang tercemar yang sering menimbulkan alergi. Setelah ditemukan teknik rekayasa genetika insulin di bidang bioteknologi, harga insulin bisa ditekan dengan drastis sehingga dapat membantu para penderita diabetes mellitus. 1.2. Rumusan Masalah 1. Apa yang dimaksud dengan insulin dan teknologi rekayasa genetika? 2. Bagaimana proses pembuatan insulin dengan teknik DNA rekombinan?
1.3. Tujuan • Mengetahui dan memahami pengertian insulin dan rekayasa genetika • Mengetahui dan memahami proses pembuatan insulin melalui teknik DNA rekombinan. 1.4. Manfaat Mengetahui manfaat dari kemajuan bioteknologi modern di bidang kesehatan khususnya dalam proses pembuatan insulin melalui rekayasa genetika khususnya ditujukan pada penderita diabetes melitus.
BAB II PEMBAHASAN 2.1. Pengertian dan Struktur Insulin Insulin adalah suatu macam protein yang tugasnya mengawali metabolisme gula di dalam tubuh manusia. Insulin dibuat di dalam tubuh manusia dengan dikontrol oleh gen insulin. Insulin ini kemudian diambil dari pulau langerhans tubuh manusia, lalu disambungkan ke dalam plasmid bakteri. Untuk menghubungkan gen insulin dengan plasmid diperlukan rekombinasi genetik. Gen insulin adalah suatu daerah dalam ADN kita yang memiliki informasi untuk menghasilkan insulin . Penderita diabetes tidak mampu membentuk insulin dalam jumlah yang dibutuhkan. Oleh karena itu, penderita diabetes harus menerima suntikan insulin setiap hari (Page, David.S, 1989). Gambar 1. Struktur Insulin Insulin tersusun atas dua rantai protein ialah A dan B. Urutan basa dalam molekul ADN yang mengkode masing-masing rantai itu dibuat dalam tabung. Secara kimia, insulin adalah protein kecil sederhana yang terdiri dari 51 asam amino, 30 di antaranya merupakan satu rantai polipeptida, dan 21 lainnya yang membentuk rantai kedua. Kedua rantai dihubungkan oleh ikatan disulfida. Kode genetik untuk insulin ditemukan dalam DNA di bagian atas lengan pendek dari kromosom kesebelas yang berisi 153 basa nitrogen (63 dalam rantai A dan 90 dalam rantai B). DNA yang membentuk kromosom, terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari rantai nukleotida, masing-masing terdiri dari gula deoksiribosa, fosfat dan nitrogen (Page, David.S., 1989).
2.1. Peran Insulin Insulin merupakan hormon yang diproduksi oleh sel beta di dalam pankreas dan digunakan untuk mengontrol kadar glukosa dalam darah. Sekresi insulin terdiri dari 2 komponen. a. Komponen pertama yaitu: sekresi insulin basal kira-kira 1 unit/jam dan terjadi diantara waktu makan, waktu malam hari dan keadaan puasa. b. Komponen kedua yaitu: sekresi insulin prandial yang menghasilkan kadar insulin 5- 10 kali lebih besar dari kadar insulin basal dan diproduksi secara pulsatif dalam waktu 0,5-1 jam sesudah makan dan mencapai puncak dalam 30-45 menit, kemudian menurun dengan cepat mengikuti penurunan kadar glukosa basal. Kemampuan sekresi insulin prandial berkaitan erat dengan kemampuan ambilan glukosa oleh jaringan perifer. Info kedokteran menuliskan, Insulin berperan dalam penggunaan glukosa oleh sel tubuh untuk pembentukan energi, apabila tidak ada insulin maka sel tidak dapat menggunakan glukosa sehingga proses metabolisme menjadi terganggu. Proses yang terjadi yaitu karbohidrat dimetabolisme oleh tubuh untuk menghasilkan glukosa, glukosa tersebut selanjutnya diabsorbsi di saluran pencernaan menuju ke aliran darah untuk dioksidasi di otot skelet sehingga menghasilkan energi. Glukosa juga disimpan dalam hati dalam bentuk glikogen kemudian diubah dalam jaringan adiposa menjadi lemak dan trigliserida. Insulin memfasilitasi proses tersebut. Insulin akan meningkatkan pengikatan glukosa oleh jaringan, meningkatkan level glikogen dalam hati, mengurangi pemecahan glikogen (glikogenolisis) di hati, meningkatkan sintesis asam lemak, menurunkan pemecahan asam lemak menjadi badan keton, dan membantu penggabungan asam amino menjadi protein. 2.2. Proses Produksi Insulin Oleh Bakteri Para peneliti membuat insulin manusia rekombinan dengan struktur yang identik dengan insulin manusia menggunakan vektor bakteri E. coli yang telah dilemahkan.Produksi Insulin oleh bakteri E.coli ini dapat dilakukan dengan teknik Plasmid.
Gambar 2. Produksi Insulin Escherichia coli, penghuni saluran pencernaan manusia, adalah ‘pabrik’ yang digunakan dalam rekayasa genetika insulin. Ketika bakteri bereproduksi, gen insulin direplikasi bersama dengan plasmid. E. coli seketika memproduksi enzim yang dengan cepat mendegradasi protein asing seperti insulin. Hal tersebut dapat dicegah dengan cara menggunakan E. coli strain mutan yang sedikit mengandung enzim ini dan pada E. Coli juga terdapat B-galaktosidase yakni enzim yang mengontrol transkripsi gen. Menurut brown (1990) kutipan Sardjoko, ada 5 hal dasar yang harus dipahami dan dikuasai untuk melakukan proses pembuatan insulin oleh bakteri, meliputi : 1. Penyiapan sampel DNA kromosom murni 2. Pemotongan molekul DNA 3. Analisa ukuran fragment DNA hasil pemotongan 4. Penggabungan molekul DNA dengan vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan 5. Pengenalan (insersi) DNA ke dalam sel host
Gambar 3. Pembuatan Insulin melalui teknik Dna rekombinan Dalam produksi Insulin oleh bakteri dapat dilakukan dengan Rekayasa Genetika / DNA rekombinan, dan dalam proses ini ada 5 tahap yaitu : 1. Teknik Mengisolasi Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika. Dalam Jurnal Isolasi dan Digersti DNA Komosom (Isolation and Digertion of Chromosomal DNA) dijelaskan bahwa ada 3 langkah dalam pengisolasian bakteri. Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan menumbuhkan sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak ini kemudian dipurifikasi. Langkah kedua teknik isolasi DNA plasmid dengan cara mensentrifuge koloni bakteri dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil dan ditambahkan CIAA (kloroform dan Isoamilalkohol) dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya, adalah melakukan prosedur digesti kromosom, plasmid dan pUC19 dengan EcoRI (Enzim re yang dihasilkan dari bakteri E. coli dari strain R1). Isolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan prosedur isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi (Purwanto,2001). 2. Teknik Memotong DNA Insulin Enzim pemotong dikenal sebagai enzim restriksi atau enzim penggunting yang bernama restriksi endonuklease . Enzim restriksi secara alami diproduksi oleh bakteri. Enzim restriksi bertindak seperti pisau bedah biologi yang berfungsi untuk memotong Dna plasmid, hanya mengenali rangkaian nukleotida tertentu, misal salah satunya rangkaian kode untuk insulin. Hal tersebut memungkinkan peneliti untuk memutuskan pasangan basa nitrogen
tertentu dan menghapus bagian DNA yang berisi kode genetik dari kromosom sebuah organisme sehingga dapat memproduksi insulin. OLD. R.W, (2003) mengatakan bahwa Endonukleus restriksi pada E. coli adalah bagian yang pertama kali dipisahkan. Meselson dan Yuan (1968) dalam buku prinsip-prinsip Manupulasi Gen mengatakan bahwa apabila DNA asing dimasukkan ke dalam suatu inang E.coli, DNA itu mungkin diserang oleh sistem restriksi yang aktif di dalam sel inang. Potongan DNA antara gen manusia dengan benang plasmid ini bisa menyambung karena endonuklease yang digunakan untuk memotong DNA manusia dan benang plasmid tersebut sama jenisnya. Sehingga, dihasilkan ujung-ujung yang sama strukturnya. Gen manusia dan plasmid yang telah menyatu membentuk lingkaran plasmid ini disebut kimera (DNA rekombinan). Gambar 3. Pemotongan DNA manusia dan Benang Plasmid 3. Teknik Penggabungan DNA Insulin Rekombinasi DNA selanjutnya yaitu dilakukan penyambungan DNA, kemudian DNA manusia yang diinginkan disambungkan ke bagian benang plasmid yang terbuka dengan menggunakan enzim ligase DNA yang mengkatalis ikatan fosfodiester antara dua rantai DNA. DNA ligase berperan untuk menggabungkan DNA Plasmid dengan DNA insulin yang telah dipotong tadi. DNA Ligase adalah suatu enzim yang berfungsi sebagai perekat genetik dan pengelas ujung nukleotida. E.coli dan fag T4 mengkode suatu enzim ligase DNA yang menutup takik untai tunggal di antara nukleotida yang berdekatan dalam untai DNA dupleks. Temperatur optimum untuk ligase DNA yang bertakik adalah 370 c. Tetapi pada temperatur ini penggabungan ikatan nitrogen antara ujung-ujung yang lengket tidak stabil (Olivera dkk, 1968)
Gambar 4. Penggabungan DNA 4. Teknik Penyelipan DNA Insulin ke dalam Vektor (plasmid E.Coli) Langkah pertama adalah mensintesis rantai DNA yang membawa sekuens nukleotida spesifik yang sesuai karakteristik rantai polipeptida A dan B dari insulin. Urutan DNA yang diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari kedua rantai telah dipetakan. Antikodon menggabungkan asam amino, metionin, kemudian ditempatkan di setiap awal rantai yang memungkinkan pemindahan protein insulin dari asam amino sel bakteri itu. Gen sintetik rantai A dan B kemudian secara terpisah dimasukkan ke dalam gen untuk enzim bakteri, B-galaktosidase, yang dibawa dalam plasmid 8isulf tersebut. Pada tahap ini, sangat penting untuk memastikan bahwa kodon gen sintetik kompatibel dengan B-galaktosidase. Plasmid rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel E. coli (OLD. R.W,2003). Masing-masing DNA insulin dan plasmid E.Coli dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Kemudian DNA insulin A dan B secara terpisah diselipkan ke dalam plasmid berbeda dengan menggunakan enzim ligase. Gambar 5. Penyelipan DNA Insulin ke dalam plasmid 5. Pemasukan Plasmid Rekombinan ke dalam Sel E.Coli Plasmid yang telah diselipkan DNA insulin (plasmid rekombinan) dicampurkan dalam kultur bakteri E.Coli. Bakteri-bakteri tersebut akan mengambil plasmid rekombinan melalui proses transformasi. Akan tetapi, tidak semua bakteri mengambil plasmid tersebut.Penggunaan
teknologi DNA rekombinan dalam sintesis insulin manusia membutuhkan jutaan salinan plasmid bakteri yang telah digabungkan dengan gen insulin dalam rangka untuk menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan bersama dengan sel mereplikasi galaktosidase-B di dalam sel yang sedang menjalani mitosis (Gumpert &Lehman, 1990). Gambar 5. Perkembangbiakan Bakteri 6. Pengklonan Sel yang Mengandung Plasmid Rekombinan Sel yang mengandung plasmid rekombinan dapat diseleksi dari sel yang tidak mengandung plasmid rekombinan. Medium nutrien bakteri yang digunakan mengandung amphisilin dan X-gal. Sebagaimana telah disebutkan sebelumnya, plasmid yang digunakan sebagai vektor ini mengandung amp-R dan lac-Z sehingga sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan akan tumbuh dalam medium tersebut karena resisten terhadap amphisilin serta akan berwarna putih karena plasmid yang mengandung gen asing (gen insulin manusia) dalam gen lac-Z tidak dapat memproduksi β-galactosidase sehingga tidak dapat menghidrolisis laktosa. Hasil rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel target E. coli. Bakteri ini akan hidup normal dan memiliki tambahan yang sesuai dengan sifat gen yang disisipkan. Bakteri E. coli kemudian di kultur untuk dikembangbiakkan. Gambar 6. Proses pemilihan koloni E. coli tanpa DNA manusia
Gambar 6. DNA Insulin Protein yang terbentuk, sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu rantai insulin A atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen B- galaktosidase dan dimurnikan. Kedua rantai dicampur dan dihubungkan kembali dalam reaksi yang membentuk jembatan silang disulfide, menghasilkan Humulin murni (insulin manusia sintetis). Biakan dari kultur bakteri yang sudah disisipkan DNA insulin manusia berkembang dan memperbanyak sehingga bakteri tersebut kemudian mampu menghasilkan insulin. Bakteri hasil Klon sel yang telah diidentifikasi diproduksi dalam skala besar dengan cara ditumbuhkan dalam tangki yang mengandung medium cair. Tahap-tahapnya secara ringkasan dalam pembuatan insulin adalah sebagai berikut: 1. Kromosom dikeluarkan dari sel-sel pankreas menggunakan zat kimia berupa polietilen glikol atau kalsium klorida (CaCl2). 2. Gen insulin dipotong dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease dan kemudian dimurnikan. 3. Plasmid dikeluarkan dengan cara memecah dinding sel bakteri, menggunakan deterjen atau lisozim, kemudian dilisis dengan natrium hidroksida (NaOH) dan larutan dedosil sulfat. Plasmid dipisahkan dengan cara sentrifugasi. 4. Endapan yang mengandung plasmid dijenuhkan dengan etanol. Plasmid dimurnikan dengan filtrasi gel. Plasmid dipotong dengan enzim restriksi endonuklease. 5. Gen insulin disambungkan pada plasmid menggunakan enzim ligase dan prosesnya disebut ligasi. Suhu optimum untuk ligasi adalah ± 370C, tetapi ikatannya stabil pada suhu 4-150 C. 6. Plasmid rekombinan dimasukkan kembali ke dalam sel bakteri. 7. Koloni sel bakteri ditumbuhkan dalam medium kultur dan kemudian diseleksi koloni sel yang sudah mengandung plasmid rekombinan. 8. Koloni sel-sel bakteri dengan plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam fermentor untuk menghasilkan insulin dalam jumlah yang banyak. 9. Insulin yang terbentuk kemudian dimurnikan.
BAB III PENUTUP 3.1 Kesimpulan 1. Insulin adalah suatu macam protein yang tugasnya mengawali metabolisme gula di dalam tubuh manusia. Insulin dibuat di dalam tubuh manusia dengan dikontrol oleh gen insulin dan insulin Teknologi DNA Rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. 2. Teknik DNA rekombinan meliputi teknik untuk mengisolasi DNA, teknik untuk memotong DNA, teknik untuk menggabung atau menyambung DNA, dan teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup yang melibatkan bakteri E.coli. Teknik Penyelipan DNA Insulin ke dalam Vektor (plasmid E.Coli), Pemasukan Plasmid Rekombinan ke dalam Sel E.Coli, Pengklonan Sel yang Mengandung Plasmid Rekombinan( media biakan) kemudian akan di hasilkan insulin
DAFTAR PUSTAKA Brown, D.J. (1990). Decentralization and school-based management. London : Taylor & Francis (Prenters) Ltd. David S. Evans & Linda S. Leighton, 1989.Why Do Smaller Firms Pay Less. Journal of Human Resources : University of Wisconsin Press, vol. 24(2), pages 299-318. Gumpert, G, Lehman, G, & Drucker, S. 1990. Spots and media community. Chicago : Paper presented at speech communication association convention. Meselson, M., R. Yuan 1968. DNA restriction enzyme from E. coli. Nature 217:1110-1114 Old RW, Primrose SB. 2003. Prinsip-prinsip manipulasi gen pengantar rekayasa genetika. Jakarta: UI press. Jakarta. Indonesia. Oliveira, P.C, Oliveira, C.G, Neri de Sauza, F, and Costa, N (2006) : Teaching Strategis to Promote Active Learning in Higher Education. Current Developments in Technology Assisted Educati on. Purwantara, A. 2001. Principles of DNA Isolation and Manipulation. Workshop on Plant Pathogens Detection: Moleculae Tehniques.

More Related Content

Bioteknologi kesehatan (insulin)

  • 1. BAB I Pendahuluan 1.1. Latar Belakang Pada tahun 1965, insulin manusia telah berhasil disintesis secara kimia. Secara tradisional, insulin untuk pengobatan pada manusia diisolasi dari pankreas sapi atau babi. Walaupun insulin hewan secara umum cukup memuaskan tetapi untuk penggunaan pada manusia dapat menimbulkan masalah yaitu adanya perbedaan kecil dalam asam amino penyusunnya dan menimbulkan efek samping berupa alergi pada beberapa penderita. Seiring perkembangan zaman, pada tahap bioteknologi generasi ke tiga pertengahan tahun 1970-an berkembang pesat pemanfaatan teknologi rekayasa genetika untuk memanipulasi dan memperbaiki sifat organisme sebagai “agen yang berperan penting dalam bioproses”. Kemajuan bioteknologi khususnya bidang kesehatan telah menemukan suatu teknologi berupa sintesis insulin dengan bantuan bakteri yang biasa terdapat di usus besar manusia Escherichia coli, proses ini disebut dengan teknologi plasmid. Teknologi plasmid bertujuan untuk proses mengidentifikasi dan mengisolasi DNA dari suatu sel hidup atau mati dan memasukkannya dalam sel hidup lainnya. Rekayasa genetika merupakan suatu cara memanipulasikan gen untuk menghasilkan makhluk hidup baru dengan sifat yang diinginkan. Rekayasa genetika disebut juga pencangkokan gen atau rekombinasi DNA. Teknologi DNA rekombinan, insulin diproduksi menggunakan sel mikroba yang tidak patogen. Pada proses rekayasa genetika organisme yang sering digunakan adalah bakteri E. coli. Bakteri E. coli dipilih karena paling mudah dipelajari pada taraf molekuler, mudah dikembangbiakan dan waktu reproduksinya cukup cepat. Insulin hasil rekayasa genetika ini mempunyai efek samping yang relatif sangat rendah dibandingkan dengan insulin yang diperoleh dari ekstrak pankreas hewan yang dapat menimbulkan efek samping berupa alergi oleh karena itulah keuntungan dari insulin hasil rekayasa genetik ini adalah insulin tersebut bebas dari protein hewan yang tercemar yang sering menimbulkan alergi. Setelah ditemukan teknik rekayasa genetika insulin di bidang bioteknologi, harga insulin bisa ditekan dengan drastis sehingga dapat membantu para penderita diabetes mellitus. 1.2. Rumusan Masalah 1. Apa yang dimaksud dengan insulin dan teknologi rekayasa genetika? 2. Bagaimana proses pembuatan insulin dengan teknik DNA rekombinan?
  • 2. 1.3. Tujuan • Mengetahui dan memahami pengertian insulin dan rekayasa genetika • Mengetahui dan memahami proses pembuatan insulin melalui teknik DNA rekombinan. 1.4. Manfaat Mengetahui manfaat dari kemajuan bioteknologi modern di bidang kesehatan khususnya dalam proses pembuatan insulin melalui rekayasa genetika khususnya ditujukan pada penderita diabetes melitus.
  • 3. BAB II PEMBAHASAN 2.1. Pengertian dan Struktur Insulin Insulin adalah suatu macam protein yang tugasnya mengawali metabolisme gula di dalam tubuh manusia. Insulin dibuat di dalam tubuh manusia dengan dikontrol oleh gen insulin. Insulin ini kemudian diambil dari pulau langerhans tubuh manusia, lalu disambungkan ke dalam plasmid bakteri. Untuk menghubungkan gen insulin dengan plasmid diperlukan rekombinasi genetik. Gen insulin adalah suatu daerah dalam ADN kita yang memiliki informasi untuk menghasilkan insulin . Penderita diabetes tidak mampu membentuk insulin dalam jumlah yang dibutuhkan. Oleh karena itu, penderita diabetes harus menerima suntikan insulin setiap hari (Page, David.S, 1989). Gambar 1. Struktur Insulin Insulin tersusun atas dua rantai protein ialah A dan B. Urutan basa dalam molekul ADN yang mengkode masing-masing rantai itu dibuat dalam tabung. Secara kimia, insulin adalah protein kecil sederhana yang terdiri dari 51 asam amino, 30 di antaranya merupakan satu rantai polipeptida, dan 21 lainnya yang membentuk rantai kedua. Kedua rantai dihubungkan oleh ikatan disulfida. Kode genetik untuk insulin ditemukan dalam DNA di bagian atas lengan pendek dari kromosom kesebelas yang berisi 153 basa nitrogen (63 dalam rantai A dan 90 dalam rantai B). DNA yang membentuk kromosom, terdiri dari dua heliks terjalin yang dibentuk dari rantai nukleotida, masing-masing terdiri dari gula deoksiribosa, fosfat dan nitrogen (Page, David.S., 1989).
  • 4. 2.1. Peran Insulin Insulin merupakan hormon yang diproduksi oleh sel beta di dalam pankreas dan digunakan untuk mengontrol kadar glukosa dalam darah. Sekresi insulin terdiri dari 2 komponen. a. Komponen pertama yaitu: sekresi insulin basal kira-kira 1 unit/jam dan terjadi diantara waktu makan, waktu malam hari dan keadaan puasa. b. Komponen kedua yaitu: sekresi insulin prandial yang menghasilkan kadar insulin 5- 10 kali lebih besar dari kadar insulin basal dan diproduksi secara pulsatif dalam waktu 0,5-1 jam sesudah makan dan mencapai puncak dalam 30-45 menit, kemudian menurun dengan cepat mengikuti penurunan kadar glukosa basal. Kemampuan sekresi insulin prandial berkaitan erat dengan kemampuan ambilan glukosa oleh jaringan perifer. Info kedokteran menuliskan, Insulin berperan dalam penggunaan glukosa oleh sel tubuh untuk pembentukan energi, apabila tidak ada insulin maka sel tidak dapat menggunakan glukosa sehingga proses metabolisme menjadi terganggu. Proses yang terjadi yaitu karbohidrat dimetabolisme oleh tubuh untuk menghasilkan glukosa, glukosa tersebut selanjutnya diabsorbsi di saluran pencernaan menuju ke aliran darah untuk dioksidasi di otot skelet sehingga menghasilkan energi. Glukosa juga disimpan dalam hati dalam bentuk glikogen kemudian diubah dalam jaringan adiposa menjadi lemak dan trigliserida. Insulin memfasilitasi proses tersebut. Insulin akan meningkatkan pengikatan glukosa oleh jaringan, meningkatkan level glikogen dalam hati, mengurangi pemecahan glikogen (glikogenolisis) di hati, meningkatkan sintesis asam lemak, menurunkan pemecahan asam lemak menjadi badan keton, dan membantu penggabungan asam amino menjadi protein. 2.2. Proses Produksi Insulin Oleh Bakteri Para peneliti membuat insulin manusia rekombinan dengan struktur yang identik dengan insulin manusia menggunakan vektor bakteri E. coli yang telah dilemahkan.Produksi Insulin oleh bakteri E.coli ini dapat dilakukan dengan teknik Plasmid.
  • 5. Gambar 2. Produksi Insulin Escherichia coli, penghuni saluran pencernaan manusia, adalah ‘pabrik’ yang digunakan dalam rekayasa genetika insulin. Ketika bakteri bereproduksi, gen insulin direplikasi bersama dengan plasmid. E. coli seketika memproduksi enzim yang dengan cepat mendegradasi protein asing seperti insulin. Hal tersebut dapat dicegah dengan cara menggunakan E. coli strain mutan yang sedikit mengandung enzim ini dan pada E. Coli juga terdapat B-galaktosidase yakni enzim yang mengontrol transkripsi gen. Menurut brown (1990) kutipan Sardjoko, ada 5 hal dasar yang harus dipahami dan dikuasai untuk melakukan proses pembuatan insulin oleh bakteri, meliputi : 1. Penyiapan sampel DNA kromosom murni 2. Pemotongan molekul DNA 3. Analisa ukuran fragment DNA hasil pemotongan 4. Penggabungan molekul DNA dengan vektor untuk menghasilkan molekul DNA rekombinan 5. Pengenalan (insersi) DNA ke dalam sel host
  • 6. Gambar 3. Pembuatan Insulin melalui teknik Dna rekombinan Dalam produksi Insulin oleh bakteri dapat dilakukan dengan Rekayasa Genetika / DNA rekombinan, dan dalam proses ini ada 5 tahap yaitu : 1. Teknik Mengisolasi Isolasi DNA/RNA merupakan langkah awal yang harus dikerjakan dalam rekayasa genetika. Dalam Jurnal Isolasi dan Digersti DNA Komosom (Isolation and Digertion of Chromosomal DNA) dijelaskan bahwa ada 3 langkah dalam pengisolasian bakteri. Langkah pertama untuk mendapatkan DNA plasmid adalah dengan menumbuhkan sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan. Setelah itu sel dipanen, dinding serta membran sel dipecah sehingga isi sel (ekstrak sel) keluar. Ekstrak ini kemudian dipurifikasi. Langkah kedua teknik isolasi DNA plasmid dengan cara mensentrifuge koloni bakteri dengan kecepatan 12.000 rpm selama 5 menit, kemudian lapisan atas diambil dan ditambahkan CIAA (kloroform dan Isoamilalkohol) dengan perbandingan 1:1. Selanjutnya, adalah melakukan prosedur digesti kromosom, plasmid dan pUC19 dengan EcoRI (Enzim re yang dihasilkan dari bakteri E. coli dari strain R1). Isolasi DNA kromosom ataupun DNA plasmid dapat dilakukan dengan menggunakan prosedur isolasi sel, lisis dinding dan membran sel, ekstraksi dalam larutan, purifikasi, dan presipitasi (Purwanto,2001). 2. Teknik Memotong DNA Insulin Enzim pemotong dikenal sebagai enzim restriksi atau enzim penggunting yang bernama restriksi endonuklease . Enzim restriksi secara alami diproduksi oleh bakteri. Enzim restriksi bertindak seperti pisau bedah biologi yang berfungsi untuk memotong Dna plasmid, hanya mengenali rangkaian nukleotida tertentu, misal salah satunya rangkaian kode untuk insulin. Hal tersebut memungkinkan peneliti untuk memutuskan pasangan basa nitrogen
  • 7. tertentu dan menghapus bagian DNA yang berisi kode genetik dari kromosom sebuah organisme sehingga dapat memproduksi insulin. OLD. R.W, (2003) mengatakan bahwa Endonukleus restriksi pada E. coli adalah bagian yang pertama kali dipisahkan. Meselson dan Yuan (1968) dalam buku prinsip-prinsip Manupulasi Gen mengatakan bahwa apabila DNA asing dimasukkan ke dalam suatu inang E.coli, DNA itu mungkin diserang oleh sistem restriksi yang aktif di dalam sel inang. Potongan DNA antara gen manusia dengan benang plasmid ini bisa menyambung karena endonuklease yang digunakan untuk memotong DNA manusia dan benang plasmid tersebut sama jenisnya. Sehingga, dihasilkan ujung-ujung yang sama strukturnya. Gen manusia dan plasmid yang telah menyatu membentuk lingkaran plasmid ini disebut kimera (DNA rekombinan). Gambar 3. Pemotongan DNA manusia dan Benang Plasmid 3. Teknik Penggabungan DNA Insulin Rekombinasi DNA selanjutnya yaitu dilakukan penyambungan DNA, kemudian DNA manusia yang diinginkan disambungkan ke bagian benang plasmid yang terbuka dengan menggunakan enzim ligase DNA yang mengkatalis ikatan fosfodiester antara dua rantai DNA. DNA ligase berperan untuk menggabungkan DNA Plasmid dengan DNA insulin yang telah dipotong tadi. DNA Ligase adalah suatu enzim yang berfungsi sebagai perekat genetik dan pengelas ujung nukleotida. E.coli dan fag T4 mengkode suatu enzim ligase DNA yang menutup takik untai tunggal di antara nukleotida yang berdekatan dalam untai DNA dupleks. Temperatur optimum untuk ligase DNA yang bertakik adalah 370 c. Tetapi pada temperatur ini penggabungan ikatan nitrogen antara ujung-ujung yang lengket tidak stabil (Olivera dkk, 1968)
  • 8. Gambar 4. Penggabungan DNA 4. Teknik Penyelipan DNA Insulin ke dalam Vektor (plasmid E.Coli) Langkah pertama adalah mensintesis rantai DNA yang membawa sekuens nukleotida spesifik yang sesuai karakteristik rantai polipeptida A dan B dari insulin. Urutan DNA yang diperlukan dapat ditentukan karena komposisi asam amino dari kedua rantai telah dipetakan. Antikodon menggabungkan asam amino, metionin, kemudian ditempatkan di setiap awal rantai yang memungkinkan pemindahan protein insulin dari asam amino sel bakteri itu. Gen sintetik rantai A dan B kemudian secara terpisah dimasukkan ke dalam gen untuk enzim bakteri, B-galaktosidase, yang dibawa dalam plasmid 8isulf tersebut. Pada tahap ini, sangat penting untuk memastikan bahwa kodon gen sintetik kompatibel dengan B-galaktosidase. Plasmid rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel E. coli (OLD. R.W,2003). Masing-masing DNA insulin dan plasmid E.Coli dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Kemudian DNA insulin A dan B secara terpisah diselipkan ke dalam plasmid berbeda dengan menggunakan enzim ligase. Gambar 5. Penyelipan DNA Insulin ke dalam plasmid 5. Pemasukan Plasmid Rekombinan ke dalam Sel E.Coli Plasmid yang telah diselipkan DNA insulin (plasmid rekombinan) dicampurkan dalam kultur bakteri E.Coli. Bakteri-bakteri tersebut akan mengambil plasmid rekombinan melalui proses transformasi. Akan tetapi, tidak semua bakteri mengambil plasmid tersebut.Penggunaan
  • 9. teknologi DNA rekombinan dalam sintesis insulin manusia membutuhkan jutaan salinan plasmid bakteri yang telah digabungkan dengan gen insulin dalam rangka untuk menghasilkan insulin. Gen insulin diekspresikan bersama dengan sel mereplikasi galaktosidase-B di dalam sel yang sedang menjalani mitosis (Gumpert &Lehman, 1990). Gambar 5. Perkembangbiakan Bakteri 6. Pengklonan Sel yang Mengandung Plasmid Rekombinan Sel yang mengandung plasmid rekombinan dapat diseleksi dari sel yang tidak mengandung plasmid rekombinan. Medium nutrien bakteri yang digunakan mengandung amphisilin dan X-gal. Sebagaimana telah disebutkan sebelumnya, plasmid yang digunakan sebagai vektor ini mengandung amp-R dan lac-Z sehingga sel bakteri yang mengandung plasmid rekombinan akan tumbuh dalam medium tersebut karena resisten terhadap amphisilin serta akan berwarna putih karena plasmid yang mengandung gen asing (gen insulin manusia) dalam gen lac-Z tidak dapat memproduksi β-galactosidase sehingga tidak dapat menghidrolisis laktosa. Hasil rekombinan tersebut kemudian dimasukkan ke dalam sel target E. coli. Bakteri ini akan hidup normal dan memiliki tambahan yang sesuai dengan sifat gen yang disisipkan. Bakteri E. coli kemudian di kultur untuk dikembangbiakkan. Gambar 6. Proses pemilihan koloni E. coli tanpa DNA manusia
  • 10. Gambar 6. DNA Insulin Protein yang terbentuk, sebagian terdiri dari B-galaktosidase, bergabung ke salah satu rantai insulin A atau B. Rantai insulin A dan rantai B kemudian diekstraksi dari fragmen B- galaktosidase dan dimurnikan. Kedua rantai dicampur dan dihubungkan kembali dalam reaksi yang membentuk jembatan silang disulfide, menghasilkan Humulin murni (insulin manusia sintetis). Biakan dari kultur bakteri yang sudah disisipkan DNA insulin manusia berkembang dan memperbanyak sehingga bakteri tersebut kemudian mampu menghasilkan insulin. Bakteri hasil Klon sel yang telah diidentifikasi diproduksi dalam skala besar dengan cara ditumbuhkan dalam tangki yang mengandung medium cair. Tahap-tahapnya secara ringkasan dalam pembuatan insulin adalah sebagai berikut: 1. Kromosom dikeluarkan dari sel-sel pankreas menggunakan zat kimia berupa polietilen glikol atau kalsium klorida (CaCl2). 2. Gen insulin dipotong dengan menggunakan enzim restriksi endonuklease dan kemudian dimurnikan. 3. Plasmid dikeluarkan dengan cara memecah dinding sel bakteri, menggunakan deterjen atau lisozim, kemudian dilisis dengan natrium hidroksida (NaOH) dan larutan dedosil sulfat. Plasmid dipisahkan dengan cara sentrifugasi. 4. Endapan yang mengandung plasmid dijenuhkan dengan etanol. Plasmid dimurnikan dengan filtrasi gel. Plasmid dipotong dengan enzim restriksi endonuklease. 5. Gen insulin disambungkan pada plasmid menggunakan enzim ligase dan prosesnya disebut ligasi. Suhu optimum untuk ligasi adalah ± 370C, tetapi ikatannya stabil pada suhu 4-150 C. 6. Plasmid rekombinan dimasukkan kembali ke dalam sel bakteri. 7. Koloni sel bakteri ditumbuhkan dalam medium kultur dan kemudian diseleksi koloni sel yang sudah mengandung plasmid rekombinan. 8. Koloni sel-sel bakteri dengan plasmid rekombinan ditumbuhkan dalam fermentor untuk menghasilkan insulin dalam jumlah yang banyak. 9. Insulin yang terbentuk kemudian dimurnikan.
  • 11. BAB III PENUTUP 3.1 Kesimpulan 1. Insulin adalah suatu macam protein yang tugasnya mengawali metabolisme gula di dalam tubuh manusia. Insulin dibuat di dalam tubuh manusia dengan dikontrol oleh gen insulin dan insulin Teknologi DNA Rekombinan adalah pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan cara penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga memungkinkannya untuk terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam suatu sel organisme lain yang berperan sebagai sel inang. 2. Teknik DNA rekombinan meliputi teknik untuk mengisolasi DNA, teknik untuk memotong DNA, teknik untuk menggabung atau menyambung DNA, dan teknik untuk memasukkan DNA ke dalam sel hidup yang melibatkan bakteri E.coli. Teknik Penyelipan DNA Insulin ke dalam Vektor (plasmid E.Coli), Pemasukan Plasmid Rekombinan ke dalam Sel E.Coli, Pengklonan Sel yang Mengandung Plasmid Rekombinan( media biakan) kemudian akan di hasilkan insulin
  • 12. DAFTAR PUSTAKA Brown, D.J. (1990). Decentralization and school-based management. London : Taylor & Francis (Prenters) Ltd. David S. Evans & Linda S. Leighton, 1989.Why Do Smaller Firms Pay Less. Journal of Human Resources : University of Wisconsin Press, vol. 24(2), pages 299-318. Gumpert, G, Lehman, G, & Drucker, S. 1990. Spots and media community. Chicago : Paper presented at speech communication association convention. Meselson, M., R. Yuan 1968. DNA restriction enzyme from E. coli. Nature 217:1110-1114 Old RW, Primrose SB. 2003. Prinsip-prinsip manipulasi gen pengantar rekayasa genetika. Jakarta: UI press. Jakarta. Indonesia. Oliveira, P.C, Oliveira, C.G, Neri de Sauza, F, and Costa, N (2006) : Teaching Strategis to Promote Active Learning in Higher Education. Current Developments in Technology Assisted Educati on. Purwantara, A. 2001. Principles of DNA Isolation and Manipulation. Workshop on Plant Pathogens Detection: Moleculae Tehniques.