北大有机元素化学雑誌会惭1田口2014
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薬理活性を示すタンパク質のコンピュータを用いた設計 M1 田口純平 有機元素化学研究室の雑誌会は30分プレゼン+全員からの質問、ディスカッションで実施しています。30分という限られた時間で「わかりやすく説明する」ことが要求されます。
![特異度定数 kcat/KMについて
特異度定数 kcat/KM
酵素の反応 E + S ? ES → Pについて
kcat: 反応速度定数 ? = ?cat[??]
KM: ミカエリス定数 (親和性の低さの指標)
? =
?max [S]
?M + [S]
?M ≈
E S
ES
よって
? =
? ???
? ?
? ?
したがって
特異度定数 = 酵素が基質を変換する効率
kcat/KMは酵素や基質の大きさの影響をほぼ受けない](https://image.slidesharecdn.com/2014-150524090817-lva1-app6891/85/M1-2014-36-320.jpg)
北大有机元素化学雑誌会惭1田口2014
- 3. バイオ医薬品の歴史 インスリンの販売 ウシやブタの膵臓から単離 ヒト由来のインスリン販売 大腸菌や酵母により高品質な薬を大量生産 エリスロポエチン (腎性貧血治療) G-CSF (がん化学治療)など 1923年 1982年 1990年代 最近では抗体, DNA, RNAを医薬品としての利用 タンパク質に変異を起こすことによる薬理活性の向上 塩基配列の解読、遺伝子組み換え、 PCR法 インスリン (糖尿病治療薬)
- 4. コンピュータによるタンパク質の振る舞いの予測 QM/MM法 (1970年代 M. Levitt, A. Warshel, M. Karplus) 2種類の計算方法 (ＱＭ計算とMM計算)を組み合わせ、 タンパク質など複雑な系の振る舞いをシミュレーション QM: ＱM計算 ＭＭ計算MM: 量子力学に基づく計算 信頼性の高い結果を与えるが時間かかる 古典力学に基づく計算 計算の精度は落ちるが速い Computer-Aided Drug Design (CADD) コンピュータによる計算で 医薬品候補分子を絞り込む 特にバイオ医薬品の開発での貢献が期待される タミフル
- 5. K. N. Houk, D. Bakerら 計算化学に基づいて人工の酵素を設計 2008年 Retro-Aldol酵素、Kemp脱離酵素 2010年 Diels-Alder酵素 コンピュータによる人工タンパク質の設計 Houk, K. N.; Baker. D. et al. Science 2008, 319, 1387–1391. Houk, K. N.; Baker. D. et al. Nature 2008, 453, 190–195. Houk, K. N.; Baker. D. et al. Science 2010, 329, 309–313. 天然酵素に比べると活性は低い “Diels-Alderase”
- 6. コンピュータによるワクチンの設計 ? コンピュータを用いた全く新しいワクチンの設計法 ? 足場タンパクによりエピトープのコンフォメーションを 固定化 Proof of principle for epitope-focused vaccine design Baker, D. et al. Nature 2014, 507, 201–206. 抗体認識部分 (エピトープ) 足場タンパク ワクチン + 足場タンパクの 構造を最適化
- 7. Backbone graftingによるワクチンの設計 Backbone grafting: 2011年 D. Bakerら エピトープと足場タンパクの組み合わせることでコンフォ メーションを固定化 エピトープと足場タンパクの組み合わせをスクリーニング 設計されたタンパク質は抗体を誘導しない エピトープの構造の更なる精密な再現が必要 Schief, W. R.; Baker, D. Science 2011, 334, 373–376. 比較 ウイルスの一部分 足場タンパクと結合した エピトープ 抗体
- 9. 足場タンパクの最適化 Step 1 足場タンパク エピトープ 変異を起こした足場タンパクとエピトープを結合し、 安定な構造へ折りたたみコンフォメーションを比較する Step 1 低解像度で計算を行った コンフォメーションの近さをRMSDにより評価し、 RMSD < 5 ?ならstep2へ Step 1 低解像度 Step 2 高解像度 RMSD: 理想のコンフォメーションからのずれの指標 エピトープの?炭素の標準偏差 (?)で表現する。 40000通り
- 10. 足場タンパクの最適化 Step 2 足場タンパク エピトープ Step 1 低解像度 Step 2 高解像度 40000通り 変異を起こした足場タンパクとエピトープを結合し、 安定な構造へ折りたたみコンフォメーションを比較する Step 2 より高解像度で計算を行った 表面のアミノ酸は変異を起こさない 溶解性向上 活性中心では疎水性の残基を多く 溶媒の影響低下 8通りのタンパク質がRMSDが1.5~3.0 ?となった
- 11. 8種類のワクチン候補のin vitro評価による絞り込み 溶液中で 様子a 熱安定性 Tm (℃) b 親和性 koff/kon(pM) c 溶液中での 折りたたみd FFL-001 monomer 〇(76) 〇 (29.9) 〇 FFL-002 monomer ×(49) △(469.9) × FFL-003 合成不可能 FFL-004 monomer 〇(>85) × (795.0) × FFL-005 monomer 〇(>100) 〇 (70.3) △ FFL-006 monomer 〇(>85) × (651.9) 〇 FFL-007 monomer 〇(>85) 〇 (94.1) △ FFL-008 合成不可能 aSEC-MALSにより確認。b円偏光により測定。 c表面プラズモン共鳴により測定。 dHSQCスペクトルにより確認。
- 14. コンピュータによるコカイン解毒酵素の設計 ? コンピュータを用いてコカイン解毒酵素を設計 ? 天然の酵素の変異体を約67000通りスクリーニング 触媒活性、選択性を大幅に向上 A highly ef?cient cocaine-detoxifying enzyme obtained by computational design Zhan, C.-G. et al. Nat. Commun. 2014, 5, 3457.
- 15. コカイン中毒に対する治療薬の候補 (-)–コカイン コカイン加水分解酵素 エクゴニン メチルエステル 安息香酸 + Madden, J.; Powers, R. Life Sci. 1990, 47, 1109–1114. 高効率なコカイン加水分解酵素はコカイン中毒の治療薬 として有望な候補 向精神作用、依存性 多量摂取による呼吸困難 生体内で不活性 現在、コカイン乱用や中毒に対する認可治療薬はない
- 16. BChEの変異によるコカイン加水分解酵素の設計 2002年 S. Brimijoinら 分子動力学計算によりBChEとコカイン の複合体の構造を計算 その構造を元に2残基を変異させる 活性が10倍に!! Sun, H.; Pang, Y.-P.; Lockridge, O.; Brimijoin, S. Mol. Pharmacol. 2002, 62, 220–224. BChE (ブチリルコリンエステラーゼ) コリンエステル類に加え、コカインも加水分解 事前の服用によりコカインの毒性を抑制する 作用が知られている しかし薬理活性は低く、医薬品としては不十分
- 17. 著者のこれまでのアプローチ 予測される遷移状態 触媒の活性は水素結合の強さと相関がある 2005年 C.-G. Zhanら アミノ酸残基とコカインのカルボニル酸素間の水素結合の 強さの総計 (????)を大きくする 約70000通りの変異体を検討 活性が500倍に!! Zhan, C.-G. et al., Proc. Acad. Sci. USA 2005, 67, 16656–16661.
- 18. スクリーニングするライブラリの設定 初期値 ヒトBChEタンパク質の以下の変異体 Ala199Ser/Ser287Gly/Ala328Trp/Tyr332Gly 初めの座標はX線結晶構造解析に基づくコンフォメーション 計算条件: AMBER9 活性中心の20?以内において1~3個程度の変異を起こす 約67000種類の変異体をスクリーニング ?HBE ∝ 1 R ? 9 ??: H ? O間距離 ? E30-6タンパク質が最も良い結果を与えた Ala199Ser/Phe227Ala/Pro285Ala/Ser287Gly/Ala328Trp/Tyr332Gly 経験式
- 19. QM/MM法による反応機構の確認 Hisからエステル結合の 酸素へプロトン移動 結合の開裂 Serからの求核攻撃 SerからHisへプロトン移動 QM/MM (B3LYP/6-31G*:AMBER)で構造最適化、MP2/6-31+G*:AMBERでエネルギー計算 球棒モデル部分をQM, それ以外をMMで計算、緑: C, 赤: O, 青: N, 白: H, 距離は? シミュレーションの初期条件は妥当であった acylation deacylation 中間体1 中間体2 中間体3 律速段階 律速であるアシル化段階についてQM/MM計算を行った
- 20. コカイン加水分解活性のin vitro評価 E30-6は高活性かつ高い選択性でコカインを加水分解する 酵素 基質 ミカエリス定数 KM (?M) 反応速度定数 kcat (min-1) 特異度定数 kcat/KM(min-1 M-1) E30-6 (-)-cocaine 3.7 14,600 4.0×109 E30-6 Ach 6.2 14,100 1.6×108 BChE (-)-cocaine 4.5 4 9.1×105 AChE AChE 90.0 702,000 7.8×109 Brimijoin, S. et al. Mol. Pharmacol. 2002, 62, 220–224. アセチルコリン(神経伝達物質)を加水分解 触媒活性が非常に高く、基質拡散が律速 アセチルコリンエステラーゼ (AChE) (Ach: アセチルコリン、特異度定数kcat/KM: 酵素が基質を変換する効率の指標)
- 21. マウスに対するコカイン解毒作用のin vivo評価 酵素投与の1分後に 致死量のコカイン投与 少ない服用量で高い薬理活性 酵素 (3 mg kg-1)投与の1日後に 致死量のコカイン投与 高い薬理活性が保たれている 0 20 40 60 80 100 0.00 0.10 0.15 致死性(%) 投与量(mg kg-1) 0 20 40 60 80 100 24 h 48 h 72 h 致死性(%) コカイン投与までの時間 コカイン乱用者に対する治療薬としての可能性 (6匹のマウスに対し、E30-6を静脈注射により投与した後、(-)-コカイン180 mg kg-1を腹腔内投与)
- 23. アミノ酸一覧
- 24. ELISA法 医学生物学研究所HP: http://ivd.mbl.co.jp/measurement/index.html ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 微量なタンパク質を高い特異性で定量する方法。 抗体を固定した定量したい抗原と標識された抗原を加え、 吸着された標識の応答から抗原を定量する。
- 25. 2002年 S. Brimijoinらの試み Tyr332の立体障害 ＆ ? ? ?相互作用により回転できない 立体障害がなくなり、Trp328によりカチオン-?相互作用 kcat/KMが4.6×105から8.6×106へ向上 Tyr332→Ala332 Ala328→Trp328 LINK, EDIT, PARM, and SANDER module of AMBER 5.0. Sun, H.; Pang, Y.-P.; Lockridge, O.; Brimijoin, S. Mol. Pharmacol. 2002, 62, 220–224.
- 27. スクリーニングするライブラリの構築 著者曰く 注意深いライブラリを構築することによりvirtualには可能 性のある変異体のすべてを検討した とコメント A199S / S287G/A328W/Y332G からスクリーニングを開 始 A199Sは水素結合部位を増やす働き A328W/Y332Gは2002年にS. Brimijoinらが分子動力学か ら行った変異と類似(実際はA328W/Y332A) コカインの結合部位から20 ?以内の残基に1~3つの変異 →合計5~8つの残基に変異
- 28. BChE以外からのコカイン解毒酵素開発アプローチ ?微生物由来の酵素 2000年 Breslerら Rhodococcus sp. (コカノキに生息するバクテリア)の酵素 コカインを唯一の炭素源、エネルギー源として用いる 体内での半減期が15分と短い 人由来でない酵素は免疫作用により分解、抗体の生成 ?コカインに対する抗体 2005年 Carreraら BChEのよりkcatが10倍、親和性Kmが5倍の抗体を報告 抗体が触媒的に作用しない 1990年代から取り組まれているがどの報告も 天然のBChEより薬理活性が低い Brimijoin, S. et al. Neuropsychopharmacology 2008, 33, 2715–2725.
- 29. コカインの代謝生成物の動脈収縮効果の比較 benzoylecgonine ecgonine methyl ester ecgonine norcocaine cocaine コカイン代謝物の濃度 (M) 動脈の直径変化(%) エクゴニンメチルエステル が最も毒性が低い
- 30. 計算結果と反応速度の相関関係 0 20 40 60 80 100 6.8 7.0 7.2 7.4 相対反応速度 水素結合の強さ Σ(1/R)^9 / 10^3 ?HBE ∝ 1 R ? 9 ? と反応速度には相関が見られた。 (r = 0.786) 直線関係からのずれる主な原因はSer-His-Asp の 並びが直線的でなくなるから？
- 34. D. Bakerらによる人工酵素の設計 Kemp elimination 炭素からのプロトン移動のモデル反応 高い活性障壁を有することが知られている。 ソフトウェア Retro-Aldol反応 kcat/KM = 45 min-1 M-1, TON > 20 Kemp elimination反応 kcat/KM = 1.6×105 min-1 M-1, TON > 1000 Diels-Alder反応TON kcat/KM = 27 min-1 M-1, TON = 30 stereoselective, bimolecular
- 36. 特異度定数 kcat/KMについて 特異度定数 kcat/KM 酵素の反応 E + S ? ES → Pについて kcat: 反応速度定数 ? = ?cat[??] KM: ミカエリス定数 (親和性の低さの指標) ? = ?max [S] ?M + [S] ?M ≈ E S ES よって ? = ? ??? ? ? ? ? したがって 特異度定数 = 酵素が基質を変換する効率 kcat/KMは酵素や基質の大きさの影響をほぼ受けない