22hr
- 1. Improved Medical Education in Basic Sciences for Better Medical Practicing ImproveMEd Sistemska biologija za medicinu II. Eksperimentalne metode i skupovi velikih podataka
- 2. Eksperimenti u sistemskoj biologiji ne moraju biti omiki razmjeri kako bi zadovoljili kriterije biologije sustava! Razmotrite eksperimente usmjerene na podsustave kao 邸to su npr. praenje mRNA energetskog metabolizma pod razliitim re転imom hranjenja, ili u vi邸e vremenskih toaka od poetka hranjenja. Koja se biologija sustava razlikuje od uobiajenih znanstvenih istra転ivanja: 1. Kvantitativni podaci - gdje, koliko i koliko brzo (dinamiki, ovisnost o vremenu) e se entitet promijeniti 2. Raunalni modeli - simulacije temeljene na preciznoj kvantifikaciji i vremenu Jo邸 uvijek su potrebne pozitivne i negativne kontrole i najmanje 3 ponavljanja! 2. Hipoteze pokrenute studije koje prate ciljani podskup molekula (ili ciljanih organela) - biologija sustava malih razmjera. 1. Hypothesis generating studies!
- 3. molekule: DNAs tehnologije s mikroraunalima i sekvenciranjem RNAs mRNA sequencing proteini Proteomika na bazi masene spektrometrije lipidi tekuinska kromatografija i masena spektrometrija metaboliti tekuinska kromatografija Masena spektrometrija
- 4. Prosjene populacijske tehnike Populacija stanica ili uzorak tkiva 1 milijun stanica ili vi邸e Prosjeno u mnogim stanicama Tehnike pojedinanih stanica Jedan uzorak stanica Varijabilnost stanica-stanica HepaRG stabilna stanina linijaTkivo jetre Sferoidi hepatocita
- 5. Mikropostrojima - diferencijalni izraz Dominantna tehnika 2000-ih Uglavnom se koristi za mjerenje razine transkripta Druge namjene: genotipizacija, DNA mapiranje (variranje broja kopija), metilacija DNA Microarray se sastoji od mjesta otisnutih razliitim oligonukleotidom Hibridizacija izmeu fluorescentno obilje転enog uzorka (probe) i tiskanih oligonukleotida GEO baza podataka https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/qqtutorial.ht ml
- 6. Array CGH usporedna genomska hibridizacija molekularna citogenetska metoda / kariotipizacija CNV relativan za ispitni uzorak Na temelju pretpostavke da se 2 uzorka blisko povezanih osoba razlikuju (zdravi i bolesni) u dobitku ili gubitku kromosoma ili kromosomske regije Analiza velikog opsega tumor-specifinih DNK neuravnote転enih pregrada s rezolucijom od 5-10 megabaza OMIM baza podataka https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim
- 7. Microarrays analiza metilacije - epigenome Epigenetska regulacija ekspresije gena va転na u razvoju, genetski otisak, tumorogeneza ... Razina metilacije u genomu CpG na 30 000 do 500 000 CpG lokusa pokriva cijeli genom Prvi korak je bisulfitna konverzija uzoraka - nemetilirana mjesta pretvaraju C u U, dok metilirani gubitak metilacije Pretvorena DNA se dalje pojaava (i U se razmjenjuje za T) Fragmentirani i denaturirani oligonukleotidi su hibridizirani s dvije vrste alel specifinih zrnaca za svako mjesto Konani nukleotid aniliranog alel specifinog oligonukleotida se dalje pro邸iruje obilje転enim dDNT Softver izraunava relativnu fluorescenciju svakog lokusa i razreda kao 0, 0,5 ili 1 (homozigotni nemetilirani, heterozigotni ili homozigotni metilirani) ENCODE https://genome.ucsc.edu/encode/dataMatrix/encodeChipMatrixHuman.html
- 8. Tehnologije utemeljene na sekvenciranju Poinje s izolacijom DNA ili RNA nakon ega slijedi ili DNA fragmentacija ili sinteza cDNA Sljedei korak je amplifikacija (fragmenti klonova u vektor, transformiranje bakterija s vektorima i amplifikacija) Paralelno sekvenciranje mnogih kratkih dijelova DNA Sastavljanje susjednih fragmenata
- 9. Whole-genome sequencing (WGS) vs. whole-exome sequencing (WES) WGS poku邸ava slijediti cijeli genom. Neke sekvence su tehniki izazovne za sekvencu (telomere, centromeres, visoki CG sadr転aj ili ponavljajui lokusi) i propustile su ih uobiajene platforme za sekvenciranje 邸to rezultira 95-98% pokrivenosti genoma, ali na uniformiran nain. WES slijed samo eksome (kodirajue sekvence) ili 2% genoma, pomou svakog egzoma je sekvenca 30-100x (visoka dubina). DNA-RNA hibridizacija koristi se za odabir kodirajuih regija 邸to uzrokuje prekomjernu zastupljenost takozvanih "vruih toaka" i nedovoljnu reprezentaciju propu邸tenih varijanti. Br転a, sitnija i jednostavnija analiza podataka, ali niska ukupna pokrivenost. uniform bias
- 10. Sekvenciranje exomea koristi korak obogaivanja za odabir ciljane DNA Mendelski poremeaji esto naru邸avaju regije koje kodiraju proteine Exom je dobar izvor varijanti rijetkih bolesti Mikroarije se mogu koristiti za izolaciju fragmenta WES daje visoku dubinu sekvenciranja Bamshat i sur. (2011) Pregled prirode Genetika
- 11. Tro邸ak po genomu je pobijedio u utrci, a WGS postaje po転eljna metoda, posebno za pregradnje specifine za tumor Evolucija metoda sekvenciranja Prva generacija Sanger sekvenci; tehnologija zavr邸etka lanca - ddNTPs koji se koriste za prekidanje sinteze lanca dalje odvojene kapilarnom elektroforezom (jedna traka u isto vrijeme, spora, tona, skupa) Drugi (sljedei) niz sekvenciranja - sekvenciranje sintezom - uvoenje nano- tehnologije - paralelno sekvenciranje i nema potrebe za korak razdvajanja - granice u du転ini itanja Sekvenciranje tree generacije - imobilizirana polimeraza + fluorescentna dNTP + izvrsna optika - detekcija ugradnje baze i modifikacija baze
- 12. Podaci koji dolaze iz WGS-a ili WES- a zahtijevaju provjeru preko velike populacije! (vi邸e od 1000 pojedinaca) Baza podataka o genotipovima i fenotipovima (dbGaP) https://www.ncbi.nlm.nih.gov/gap Studije udru転ivanja u genomu Foo et al. (2012) Nature Review Neurology
- 13. TranskriptomRNA-Seq Paralelno sekvenciranje mRNA, rRNA, miRNA ... Profil ekspresije gena Kvantitativna metoda idealna za eksperimente biologije sustava Identifikacija alternativnih varijanti spajanja i nove varijante transkripta GEO baza podataka https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/qqtutorial.htm l Ciljne baze podataka skeniranja (miRNA) http://www.targetscan.org/vert_71/ Wang et al.(2009) Nature Reviews Genetics
- 14. RNA-seq postaje dominantna metoda transkriptoma i zamjenjuje mikromre転e Wang et al.(2009) Nature Reviews Genetics
- 15. ChIP-seq kromatinsko imunoprecipitacijsko sekvenciranje Kombinira talo転enje transkripcijskih faktora ili drugih DNA vezujuih proteina (koristei specifina antitijela) ili histonske modifikacije i duboko sekvenciranje ko- imunoprecipitirane DNA Otkriva regulatorne sekvence, promotore, pojaivae, prigu邸ivae, razmaknice Funkcionalna organizacija genoma
- 16. Western blot je prva metoda prema kvantifikaciji i identifikaciji vi邸e od jednog proteina Polu-kvantitativna zbog nelinearne kinetike iza enzimskog obilje転avanja sekundarnih antitijela i reakcije supstrata Takoer ima nelinearnu kinetiku u sluaju kemiluminescentne reakcije ili ekspozicije X- zraka LICOR je infracrvena fluorescencija koja daje malo pozadine i fluorescentni signal je linearno proporcionalan koliini antitijela https://www.licor.com/bio/applications/quan titative_western_blots/
- 17. Napredna i obrnuta fazna proteinska matrica (FPPA i RPPA) Poku邸aj transformacije Western blot metoda niske propusnosti (8-16 traka za uzorke) u metodu visokog protoka U verziji s prednje strane jedan se antibiotik nalazi na slajdovima, a uzorci griva su ispitani na prisutnost epitopa U obrnutoj verziji, mnoga antitijela (s visokom specifino邸u) su uoena na slajdu i jedan uzorak je ispitan za sva antitijela. Zahtijeva antitijela visoke specifinosti, skupa.
- 18. Masovna spektrometrija proteomics, lipidomics, metabolomics Proteomika esto koristi tandemsku masenu spektrometriju (dvije masovne specifikacije izvedene paralelno) Kvantitativno zato 邸to mjeri ukupnu razinu proteina Daje pojedinosti o post-translacijskim modifikacijama Ako se kombinira s imunoprecipitacijom daje informacije o interakcijama proteina Ukljuuje mnoge korake: odvajanje, probavu, obogaivanje, ponavljanje razdvajanja, ionizaciju, filtriranje mase (MS1), analizu fragmentacije i mase (MS2), identifikaciju, kvantifikaciju Mnoge varijacije
- 19. Masovna spektrometrija proteomics, lipidomics, metabolomics Zavr邸ni korak temelji se na velikoj bazi podataka poznatih peptida i bioinformatskih potraga za 邸ibicama. Za lipidomiku i metabolomiku koriste se razliite verzije MS i razliite baze podataka. UniProtKB baza podataka https://web.expasy.org/docs/swiss- prot_guideline.html
- 20. Analiza proteomike dekodira razlike izmeu MAPK puta u normalnoj i tumorskoj stanici. Choudhary & Mann (2010) Nature Reviews Molecular and Cell Biology
- 21. proteomics, lipidomics, metabolomics Zavr邸ni korak temelji se na velikoj bazi podataka poznatih peptida i bioinformatskih potraga za 邸ibicama. Za lipidomiku i metabolomiku koriste se razliite verzije MS i razliite baze podataka. UniProtKB database https://web.expasy.org/docs/swiss- prot_guideline.html
- 22. Tekua kromatografija (LC) i LC / MS lipidomics, metabolomics Palermo et al. (2017) Analytica Chimica Acta Vrlo esto se LC & MS kombiniraju i koriste u slijedu. Takoer, lipidomska i metabolomika mogu se vr邸iti u nizu na istim uzorcima. LC se koristi za dijeljenje uzorka u frakcijama, kao tehnika razdvajanja, dok se MS koristi za identifikaciju molekula.
- 23. Eksperimenti biologije sustava prikupljaju velike podatke koristei metode visoke propusnosti : DNAs Tehnologije temeljene na mikroipovima i sekvenciranju (NGS) exome / genome DNA + regulatory proteins ChIP-seq ReMap RNAs RNA-seq transcriptome Proteins MS proteome Lipids LC/MS lipidom Metabolites LC/MS metabolom