ݺߣ

ݺߣShare a Scribd company logo

Получение радионуклидов и РФП для ПЭТ. РФП на основе F–18. Лекция 3, Красикова Р.Н.

•
•
A
Alex_Zadorin
1 of 48
Downloaded 92 times
Получение радионуклидов и радиофармпрепаратов для позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ) Р.Н. Красикова Зав. лаб. радиохимии ФГБУН Институт мозга человека им. Н.П. Бехтеревой РАН Доцент каф. радиохимии химического факультета СПбГУ Курс лекций в рамках подготовки ПЭТ радиохимиков МГУ май 2013 г. 1
Лекция РФП для позитронной эмиссионной томографии. Особенности синтеза РФП для ПЭТ. РФП на основе фтора-18; влияние введения фтора-18 в структуру молекул на биохимическое поведение (концепция блокированного метаболизма). Нуклеофильные и электрофильные методы введения фтора-18 в структуры молекул. Удельная мольная активность РФП в зависимости от метода синтеза. Хроматографические экспресс методы очистки РФП для ПЭТ. 2
Ядерно-физические характеристики основных ПЭТ радионуклидов (более 90% всех ПЭТ исследований) Изотоп T1/2, мин Т р а с и п +, Макс. п а д а % , э н е М р г э и В я , М п м а р о ы С 13 N 15 О 18 F 20,4 9,96 2,04 109,7 + + + +(97), (EC 3) 0,96 1,19 1,74 0,635 с б . е ш м 11 к ц М г а , а а , к с к . т К м и и о в / л н м ь о о с л н т а ь я , ь м 4.1 5.4 8,2 2,39 9,22*109 1,89*1010 9,0*1010 1,71*109 Наиболее широко применяются РФП на основе фтора-18 3
Радионуклид фтор-18 • • 1937 - впервые получен в циклотроне; A.H. Snell: Phys. Rev. 51, 143; 1940 - Изучена адсорбция в костях; J.F. Volker, H.C. Hodge, H.J. Wilkson, J.Biol. Chem. 134, 543. С 70-х годов 20 века фтор-18 интенсивно используется в ПЭТ исследованиях T1/2 110 мин 96.9% + Emax 0.635 МэВ 4
Преимущества фтора-18 удобный способ получения больших активностей водной мишени циклотрона EMAX 0.635 МэВ 18F-фторида в идеально подходит для ПЭТ исследований Пробег позитронов 2.4 мм T1/2 110 мин высокое разрешение ПЭТ изображения возможность проводить сложные синтезы начиная с 20 Ки 18F высокая удельная активность доставкаРФП в клиники, не имеющие циклотрона 5
Влияет ли введение фтора-18 в состав молекулы на ее биологическую активность? vdW радиус [Å]:1.35 (водород: 1.20) • замена водорода или гидроксила на 18F приводит к минимальным структурным изменениям исходной молекулы; • высокая реакционная способность фтора-18 позволяет получать широкий спектр радиотрейсеров, принадлежащих к разным классам соединений; • получение «истинных» аналогов возможно при введении фтора-18 в структуру фторсодержащих лекарственных средств (18F-флюмазенил и др.) Метаболизм меченых фтором-18 молекул блокируется на ранних стадиях 6
Методы получения фтора-18 (T1/2 109.7 мин) Ядерная реакция Облучаемый материал Химическая форма Носитель 18O(p,n)18F H218O 18F-фторид No F2 18F 2 Yes + F2 18F 2 Yes 18O(p,n)18F 18O + 2 (0.5-1%) 20Ne(d,α)18F 20Ne (0.5-1%) Наиболее широко применяется метод получения фтора-18 в водной мишени циклотрона; полученный в виде 18F-фторида он используется в реакциях нуклеофильного замещения 7
Удельная мольная активность (Specific radioactivity - SRA) высокая удельная активность необходима для рецепторных исследований и при использовании потенциально токсичных соединений 8
Удельная мольная активность (Specific radioactivity - SRA) высокая удельная активность необходима для рецепторных исследований и при использовании потенциально токсичных соединений 9
Методы введения фтора-18 в молекулы [18F]F- SNAr SN2 без носителя Прямое введение метки Нуклеофильный через синтоны 18F(Ar)X 18F(CH ПЭТ трейсер 2)X через [18F]AсOF синтоны с носителем SEAr [18F]F2 Электрофильный [18F]F2 ПЭТ трейсер Прямое введение метки 10
Выделение [18F]фторида из облученной воды для реакций нуклеофильного фторирования 18O(p,n)18F 1. Дистилляция с последующим удалением следов воды азеотропной отгонкой с ацетонитрилом (в присутствии основания) 2. Сорбция на анионообменной смоле 3. Электрохимическое выделение • объем мишени 1- 2.5 мл; • облученная вода током гелия доставляется на вход модуля синтеза 11
Активация фтора-18 для участия в реакциях нуклеофильного замещения Комплекс с криптофиксом (К222) применяется благодаря хорошей растворимости и слабому образованию ионных пар с 18F- Coenen. et al, 1989 Kilbourn et al, 1990 Другие агенты для активации фтора-18: Сильно гидратированный фторид-ион с малой реакционной способностью Комплекс с К222 хорошо растворим в органических растворителях; высокая реакционная способность Rb2CO3 K2CO3 TBAOH 18F без сольватной оболочки часто называют «naked fluoride» 12
Реакции нуклеофильного замещения с участием [18F]фторида: получение активированного комплекса 18O(p,n)18F в 1-3 мл H2O • Адсорбция на картридже QMA или PHCO3 Coenen. et al, 1989 Kilbourn et al, 1990 18F- Элюирование с картриджа K222 и K2CO3 в смеси MeCN:H2O 96:4 Удаление растворителей в токе азота или вакууме при нагреве [K/K222]+18F- [K/K2.2.2]+18F13
Введение метки методом прямого нуклеофильного радиофторирования: стадии процесса • получение 18F-фторид-иона в водной мишени циклотрона • сорбция 18F фторида на смоле QMA и элюирование • получение высокореакционного комплекса 18F с криптофиксом или ТБАК (удаление растворителя досуха) • фторирование (алифатическое или ароматическое) • гидролиз/снятие защиты • очистка (твердофазная экстракция или ВЭЖХ) • нейтрализация (pH 5-7) • стерильное фильтрование (on-line) 14
Алифатическое нуклеофильное фторирование • введение метки путем замещения «уходящей» группы 18Fфторидом в составе активированного комплекса; • «уходящая» группа (LG - Leaving Group); • SN2-механизм: инверсия Вальдена (обращение конфигурации); • необходим строгий контроль щелочности среды, чтобы избежать реакций элиминирования; • реакции в апротонных растворителях в отстутствие воды (ацетонитрил, ДМСО); • протекают с высоким выходом при температурах 80-100оС Большинство РФП для рутинных клинических ПЭТ исследований получают именно реакцией алифатического замещения уходящей группы 18F-фторидом 15
Алифатическое нуклеофильное фторирование: Синтез 18F-FMISO - гипоксического агента для диагностики опухолей • «уходящая группа» - тозил (Ts); • реакция в ацетонитриле или ДМСО; • выход около 40%; 16
Алифатическое нуклеофильное фторирование: различные «уходящие» группы 17
Алифатическое нуклеофильное фторирование: реакционная способность «уходящих» групп Синтез 18F-фторалкил МК801 18
Первый синтез 2-[18F]-2-дезокси-D-глюкозы ([18F]ФДГ) Впервые [18F]ФДГ была получена в середине 1970-х в Брукхейвенской национальной лаборатории, США . Синтез проводили реакцией электрофильного радиофторирования с использованием меченного ацетилгипофторида, тогда как радионуклид был получен в результате ядерной реакции 20Ne(d, α)18F, протекающей при облучении газовой мишени. В реакции с 3,4,6-три-О-ацетил-Dглюкалью был получен [18F]3,4,6-три-О-ацетил-2-дезокси-2-фтор-Dглюкопиранозил фторид, гидролиз которого в кислых условиях приводил к образованию [18F]ФДГ. Радиохимический выход реакции составил >96%. Но, несмотря на подтвержденное уже в первых экспериментах высокое накопление в опухолевых тканях, в то время радиотрейсер не нашел широкого применения из-за очень сложного и трудоемкового метода синтеза, который выполнялся практически вручную на обычном химическом оборудовании из стекла. OH OH O HO HO 1) [18F]CH3COOF, H2O 2) HCl O HO OH HO 18 F 19
Cтереоспецифический нуклеофильный синтез [18F]ФДГ Hamacher et al. 1986 Fuchtner et al. 1996 OH AcO O OTf AcO H AcO 1) [18F]KF/K2.2.2 or [18F]TBAF AcN, 80oC HO 2) OH- or H+ H HO O H H 18 H H H OAc F H OH • Прямое введение метки в молекулу алифатического субстрата (трифлата маннозы) с высоким и стабильным выходом на стадии радиофторирования (до 90%) • Щелочной гидролиз on-line на одноразовом картридже С18 SepPak • Очистка на картриджах, без применения ВЭЖХ • Высокая степень автоматизации в современных модулях 20
Cтереоспецифический нуклеофильный синтез [18F]ФДГ Hamacher et al. 1986 В 1986 году немецкими учеными был предложен наиболее оптимальный метод синтеза [18F]ФДГ [21], который был основан на более ранних работах по методам введения фтора-18 в алифатические субстраты реакцией нуклеофильного замещения «уходящей» группы в присутствии межфазных катализаторов [20]. В синтезе [18F]ФДГ было предложено использовать реакцию нуклеофильного замещения фторид-ионом трифлатной «уходящей» группы в молекуле 1,3,4,6тетра-О-ацетил-2-О-трифторметансульфонил-β-D-маннопиранозы, аналога маннопиранозы с «защищенными» гидроксильными группами. Реакция протекает стереоспецифично с инверсией Вальдена. Радионуклид в форме фторид-иона получают по ядерной реакции 18О(p,n)18F в мишени циклотрона, заполненной водой, обогащенной кислородом-18. Переход [18F]F- из водной фазы в органическую фазу достигается путем добавления межфазного катализатора (МФК) – криптофикса 2.2.2, противоионом служит ион калия в составе карбоната. Наличие следов воды является критичным на данной стадии, комплекс криптофикса с [18F]фторид-ионом подвергается дополнительной осушке путем последовательного добавления и упаривания небольших порций ацетонитрила, образующего азеотропную смесь с водой. Полученный реакционноспособный комплекс [K/K2.2.2]+I8F- и является фторирующим агентом, участвующим в реакции замещения трифлатной группы в молекуле трифлата маннозы Реакция также крайне чувствительна к следам кислот, поэтому для приготовления раствора трифлата маннозы в ацетонитриле нужно использовать безкислотный 21 растворитель с очень низким содержанием воды.
Cтереоспецифический нуклеофильный синтез [18F]ФДГ Hamacher et al. 1986 Гидролиз: по окончании реакции фторирования и удаления растворителя проводят кислотный гидролиз полученного промежуточного продукта 2-[18F]фтор-1,3,4,6-тетра-О-ацетил-Dглюкозы при 120-130°С, в результате чего происходит удаление защитных ацетильных групп с образованием [18F]ФДГ. Этот метод, часто называемый методом Хамахера, положен в основу технологии синтеза [18F]ФДГ во всех современных автоматизированных модулях синтеза. Предложенная позднее замена кислотного гидролиза 18Fфторированного интермедиата на щелочной [Fuchtner et al.], который протекает легко при комнатной температуре, позволила сократить время синтеза и существенно увеличить выход продукта. Важным преимуществом варианта щелочного гидролиза является возможность проведения реакции на одноразовом картридже C18 или tC18 Sep-Pak (Waters) или аналогичных в режиме on-line, что и было использовано в кассетных вариантах модулей синтеза. 22
Стереоспецифический нуклеофильный синтез 2-18F-фтор-2-дезокси-D-глюкозы, [18F]ФДГ H OAc H OAc [18F]KF/K22 2 OTf O AcO AcO H H H O MeCN; 900C OAc AcO AcO H H H H OAc 18 F H 0,3M NaOH H OH 400C H O HO HO H OH 18 H [18F]ФДГ F H Основная радиохимическая примесь [18F]фторид (не более 5%) 23
Основные этапы синтеза [18F]ФДГ • получение 18F-фторид-иона в водной мишени циклотрона • сорбция 18F фторида на смоле QMA и элюирование • получение высокореакционного комплекса 18F с криптофиксом или ТБАК (удаление растворителя досуха) • фторирование (алифатическое) • щелочной гидролиз/снятие защиты на картридже С18 • очистка (твердофазная экстракция) • смыв буфером (цитратный буфер) • стерильное фильтрование (on-line) 24
Особенности синтеза и анализа РФП для ПЭТ - малый период полураспада основного ПЭТ радионуклида – фтора-18 (110 мин) требует использования экспресс методов синтеза и анализа; - анализ препарата нужно проводить до введения пациенту - метод радиоТСХ с детектором радиоактивности отвечает этим требованиям ТСХ – тонкослойная хроматография Радио ТСХ сканнер фирмы raytest, Germany (установлен в ИМЧ РАН) 25
ray test Isotopenmeßgeräte GmbH file: FDG0305 method: F date: 03.05.07 time: 12:14:12 • Метод ТСХ рекомендован для анализа [18F]ФДГ Американской и Европейской фармакопеей [18F]ФДГ FDG 300.0 200.0 100.0 Fluoride • Определение примеси [18F]фторида стандартными методами обращеннофазовой ВЭЖХ затруднительно ввиду сорбции фторида на колонке; origin: 0.0 mm solvent front: 99.9 mm 400.0 Cnts Анализ радиохимической чистоты [18F]ФДГ методом радиоТСХ c ount time: 200 s s moothing constant: 2.0 mm HV : 850 V LL: 300 keV UL: 1000 k eV 0.0 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 mm raytest Isotopenmeßgeräte GmbH file: FDG0305 method: F date: 03.05.07 time: 12:14:12 count time: 200 s smoothing constant: 2.0 mm HV: 850 V LL: 300 keV UL: 1000 keV origin: 0.0 mm solvent front: 99.9 mm No Name Max.Pos Pos mm rf_center rf_max mm-mm %s % 1 Fluoride 9.5 5.0-15.0 0.10 0.10 4.22 2 FDG 48.2 38.0-62.0 0.50 0.48 95.78 Total 129.13 Sum 29.13 в ИМЧ РАН, Ст-Петербург 100.00 Rem Анализ [18F]ФДГ 26
Концепция блокированного метаболизма в ПЭТ исследованиях с 18F-ФДГ H OH H O HO HO H H H 18 F OH Злокачественные клетки характеризуются более активными процессами гликолиза, что обусловлено повышенным уровнем белков, транспортирующих глюкозу (транспортеров глюкозы Глут1 1 и Глут 2), и, в большей степени, увеличением активности гексокиназы в неоплазме. ПЭТ с ФДГ позволяет количественно определять регионарную скорость потребления глюкозы в тканях 27
Недостатки и ограничения ФДГ  Низкая специфичность к опухолевым клеткам;  Высокий уровень физиологического накопления в сером веществе мозга;  Сложность диагностики опухолей с низкой скоростью гликолиза;  Высокое накопление в очагах воспаления  Высокое накопление в мочевом пузыре Высокое накопление в очагах воспаления - наиболее частая причина ложно положительных заключений в диагностике опухолей мозга 28
Приоритетные РФП на основе фтора-18 для диагностики опухолей (кроме ФДГ) программа МАГАТЭ 2009-2014 г. Класс Функция/ радиотрейсеров применение РФП Метод синтеза Аминокислоты ФЭТ (FET) Нуклеофильный прямой Транспорт АК (опухоли мозга) Транспорт АК 6-ФДОФА Электрофильный (нейроэндокрин. (6-FDOPA) прямой опухоли) Нуклеозиды Метастазы, эффективность терапии ФЛТ (FLT) Нуклеофильный прямой Гипоксические агенты Гипоксические опухоли ФАЗА (FAZA) Нуклеофильный прямой Производные холина РПЖ, опухоли мозга ФМеХол (FMeChol) Нуклеофильный двустадийный 29
Синтез 3’-дезокси -3’-[18F]фтортимидина (FLT) AF Shields et al, Nature Medicine 1998 O O DMBn N N DMTrO O ONs N O HO O 1) [18F]KF/K2.2.2, AcN, 100oC 2) NaOH 0,5% 18 N H O F • фосфорилируется по 5’-OH-группе тимидин-киназой TK1 • из-за наличия фтора не инкорпорируется в ДНК • накапливается в пролиферирующих клетках • применяется для выявления метастаз, в оценке эффективности лечения 30
Алифатическое нуклеофильное фторирование: синтез 18F-фтороазомицин арабинозида (18F-FAZA) 18 TsO CH2 O NO2 N 18F-FAZA: CH2 O AcO OAc F N 1) [18F]KF/K2.2.2, DMSO 2) NaOH гипоксический агент NO2 HO N OH N Piert et al, J Nucl Med 2005 • гипоксия характеризуется дефицитом кислорода; • гипоксические клетки опухоли обладают повышенной (3-5 раз) резистентностью к радиотерапии; 18F-FAZA накапливается в гипоксических клетках; • недостаток: высокий уровень неспецифического связывания 31
Ароматическое нуклеофильное фторирование: • нуклеофильная атака по атому углерода в sp2 конфигурации (в положении «уходящей» группы); • обязательно наличие активирующей (EWG) –группы в орто- или параположении; • EWG-грппы: CHO, CN, COOR, NO2; • «уходящие группы» (LG): NO2, Br, I, Cl, N+Me3 • реакции протекают в апротонных полярных растворителях; • высокий выход достигается при температуре 160-180оС за 20-30 мин; • 32
Введение метки в [18F]фторгетероарены методом прямого нуклеофильного фторирования N N K[18F]F/K2CO3 - K222 DMSO 18 X F X=I, Cl, NO2, N(Me)3+ TfO- Dolle et al, 2004 33
Ароматические аминокислоты: выбор метода синтеза зависит от положения метки 2-[18F]фтор-L-тирозин O-(2’-[18F]фторэтил)-L-тирозин NH2 COOH HO 18 F Электрофильный синтез Coenen et al. J Nucl Med (1989) 30:1367 Прямое введение метки в ароматический фрагмент АА невозможно NH2 18 COOH F O Нуклеофильный синтез Wester et al. J Nucl Med (1999) 40: 205 34
Методы получения [18F]фторэтил тирозина (ФЭТ) Прямое нуклеофильное фторирование 18F-фторалкилирование TsO OTs [K+/2.2.2.] AcN, 18F- 18 TsO 90oC F NH2 Tyrosine (di-Na-salt) DMSO, 18 90oC Br [K+/2.2.2.] O Hamacher, Coenen Appl Rad Isot 2002 18 TsO F Br O O H NH2 O NH2 COOH 18 DMSO, NaOH, 100oC F O o-DCB, 110oC HO 18 TsO 18F- O OH O O H2N 2)TFA COO- F 1) Bu4N+ 18F- O HN Wester et al., J Nucl Med 1999 OTs Ph Ph Ph Ni N O Гомзина НА и др. Радиохимия 2006 N Ph 1) 2) 0,5M HCl N COOH F H2N O Bu4N+ 18F18 OH F O H O Krasikova et al., Bioorg. Med. Chem., 2008 35
Прямое введение метки в сложные ароматические субстраты: синтез 18F-MPPF OCH3 N N N K[18F]F/K2CO3 - K222 N NO 2 OCH3 ДМСО, 140оС, 20 мин O N N N N 18 F O 18F-MPPF – радиолиганд для визуализации 5HT1a рецепторов (серотонинергическая система, используется в иссл. депрессии) 36
Синтез 18F-флюмазенила, радиолиганда для диагностики эпилепсии Ro 15-2344 was kindly provided by Hoffmann La Roche, Basel N N COOC2H5 N COOC2H5 N [K/K2.2.2.]+/18F- O2N DMF, 160oC, 30 min N O 18F CH3 N O CH3 Ro 15-2344 meta позиция уходящей группы; псевдоароматическая структура Эффективность 18Fфторирования - 60%, DMSO, 30 мин, 180oC Ryzhikov N. et al, Nucl Med Biol 2005 37
Многостадийный нуклеофильный асимметрический синтез 2-[18F]фтор-L-тирозина с МФ катализом S-НОБИНом CHO OMe 2 1 NO2 CH 2OH CHO NaBH4 aq [K/K222]+18F-, 180oC OMe OMe 18 F 18 F 3 O OH O N Ni N N O Ph3PBr2 CH2Cl2, 5 min H CH 2Br H 18 OMe F NH 2 Krasikova et al., Nucl Med Biol 2004 4 O N O O Ni N N CH2Cl2, NaOH, 20oC, 4 min 18 F CH 2 H OMe NH 2 5 COOH 57% HI 170oC HO 18 F 2-[18F]fluoro-L-tyrosine 38
Нуклеофильный синтез 6-18F-FDOPA (Lemaire et al, 1994) 39
6-18F-фтор-L-ДОФА - первый ПЭТ радиотрейсер для изучения допаминергической системы (1983) 40
6-18F-фтор-L-ДОФА - радиотрейсер для диагностики нейроэндокринных опухолей и щитовидной железы 41
Газовая мишень для получения фтора-18 в форме [18F]F2 42
Недостатки метода электрофильного фторирования с использованием [18F]F2 18O(p,n)18F 20Ne(d,α)18F Низкая производительность газовой фторной мишени Фторирование: Теоретический выход 50% Изотоп получают в газовой мишени; для его выделения из мишени необходимо добавление носителя (0.4% of F2) Низкая удельная активность Критично для токсичных соединений и рецепторных радиолигандов 43
Прямое электрофильное радиоторирование с использованием фтора-18 в форме [18F]F2 [18F]F2 - высокореакционный реагент с низкой селективностью 44
Стереселективный электрофильный синтез – реакции деметаллирования Метка фтор-18 вводится в конкретное положение молекулы 45
Стереоселективный электрофильный синтез 6-18F-фтор-L-ФДОФА с использованием [18F]F2 EtOOC HOOC EtOOC N H R Sn(CH3)3 BocO N H 18 F [18F]F2 CHCl3 R NH2 HBr 130oC, F 10 мин HO BocO OBoc 18 OBoc R = Boc, CHO • высокая стереоспецифичность (>99 % L-изомера); • коммерчески доступный станнильный прекерсор (АВХ); • автоматизация с помощью модуля TracerLab FX FE; • Радиохимический выход: 33+4% (EOB) OH • Namavari et al. Appl Rad Isot 1992 • E.F.J. De Vries et al, Appl Rad Isot, 1999 46
Стадии синтеза 6-18F-фтор-L-ДОФА методом электрофильного фторирования • Время облучения неоновой мишени 150 мин.; ток 40 мкА; получают 8.95 ± 0.61 GBq (n = 15); • Улавливание в 10 мл фреона, содержащего 60 мг прекерсора при -20оС; • Реакция: 30оС, 4 мин, удаление фреона в вакууме при 50оС; • Снятие защиты: 2.0 ml, 47% HBr, 130оС, 10 мин; • Охлаждение до 70оС, частичная нейтрализация добавлением 1.3 мл 25% раствора NH4OH; • Разбавление фосфатным буфером перед ВЭЖХ очисткой; • ВЭЖХ очистка (Nucleosil 100 C-18, 7 микрон, 16х250 мм; элюент 2% этанола в 0.05 M NaH2PO4 (pH 4-5); • Стабилизация: фракцию продукта собирают в вайл, содержащий 100 мкл раствора (75 мг аскорбиновой кислоты в 0.6 мл 0.5 N NaOH) 47
Недостатки электрофильного синтеза 6-18F-фтор-LДОФА • Длительное время облучения, длительное время улавливания фтора-18 в растворе прекерсора во фреоне; • Потери радиоактивности на стадии упаривания фреона (фреон можно заменить на дейтерированный хлороформ!) • Длительная процедура «подщелачивания» перед ВЭЖХ очисткой •Необходимость стабилизации продукта в отношении радиолиза (добавление аскорбиновой кислоты) • Обязательное определение высоко токсичного олова в продукте • Большое количество (60 мг на синтез) дорогостоящего прекерсора 48

More Related Content

Получение радионуклидов и РФП для ПЭТ. РФП на основе F–18. Лекция 3, Красикова Р.Н.

  • 1. Получение радионуклидов и радиофармпрепаратов для позитронной эмиссионной томографии (ПЭТ) Р.Н. Красикова Зав. лаб. радиохимии ФГБУН Институт мозга человека им. Н.П. Бехтеревой РАН Доцент каф. радиохимии химического факультета СПбГУ Курс лекций в рамках подготовки ПЭТ радиохимиков МГУ май 2013 г. 1
  • 2. Лекция РФП для позитронной эмиссионной томографии. Особенности синтеза РФП для ПЭТ. РФП на основе фтора-18; влияние введения фтора-18 в структуру молекул на биохимическое поведение (концепция блокированного метаболизма). Нуклеофильные и электрофильные методы введения фтора-18 в структуры молекул. Удельная мольная активность РФП в зависимости от метода синтеза. Хроматографические экспресс методы очистки РФП для ПЭТ. 2
  • 3. Ядерно-физические характеристики основных ПЭТ радионуклидов (более 90% всех ПЭТ исследований) Изотоп T1/2, мин Т р а с и п +, Макс. п а д а % , э н е М р г э и В я , М п м а р о ы С 13 N 15 О 18 F 20,4 9,96 2,04 109,7 + + + +(97), (EC 3) 0,96 1,19 1,74 0,635 с б . е ш м 11 к ц М г а , а а , к с к . т К м и и о в / л н м ь о о с л н т а ь я , ь м 4.1 5.4 8,2 2,39 9,22*109 1,89*1010 9,0*1010 1,71*109 Наиболее широко применяются РФП на основе фтора-18 3
  • 4. Радионуклид фтор-18 • • 1937 - впервые получен в циклотроне; A.H. Snell: Phys. Rev. 51, 143; 1940 - Изучена адсорбция в костях; J.F. Volker, H.C. Hodge, H.J. Wilkson, J.Biol. Chem. 134, 543. С 70-х годов 20 века фтор-18 интенсивно используется в ПЭТ исследованиях T1/2 110 мин 96.9% + Emax 0.635 МэВ 4
  • 5. Преимущества фтора-18 удобный способ получения больших активностей водной мишени циклотрона EMAX 0.635 МэВ 18F-фторида в идеально подходит для ПЭТ исследований Пробег позитронов 2.4 мм T1/2 110 мин высокое разрешение ПЭТ изображения возможность проводить сложные синтезы начиная с 20 Ки 18F высокая удельная активность доставкаРФП в клиники, не имеющие циклотрона 5
  • 6. Влияет ли введение фтора-18 в состав молекулы на ее биологическую активность? vdW радиус [Å]:1.35 (водород: 1.20) • замена водорода или гидроксила на 18F приводит к минимальным структурным изменениям исходной молекулы; • высокая реакционная способность фтора-18 позволяет получать широкий спектр радиотрейсеров, принадлежащих к разным классам соединений; • получение «истинных» аналогов возможно при введении фтора-18 в структуру фторсодержащих лекарственных средств (18F-флюмазенил и др.) Метаболизм меченых фтором-18 молекул блокируется на ранних стадиях 6
  • 7. Методы получения фтора-18 (T1/2 109.7 мин) Ядерная реакция Облучаемый материал Химическая форма Носитель 18O(p,n)18F H218O 18F-фторид No F2 18F 2 Yes + F2 18F 2 Yes 18O(p,n)18F 18O + 2 (0.5-1%) 20Ne(d,α)18F 20Ne (0.5-1%) Наиболее широко применяется метод получения фтора-18 в водной мишени циклотрона; полученный в виде 18F-фторида он используется в реакциях нуклеофильного замещения 7
  • 8. Удельная мольная активность (Specific radioactivity - SRA) высокая удельная активность необходима для рецепторных исследований и при использовании потенциально токсичных соединений 8
  • 9. Удельная мольная активность (Specific radioactivity - SRA) высокая удельная активность необходима для рецепторных исследований и при использовании потенциально токсичных соединений 9
  • 10. Методы введения фтора-18 в молекулы [18F]F- SNAr SN2 без носителя Прямое введение метки Нуклеофильный через синтоны 18F(Ar)X 18F(CH ПЭТ трейсер 2)X через [18F]AсOF синтоны с носителем SEAr [18F]F2 Электрофильный [18F]F2 ПЭТ трейсер Прямое введение метки 10
  • 11. Выделение [18F]фторида из облученной воды для реакций нуклеофильного фторирования 18O(p,n)18F 1. Дистилляция с последующим удалением следов воды азеотропной отгонкой с ацетонитрилом (в присутствии основания) 2. Сорбция на анионообменной смоле 3. Электрохимическое выделение • объем мишени 1- 2.5 мл; • облученная вода током гелия доставляется на вход модуля синтеза 11
  • 12. Активация фтора-18 для участия в реакциях нуклеофильного замещения Комплекс с криптофиксом (К222) применяется благодаря хорошей растворимости и слабому образованию ионных пар с 18F- Coenen. et al, 1989 Kilbourn et al, 1990 Другие агенты для активации фтора-18: Сильно гидратированный фторид-ион с малой реакционной способностью Комплекс с К222 хорошо растворим в органических растворителях; высокая реакционная способность Rb2CO3 K2CO3 TBAOH 18F без сольватной оболочки часто называют «naked fluoride» 12
  • 13. Реакции нуклеофильного замещения с участием [18F]фторида: получение активированного комплекса 18O(p,n)18F в 1-3 мл H2O • Адсорбция на картридже QMA или PHCO3 Coenen. et al, 1989 Kilbourn et al, 1990 18F- Элюирование с картриджа K222 и K2CO3 в смеси MeCN:H2O 96:4 Удаление растворителей в токе азота или вакууме при нагреве [K/K222]+18F- [K/K2.2.2]+18F13
  • 14. Введение метки методом прямого нуклеофильного радиофторирования: стадии процесса • получение 18F-фторид-иона в водной мишени циклотрона • сорбция 18F фторида на смоле QMA и элюирование • получение высокореакционного комплекса 18F с криптофиксом или ТБАК (удаление растворителя досуха) • фторирование (алифатическое или ароматическое) • гидролиз/снятие защиты • очистка (твердофазная экстракция или ВЭЖХ) • нейтрализация (pH 5-7) • стерильное фильтрование (on-line) 14
  • 15. Алифатическое нуклеофильное фторирование • введение метки путем замещения «уходящей» группы 18Fфторидом в составе активированного комплекса; • «уходящая» группа (LG - Leaving Group); • SN2-механизм: инверсия Вальдена (обращение конфигурации); • необходим строгий контроль щелочности среды, чтобы избежать реакций элиминирования; • реакции в апротонных растворителях в отстутствие воды (ацетонитрил, ДМСО); • протекают с высоким выходом при температурах 80-100оС Большинство РФП для рутинных клинических ПЭТ исследований получают именно реакцией алифатического замещения уходящей группы 18F-фторидом 15
  • 16. Алифатическое нуклеофильное фторирование: Синтез 18F-FMISO - гипоксического агента для диагностики опухолей • «уходящая группа» - тозил (Ts); • реакция в ацетонитриле или ДМСО; • выход около 40%; 16
  • 17. Алифатическое нуклеофильное фторирование: различные «уходящие» группы 17
  • 18. Алифатическое нуклеофильное фторирование: реакционная способность «уходящих» групп Синтез 18F-фторалкил МК801 18
  • 19. Первый синтез 2-[18F]-2-дезокси-D-глюкозы ([18F]ФДГ) Впервые [18F]ФДГ была получена в середине 1970-х в Брукхейвенской национальной лаборатории, США . Синтез проводили реакцией электрофильного радиофторирования с использованием меченного ацетилгипофторида, тогда как радионуклид был получен в результате ядерной реакции 20Ne(d, α)18F, протекающей при облучении газовой мишени. В реакции с 3,4,6-три-О-ацетил-Dглюкалью был получен [18F]3,4,6-три-О-ацетил-2-дезокси-2-фтор-Dглюкопиранозил фторид, гидролиз которого в кислых условиях приводил к образованию [18F]ФДГ. Радиохимический выход реакции составил >96%. Но, несмотря на подтвержденное уже в первых экспериментах высокое накопление в опухолевых тканях, в то время радиотрейсер не нашел широкого применения из-за очень сложного и трудоемкового метода синтеза, который выполнялся практически вручную на обычном химическом оборудовании из стекла. OH OH O HO HO 1) [18F]CH3COOF, H2O 2) HCl O HO OH HO 18 F 19
  • 20. Cтереоспецифический нуклеофильный синтез [18F]ФДГ Hamacher et al. 1986 Fuchtner et al. 1996 OH AcO O OTf AcO H AcO 1) [18F]KF/K2.2.2 or [18F]TBAF AcN, 80oC HO 2) OH- or H+ H HO O H H 18 H H H OAc F H OH • Прямое введение метки в молекулу алифатического субстрата (трифлата маннозы) с высоким и стабильным выходом на стадии радиофторирования (до 90%) • Щелочной гидролиз on-line на одноразовом картридже С18 SepPak • Очистка на картриджах, без применения ВЭЖХ • Высокая степень автоматизации в современных модулях 20
  • 21. Cтереоспецифический нуклеофильный синтез [18F]ФДГ Hamacher et al. 1986 В 1986 году немецкими учеными был предложен наиболее оптимальный метод синтеза [18F]ФДГ [21], который был основан на более ранних работах по методам введения фтора-18 в алифатические субстраты реакцией нуклеофильного замещения «уходящей» группы в присутствии межфазных катализаторов [20]. В синтезе [18F]ФДГ было предложено использовать реакцию нуклеофильного замещения фторид-ионом трифлатной «уходящей» группы в молекуле 1,3,4,6тетра-О-ацетил-2-О-трифторметансульфонил-β-D-маннопиранозы, аналога маннопиранозы с «защищенными» гидроксильными группами. Реакция протекает стереоспецифично с инверсией Вальдена. Радионуклид в форме фторид-иона получают по ядерной реакции 18О(p,n)18F в мишени циклотрона, заполненной водой, обогащенной кислородом-18. Переход [18F]F- из водной фазы в органическую фазу достигается путем добавления межфазного катализатора (МФК) – криптофикса 2.2.2, противоионом служит ион калия в составе карбоната. Наличие следов воды является критичным на данной стадии, комплекс криптофикса с [18F]фторид-ионом подвергается дополнительной осушке путем последовательного добавления и упаривания небольших порций ацетонитрила, образующего азеотропную смесь с водой. Полученный реакционноспособный комплекс [K/K2.2.2]+I8F- и является фторирующим агентом, участвующим в реакции замещения трифлатной группы в молекуле трифлата маннозы Реакция также крайне чувствительна к следам кислот, поэтому для приготовления раствора трифлата маннозы в ацетонитриле нужно использовать безкислотный 21 растворитель с очень низким содержанием воды.
  • 22. Cтереоспецифический нуклеофильный синтез [18F]ФДГ Hamacher et al. 1986 Гидролиз: по окончании реакции фторирования и удаления растворителя проводят кислотный гидролиз полученного промежуточного продукта 2-[18F]фтор-1,3,4,6-тетра-О-ацетил-Dглюкозы при 120-130°С, в результате чего происходит удаление защитных ацетильных групп с образованием [18F]ФДГ. Этот метод, часто называемый методом Хамахера, положен в основу технологии синтеза [18F]ФДГ во всех современных автоматизированных модулях синтеза. Предложенная позднее замена кислотного гидролиза 18Fфторированного интермедиата на щелочной [Fuchtner et al.], который протекает легко при комнатной температуре, позволила сократить время синтеза и существенно увеличить выход продукта. Важным преимуществом варианта щелочного гидролиза является возможность проведения реакции на одноразовом картридже C18 или tC18 Sep-Pak (Waters) или аналогичных в режиме on-line, что и было использовано в кассетных вариантах модулей синтеза. 22
  • 23. Стереоспецифический нуклеофильный синтез 2-18F-фтор-2-дезокси-D-глюкозы, [18F]ФДГ H OAc H OAc [18F]KF/K22 2 OTf O AcO AcO H H H O MeCN; 900C OAc AcO AcO H H H H OAc 18 F H 0,3M NaOH H OH 400C H O HO HO H OH 18 H [18F]ФДГ F H Основная радиохимическая примесь [18F]фторид (не более 5%) 23
  • 24. Основные этапы синтеза [18F]ФДГ • получение 18F-фторид-иона в водной мишени циклотрона • сорбция 18F фторида на смоле QMA и элюирование • получение высокореакционного комплекса 18F с криптофиксом или ТБАК (удаление растворителя досуха) • фторирование (алифатическое) • щелочной гидролиз/снятие защиты на картридже С18 • очистка (твердофазная экстракция) • смыв буфером (цитратный буфер) • стерильное фильтрование (on-line) 24
  • 25. Особенности синтеза и анализа РФП для ПЭТ - малый период полураспада основного ПЭТ радионуклида – фтора-18 (110 мин) требует использования экспресс методов синтеза и анализа; - анализ препарата нужно проводить до введения пациенту - метод радиоТСХ с детектором радиоактивности отвечает этим требованиям ТСХ – тонкослойная хроматография Радио ТСХ сканнер фирмы raytest, Germany (установлен в ИМЧ РАН) 25
  • 26. ray test Isotopenmeßgeräte GmbH file: FDG0305 method: F date: 03.05.07 time: 12:14:12 • Метод ТСХ рекомендован для анализа [18F]ФДГ Американской и Европейской фармакопеей [18F]ФДГ FDG 300.0 200.0 100.0 Fluoride • Определение примеси [18F]фторида стандартными методами обращеннофазовой ВЭЖХ затруднительно ввиду сорбции фторида на колонке; origin: 0.0 mm solvent front: 99.9 mm 400.0 Cnts Анализ радиохимической чистоты [18F]ФДГ методом радиоТСХ c ount time: 200 s s moothing constant: 2.0 mm HV : 850 V LL: 300 keV UL: 1000 k eV 0.0 0.0 10.0 20.0 30.0 40.0 50.0 60.0 70.0 80.0 90.0 100.0 mm raytest Isotopenmeßgeräte GmbH file: FDG0305 method: F date: 03.05.07 time: 12:14:12 count time: 200 s smoothing constant: 2.0 mm HV: 850 V LL: 300 keV UL: 1000 keV origin: 0.0 mm solvent front: 99.9 mm No Name Max.Pos Pos mm rf_center rf_max mm-mm %s % 1 Fluoride 9.5 5.0-15.0 0.10 0.10 4.22 2 FDG 48.2 38.0-62.0 0.50 0.48 95.78 Total 129.13 Sum 29.13 в ИМЧ РАН, Ст-Петербург 100.00 Rem Анализ [18F]ФДГ 26
  • 27. Концепция блокированного метаболизма в ПЭТ исследованиях с 18F-ФДГ H OH H O HO HO H H H 18 F OH Злокачественные клетки характеризуются более активными процессами гликолиза, что обусловлено повышенным уровнем белков, транспортирующих глюкозу (транспортеров глюкозы Глут1 1 и Глут 2), и, в большей степени, увеличением активности гексокиназы в неоплазме. ПЭТ с ФДГ позволяет количественно определять регионарную скорость потребления глюкозы в тканях 27
  • 28. Недостатки и ограничения ФДГ  Низкая специфичность к опухолевым клеткам;  Высокий уровень физиологического накопления в сером веществе мозга;  Сложность диагностики опухолей с низкой скоростью гликолиза;  Высокое накопление в очагах воспаления  Высокое накопление в мочевом пузыре Высокое накопление в очагах воспаления - наиболее частая причина ложно положительных заключений в диагностике опухолей мозга 28
  • 29. Приоритетные РФП на основе фтора-18 для диагностики опухолей (кроме ФДГ) программа МАГАТЭ 2009-2014 г. Класс Функция/ радиотрейсеров применение РФП Метод синтеза Аминокислоты ФЭТ (FET) Нуклеофильный прямой Транспорт АК (опухоли мозга) Транспорт АК 6-ФДОФА Электрофильный (нейроэндокрин. (6-FDOPA) прямой опухоли) Нуклеозиды Метастазы, эффективность терапии ФЛТ (FLT) Нуклеофильный прямой Гипоксические агенты Гипоксические опухоли ФАЗА (FAZA) Нуклеофильный прямой Производные холина РПЖ, опухоли мозга ФМеХол (FMeChol) Нуклеофильный двустадийный 29
  • 30. Синтез 3’-дезокси -3’-[18F]фтортимидина (FLT) AF Shields et al, Nature Medicine 1998 O O DMBn N N DMTrO O ONs N O HO O 1) [18F]KF/K2.2.2, AcN, 100oC 2) NaOH 0,5% 18 N H O F • фосфорилируется по 5’-OH-группе тимидин-киназой TK1 • из-за наличия фтора не инкорпорируется в ДНК • накапливается в пролиферирующих клетках • применяется для выявления метастаз, в оценке эффективности лечения 30
  • 31. Алифатическое нуклеофильное фторирование: синтез 18F-фтороазомицин арабинозида (18F-FAZA) 18 TsO CH2 O NO2 N 18F-FAZA: CH2 O AcO OAc F N 1) [18F]KF/K2.2.2, DMSO 2) NaOH гипоксический агент NO2 HO N OH N Piert et al, J Nucl Med 2005 • гипоксия характеризуется дефицитом кислорода; • гипоксические клетки опухоли обладают повышенной (3-5 раз) резистентностью к радиотерапии; 18F-FAZA накапливается в гипоксических клетках; • недостаток: высокий уровень неспецифического связывания 31
  • 32. Ароматическое нуклеофильное фторирование: • нуклеофильная атака по атому углерода в sp2 конфигурации (в положении «уходящей» группы); • обязательно наличие активирующей (EWG) –группы в орто- или параположении; • EWG-грппы: CHO, CN, COOR, NO2; • «уходящие группы» (LG): NO2, Br, I, Cl, N+Me3 • реакции протекают в апротонных полярных растворителях; • высокий выход достигается при температуре 160-180оС за 20-30 мин; • 32
  • 33. Введение метки в [18F]фторгетероарены методом прямого нуклеофильного фторирования N N K[18F]F/K2CO3 - K222 DMSO 18 X F X=I, Cl, NO2, N(Me)3+ TfO- Dolle et al, 2004 33
  • 34. Ароматические аминокислоты: выбор метода синтеза зависит от положения метки 2-[18F]фтор-L-тирозин O-(2’-[18F]фторэтил)-L-тирозин NH2 COOH HO 18 F Электрофильный синтез Coenen et al. J Nucl Med (1989) 30:1367 Прямое введение метки в ароматический фрагмент АА невозможно NH2 18 COOH F O Нуклеофильный синтез Wester et al. J Nucl Med (1999) 40: 205 34
  • 35. Методы получения [18F]фторэтил тирозина (ФЭТ) Прямое нуклеофильное фторирование 18F-фторалкилирование TsO OTs [K+/2.2.2.] AcN, 18F- 18 TsO 90oC F NH2 Tyrosine (di-Na-salt) DMSO, 18 90oC Br [K+/2.2.2.] O Hamacher, Coenen Appl Rad Isot 2002 18 TsO F Br O O H NH2 O NH2 COOH 18 DMSO, NaOH, 100oC F O o-DCB, 110oC HO 18 TsO 18F- O OH O O H2N 2)TFA COO- F 1) Bu4N+ 18F- O HN Wester et al., J Nucl Med 1999 OTs Ph Ph Ph Ni N O Гомзина НА и др. Радиохимия 2006 N Ph 1) 2) 0,5M HCl N COOH F H2N O Bu4N+ 18F18 OH F O H O Krasikova et al., Bioorg. Med. Chem., 2008 35
  • 36. Прямое введение метки в сложные ароматические субстраты: синтез 18F-MPPF OCH3 N N N K[18F]F/K2CO3 - K222 N NO 2 OCH3 ДМСО, 140оС, 20 мин O N N N N 18 F O 18F-MPPF – радиолиганд для визуализации 5HT1a рецепторов (серотонинергическая система, используется в иссл. депрессии) 36
  • 37. Синтез 18F-флюмазенила, радиолиганда для диагностики эпилепсии Ro 15-2344 was kindly provided by Hoffmann La Roche, Basel N N COOC2H5 N COOC2H5 N [K/K2.2.2.]+/18F- O2N DMF, 160oC, 30 min N O 18F CH3 N O CH3 Ro 15-2344 meta позиция уходящей группы; псевдоароматическая структура Эффективность 18Fфторирования - 60%, DMSO, 30 мин, 180oC Ryzhikov N. et al, Nucl Med Biol 2005 37
  • 38. Многостадийный нуклеофильный асимметрический синтез 2-[18F]фтор-L-тирозина с МФ катализом S-НОБИНом CHO OMe 2 1 NO2 CH 2OH CHO NaBH4 aq [K/K222]+18F-, 180oC OMe OMe 18 F 18 F 3 O OH O N Ni N N O Ph3PBr2 CH2Cl2, 5 min H CH 2Br H 18 OMe F NH 2 Krasikova et al., Nucl Med Biol 2004 4 O N O O Ni N N CH2Cl2, NaOH, 20oC, 4 min 18 F CH 2 H OMe NH 2 5 COOH 57% HI 170oC HO 18 F 2-[18F]fluoro-L-tyrosine 38
  • 40. 6-18F-фтор-L-ДОФА - первый ПЭТ радиотрейсер для изучения допаминергической системы (1983) 40
  • 41. 6-18F-фтор-L-ДОФА - радиотрейсер для диагностики нейроэндокринных опухолей и щитовидной железы 41
  • 42. Газовая мишень для получения фтора-18 в форме [18F]F2 42
  • 43. Недостатки метода электрофильного фторирования с использованием [18F]F2 18O(p,n)18F 20Ne(d,α)18F Низкая производительность газовой фторной мишени Фторирование: Теоретический выход 50% Изотоп получают в газовой мишени; для его выделения из мишени необходимо добавление носителя (0.4% of F2) Низкая удельная активность Критично для токсичных соединений и рецепторных радиолигандов 43
  • 44. Прямое электрофильное радиоторирование с использованием фтора-18 в форме [18F]F2 [18F]F2 - высокореакционный реагент с низкой селективностью 44
  • 45. Стереселективный электрофильный синтез – реакции деметаллирования Метка фтор-18 вводится в конкретное положение молекулы 45
  • 46. Стереоселективный электрофильный синтез 6-18F-фтор-L-ФДОФА с использованием [18F]F2 EtOOC HOOC EtOOC N H R Sn(CH3)3 BocO N H 18 F [18F]F2 CHCl3 R NH2 HBr 130oC, F 10 мин HO BocO OBoc 18 OBoc R = Boc, CHO • высокая стереоспецифичность (>99 % L-изомера); • коммерчески доступный станнильный прекерсор (АВХ); • автоматизация с помощью модуля TracerLab FX FE; • Радиохимический выход: 33+4% (EOB) OH • Namavari et al. Appl Rad Isot 1992 • E.F.J. De Vries et al, Appl Rad Isot, 1999 46
  • 47. Стадии синтеза 6-18F-фтор-L-ДОФА методом электрофильного фторирования • Время облучения неоновой мишени 150 мин.; ток 40 мкА; получают 8.95 ± 0.61 GBq (n = 15); • Улавливание в 10 мл фреона, содержащего 60 мг прекерсора при -20оС; • Реакция: 30оС, 4 мин, удаление фреона в вакууме при 50оС; • Снятие защиты: 2.0 ml, 47% HBr, 130оС, 10 мин; • Охлаждение до 70оС, частичная нейтрализация добавлением 1.3 мл 25% раствора NH4OH; • Разбавление фосфатным буфером перед ВЭЖХ очисткой; • ВЭЖХ очистка (Nucleosil 100 C-18, 7 микрон, 16х250 мм; элюент 2% этанола в 0.05 M NaH2PO4 (pH 4-5); • Стабилизация: фракцию продукта собирают в вайл, содержащий 100 мкл раствора (75 мг аскорбиновой кислоты в 0.6 мл 0.5 N NaOH) 47
  • 48. Недостатки электрофильного синтеза 6-18F-фтор-LДОФА • Длительное время облучения, длительное время улавливания фтора-18 в растворе прекерсора во фреоне; • Потери радиоактивности на стадии упаривания фреона (фреон можно заменить на дейтерированный хлороформ!) • Длительная процедура «подщелачивания» перед ВЭЖХ очисткой •Необходимость стабилизации продукта в отношении радиолиза (добавление аскорбиновой кислоты) • Обязательное определение высоко токсичного олова в продукте • Большое количество (60 мг на синтез) дорогостоящего прекерсора 48