1. Дисципліна
„БІОТЕХНОЛОГІЯ В РОСЛИННИЦТВІ”
Полімеразна ланцюгова реакція :
принципи та застосування
Викладач: доцент кафедри
землеробства, к.с.-г.н., доцент
Манушкіна Тетяна Миколаївна,
latushkina2004@mail.ru
МІНІСТЕРСТВО АГРАРНОЇ ПОЛІТИКИ ТА ПРОДОВОЛЬСТВА УКРАЇНИ
МИКОЛАЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ АГРАРНИЙ УНІВЕРСИТЕТ
Кафедра землеробства
2. Література для підготовки до семінару
1. Глик Б. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение /
Б. Глик, Дж. Пастернак. Пер. с англ. – М. : Мир, 2002. – 589с.
2. ДНК–технологии и биоинформатика в решении проблем
биотехнологий млекопитающих / В. И. Глазко, Е. В. Шульга,
Т. Н. Дымань, Г. В. Глазко. – Белая Церковь, 2001. – 488с.
3. Использование ПЦР–анализа в генетико-селекционных
исследованиях / Под ред. Ю. М. Сиволапа. – К.: Аграрна наука, 1998.
– 156с.
4. Мельничук М. Д. Біотехнологія рослин: підруч. / М. Д. Мельничук,
Т. В. Новак, В. А. Кунах – К. : Поліграфкосталтинг, 2003. – 520 с.
5. Сиволап Ю. М. Важливіші принципи використання молекулярних
маркерів в насінництві / Ю. М. Сиволап // Сучасний стан та
перспективи розвитку насінництва в Україні: Наукові праці південного
філіалу «Кримський агротехнологічний університет» Націоналного
аграрного університету. Сільськогосподарські науки. – Вип. 107. –
Сімферополь, 2008. – С. 150-153.
3. Полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР,
РСR – polymerase chain reaction) -
це метод специфічної ампліфікації ДНК
in vitro, за допомогою якого протягом
декількох годин можна вибірково
розмножити необхідну ділянку ДНК у
мільйони разів.
4. Метод розроблений в
1983 році
американським
біохіміком фірми
«Cetus» Кері Мюллісом і
співробітниками.
В 1993 році К. Мюлліс
був удостоєний
Нобелівської премії в
області хімії.
Kary B. MULLIS
5. Завдання, що можна вирішувати за
допомогою ПЛР
Ампліфікувати необхідну ділянку ДНК,
навіть якщо зразок містить сумарну
клітинну ДНК.
Ампліфікувати ДНК, що міститься в
малих кількостях.
Аналізувати зразки, що містять
деградовану ДНК (наприклад, рослинні
гербарії).
6. Суть ПЛР полягає у трьох процесах:
Виділення ДНК.
Ампліфікація ДНК.
Детекція (розпізнавання)
ампліфікованих продуктів.
7. Для ампліфікації вибраного фрагмента ДНК
використовують два праймера,
комплементарних сайтам на досліджуваній
ДНК.
Праймери орієнтовані 3'- кінцями назустріч
один одному та убік тієї послідовності, яку
потрібно ампліфікувати.
ДНК-полімераза здійснює синтез взаємно
комплементарних ланцюгів ДНК, починаючи із
праймерів. При синтезі ДНК праймери
фізично вбудовуються в ланцюг молекул
ДНК, що новосинтезуються.
Кожна із синтезованих за допомогою одного із
праймерів молекул ДНК може бути матрицею
для синтезу комплементарної ДНК за
допомогою іншого праймера.
8. Типова ПЛР-ампліфікація
полягає в багаторазовому повторенні
трьох реакцій:
Денатурація - теплова денатурація зразка ДНК
при температурі 95ºC впродовж 1хв. В
реакційній суміші разом з ДНК містяться в
надлишку два праймера, термостабільна ДНК
полімераза Tag і 4 дезоксирибонуклеотида.
Ренатурація – температуру знижують до 55 ºC,
відбувається гібридизації праймерів з
комплементарними послідовностями ДНК,;
Синтез - температуру підвищують до 75 ºC,
починається синтез комплементарного ланцюга
ДНК, що ініціюється 3'-гідроксильною групою
праймера.
9. Принцип ПЛР, перший раунд
Кожен з
новосинтезованих
ланцюгів має значно
більшу довжину, ніж
відстань від 3'-ОН групи
“її” праймера до
кінцевого нуклеотида
послідовності,
комплементарної
другому праймеру.
Такі ланцюги
називаються “довгими
матрицями”, саме на них
буде йти подальший
синтез.
10. Принцип ПЛР, другий раунд
Дволанцюгову ДНК, що
складається з вихідного
ланцюга та “довгої
матриці”, знову піддають
денатурації, а потім
ренатурації з праймерами.
Під час синтезу знову
утворюються “довгі
матриці”, а також деяка
кількість “коротких
матриць” – ланцюгів з
праймером на одному кінці
і послідовністю,
комплементарною другому
праймеру, на іншому.
11. Принцип ПЛР,
третій раунд
В третьому та
подальших раундах
знову повторюються
реакції денатурації,
ренатурації та
синтезу, “коротких
матриць” стає все
більше.
12. Принцип ПЛР,
тридцятий раунд
Кількість “коротких
матриць” в 1 млн.
разів перевищує
кількість вихідних
ланцюгів або “довгих
матриць”
13. Умови проведення ПЛР
Всі реакції проводять у пробірках, розміщених у
термостаті.
Зміна температурного режиму і його підтримка
здійснюються автоматично.
Кожен цикл триває 3-5 хв.
14. Детекція ампліфікованої ДНК
Одержану суміш фрагментів ДНК
разділяють методом
электрофореза.
Электрофореграма продуктів
ПЛР трансгеної Bt-картоплі
с використанням 35S-праймерів:
1- позитивний контроль;
2, 3 – трансгенні рослини;
4-6 – негативний контроль
(за: Мельничук та ін., 2003).
15. Секвенування фрагментів ДНК,
ампліфікованих у ході ПЛР, дозволяє:
встановити молекулярно-генетичні
особливості структури генома;
визначити генетичні взаємовідносини
селекційних форм;
дослідити внутрішньовидову і
внутрішньопопуляційну мінливість.
17. Застосування ПЛР-аналізу в аграрних
технологіях
В селекції:
проведення паспортизації сортів, ліній, гібридів і
вихідних рослин;
упорядкування банку генетичних ресурсів.
У насінництві:
для контролю чистоти сорту.
У біотехнології рослин:
детекції наявності мутацій у сомаклональних
варіантів.
У генній інженерії –
визначити ефективність генетичної трансформації.
18. Контрольні питання до семінару
1. Структура ДНК та її елементів.
2. Дайте визначення: ПЛР, праймер.
3. Суть методу ПЛР.
4. Який матеріал можна використовувати для проведення ПЛР?
5. Які компоненти необхідні для проведення ПЛР?
6. Охарактеризуйте стадії ПЛР.
7. Особливості ампліфікації ДНК у першому, другому, третьому й
наступному циклах ПЛР. Що таке довгі та короткі матриці?
8. Умови проведення ПЛР.
9. Детекція ампліфікованої ДНК. Секвенування.
10. У чому суть дидезоксинуклеотидного методу?
11. Опишіть послідовність проведення секвенування дидезокси-
нуклеотидним методом.
12. Напрями використання ПЛР-аналізу ДНК рослин.
13. Чим викликана необхідність проведення паспортизації сортів, ліній і
гібридів?
14. Що таке дендрограмма?
15. З якою метою проводиться картування генів?
16. Підходи до розробки тест-систем на основі ПЛР для виявлення
трансгенів у генетично модифікованих організмах.
