�ݺ�ߣ

Door: Patrick van Dorst
BPV-begeleider
Stage begeleider

Proeve van bekwaamheid

Student;
Patrick van Dorst
Kerkstraat 16
4664 BR Lepelstraat

BPV-instelling;
IRS
Postbus 32
4600 AA Bergen op Zoom

BPV-begeleiders;
Theo van Tilbeurgh
Peter Gijssel

BPV-periode;
januari 2008 - juni 2008

Stagedocent;
Wim Migchielsen

2


Inhoudsopgave
Inhoudsopgave........................................................................................................................................................................................................3
Verklaring gebruikte afkortingen...........................................................................................................................................................................5
Voorwoord..............................................................................................................................................................................................................6
Methode ontwikkeling Mycotoxines......................................................................................................................................................................7
Wat zijn Mycotoxines?...........................................................................................................7
Oorzaken van het ontstaan van mycotoxines..........................................................................7
Het onderzoek.........................................................................................................................................................................................................8
De loopvloeistoffen.................................................................................................................8
Instellingen HPLC...................................................................................................................9
Monster voorbereiding............................................................................................................9
De analyse.............................................................................................................................................................................................................10
IJklijn....................................................................................................................................10
De opzuiverings kolommen..................................................................................................10
De DONprep kolom..........................................................................................................10
De Varian kolom...............................................................................................................13
Resultaten.............................................................................................................................................................................................................16
Figuur 1: De stapgradiënt voor het opschonen van de kolom...........................................16
Figuur 2: Standaardenreeks...............................................................................................16
Figuur 3: Verdunde spike oplossing rechtstreeks en door de kolom................................16
Figuur 5: Teruggevonden DON........................................................................................17
Figuur 5a: Teruggevonden 15A-DON..............................................................................18
Figuur 6: Verdunde DON oplossing.................................................................................18
Figuur 7: Verdunde DON oplossing met 2 druppels PEG toegevoegd............................18
Figuur 8: Resultaten TP3..................................................................................................18
Figuur 8a: Resultaten TP4.................................................................................................18
Figuur 9: Resultaten ter bevestiging Biofarm...................................................................19
Figuur 10: Verdunde spikeoplossing met oplossing A:....................................................19
Figuur 11: Verdunde spikeoplossing door kolom:...........................................................19
Figuur 11a: Verdunde spike oplossing ingedampt en aangevuld met oplossing A:.........19
Figuur 12: Analyse breimonster op mycotoxines.............................................................20
Figuur 13: Analyse breimonster waar geen mycotoxines aanwezig zijn..........................20
Conclusie en Discussie.........................................................................................................................................................................................21
Bijlage...................................................................................................................................................................................................................22
Bijlage 1; De ijklijn van DON..........................................................................................22
Bijlage 2; De ijklijn van 15-A-DON.................................................................................22
Bijlage 3: spectra van een standaard.................................................................................23
Bijlage 4; Spikeoplossing in ACN ...................................................................................24
Bijlage 5; Spikeoplossing ingedampt en oplossing A.......................................................24
Bijlage 6; Procedure om de DONprep kolom te gebruiken..............................................25
Bijlage 7: Brei monsters TP3 spectra rechtstreeks en na de kolom..................................25
Bijlage 8: Brei monsters TP4 spectra rechtstreeks en na de kolom..................................26
Bijlage 9: Brei 33558 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15-
ADON bevat.....................................................................................................................26
ADON bevat.....................................................................................................................27
ADON bevat.....................................................................................................................27
Samenvatting........................................................................................................................................................................................................28
Nederlands:...........................................................................................................................28
Engels:...................................................................................................................................29

3

Literatuurbronnen:............................................................................................................................................................30
Boeken:.................................................................................................................................30
Internet:.................................................................................................................................30

4


Verklaring gebruikte afkortingen

Afkorting Betekenis
[15-A-DON] concentratie 15-Acetyl-Deoxynivalenol
[DON] concentratie Deoxynivalenol
15-A-DON 15-Acetyl-Deoxynivalenol
ACN Acetonitrile
DON Deoxynivalenol
H2O MilliQ water
HPLC High Performance Liquid Chromatography
MeOH methanol
ml milliliter
mg milligram
Opl. oplossing
PEG polyethyleenglycol
UV Ultraviolet

5


Voorwoord
Op mijn laatste stage, in dit geval het IRS te Bergen op Zoom, moet ik de proeve van
bekwaamheid uitvoeren. Hieronder wordt verstaan dat in binnen het IRS moet gaan werken
aan methode ontwikkeling.

De opdracht is het ontwikkelen van een methode voor het bepalen van mycotoxines in brei.
Brei is gemalen suikerbiet. De mycotoxines waar het om gaat tijdens deze proeve van
bekwaamheid zijn: 15-Acetyl- Deoxynivalenol (15-A-DON) en Deoxynivalenol (DON). Dit
wordt gedaan met behulp van HPLC analyse en UV-detectie.
Hierbij wordt gekeken of het nodig is om het monster voor te bewerken door middel van een
opzuiveringskolom of dat het monster rechtstreeks kan worden gemeten. Hierbij wordt naar
een tweetal zuiveringskolommen gekeken: DONprep van Biopharm en Bond Elute
Mycotoxin Column van Varian. Om de betrouwbaarheid van de metingen zeker te stellen
worden er onder andere recovery bepalingen uitgevoerd.
Tijdens het gehele project wordt er gewerkt met de onderstaande HPLC apparatuur:
1. Pomp: SP8800 (Spectra Physics - binair)
2. Kolom: Inertsil 5ODS-3 (Varian)
3. Detector: Spectra Physics UV Spectra 200
4. Autosampler: Gilson Model 231
In dit verslag wordt van dag tot dag beschreven welke werkzaamheden er samen met mijn
BPV-begeleider heb uitgevoerd om een methode te ontwikkelen voor het onderzoeken van de
hoeveelheid mycotoxinen in breimonsters.
Graag zou ik Peter Gijssel en Theo van Tilbeurgh willen bedanken voor hun steun aan dit
project. Ook de overige medewerk(st)ers wil ik bedanken voor de leuke en leerzame
ervaringen die ik heb opgedaan binnen het IRS.

6


Methode ontwikkeling Mycotoxines

Wat zijn Mycotoxines?

Een mycotoxine is een gif dat geproduceerd wordt door een organisme van de
schimmelfamilie, zoals paddenstoelen, draadvormige schimmels en gist.
De meeste schimmels zijn aëroob, deze hebben zuurstof nodig om te kunnen overleven, en
komen overal voor in zeer kleine hoeveelheden vanwege hun sporen. Zodra de juiste
luchtvochtigheid en temperatuur daarvoor de gelegenheid biedt, begint de ontwikkeling van
de cellen van de schimmels door het consumeren van organisch materiaal, waardoor het
mycotoxine niveau stijgt. De gifstoffen zijn enzymen of proteïnen.

Mycotoxines komen in de voedselketen door een schimmelinfectie van landbouwproducten of
door het eten van giftige paddenstoelen. Zelfs als het product niet door mensen geconsumeerd
wordt blijft het schadelijk voor de gezondheid omdat het waarschijnlijk als veevoeder wordt
gebruikt. Mycotoxinen zijn uiterst resistent in de spijsvertering en blijven daardoor in de
voedselketen van vlees en zuivelproducten zoals melk en kaas. Temperatuurbehandelingen
zoals verhitten en bevriezen hebben geen invloed op het mycotoxine-gehalte.

De FAO (Food and Agriculteral Organisation) in Nederland bekend beter bekend als Voedsel-
en Landbouworganisatie schat dat circa 25% van alle voedselproducten in de wereld
mycotoxinen bevatten. In de Europese Unie zijn de wettelijke niveaus van een aantal
mycotoxinen in voedsel en dierenvoeding vastgesteld door een aantal Europese richtlijnen en
Commissieverordeningen.

Oorzaken van het ontstaan van mycotoxines

Er zijn een aantal verschillende oorzaken waardoor er mycotoxines kunnen worden
aangetroffen in verschillen landbouw producten. Een aantal oorzaken kunnen onder andere
zijn:

• Primaire verontreiniging: granen worden al tijdens de teelt door schimmels besmet
zoals moederkoorn op rogge, tarwe en gerst. Deze soort van mycotoxinen wordt ook
wel genaamd de veld mycotoxinen, en behoort vooral tot de Fusarium mycotoxinen.
• Secundaire verontreiniging: opgeslagen levensmiddelen beschimmelen door
Aspergillus of Penicillium. Deze soorten van mycotoxines wordt ook wel genoemd de
opslag-mycotoxinen; voorbeelden zijn:
o Aflatoxinen
o Ochratoxine A.
• Metabolisme in het dier: vee krijgt beschimmelde levensmiddelen en de mycotoxinen
worden gemetaboliseerd. Ze belanden in de eindproducten: melk, eieren, vlees. Een
voorbeeld hiervan is aflatoxine M1 wat gevormd wordt in de melk na besmetting met
aflatoxine B1.
• Schimmelvorming bij bewaring, een voorbeeld hiervan is het bewaren van
suikerbieten.

7


Het onderzoek
Het onderzoek naar de methode ontwikkeling voor het bepalen van mycotoxines is begonnen
op 26 februari 2008. De bedoeling van de opdracht is het ontwikkeling van een methode voor
het bepalen van Mycotoxines in breimonsters.
Om het onderzoek goed uit te kunnen voeren moeten er eerst een aantal instellingen bepaald
worden, zoals:
1. Wat voor loopvloeistoffen gaan we gebruiken?
2. Uit welke vloeistoffen bestaan de loopvloeistoffen?
3. Uit welke concentraties bestaan de loopvloeistoffen?
4. Wat voor instellingen van de HPLC zijn er nodig om een goed resultaat te verkrijgen?
5. Welke extractievloeistof gaan we gebruiken voor het extraheren van de breimonsters?
6. Uit welke concentratie bestaat deze extractievloeistof en welke vloeistoffen zijn dit?
Dit moesten we deels zelf uit vinden, maar er stonden ook een aantal instelling op de
voorschriften die we hebben gebruikt.

De loopvloeistoffen

Om mycotoxines te meten door middel van de HPLC heb je een loopvloeistof nodig, tijdens
het uitvoeren en ontwikkelen van de methode. De beide loopvloeistoffen voor het bepalen van
mycotoxines in brei moet bestaan uit een oplossing van H2O/ACN/MeOH. De exacte
concentratie moet nog bepaald worden.
De eerste oplossing, ook wel oplossing A genoemd, bestond uit 90% H2O /5% ACN /5%
MeOH.
De tweede oplossing, ook wel oplossing B genoemd, bestond uit 45% H2O /50% ACN /5%
MeOH.

Met deze loopvloeistoffen zijn we gaan meten, maar het bleek dat er geen optimale piekvorm
te zien was, tevens kwam de hoofdpiek er pas na 24 minuten eruit. Na diverse metingen
gedaan te hebben zijn we tot de juiste verhoudingen gekomen voor zowel oplossing A als
oplossing B.
 Loopvloeistof A: 82,5% H2O /12,5% ACN / 5% MeOH
 Loopvloeistof B: 15% H2O / 80% ACN / 5% MeOH
Van beide loopvloeistoffen is er 2 liter aangemaakt. Tijdens het gehele onderzoek wordt er
gebruik gemaakt van de bovenstaande samenstelling van de loopvloeistoffen. Loopvloeistof A
wordt ook vaak in dit verslag oplossing A. Wanneer de vloeistoffen op zijn wordt er uiteraard
nieuwe aangemaakt.

8


Instellingen HPLC

Om mycotoxines te kunnen meten door middel van de HPLC zijn er een aantal instellingen
nodig. Hiervoor is er een stapgradiënt gemaakt die past bij het meten van mytoxines in de
monsters. Een stapgradiënt is een methode waardoor je de samenstelling van de
loopvloeistoffen veranderd, en daarmee kan je de te bepalen stoffen beter terug vinden, maar
ook kan je hiermee de kolom schoonspoelen voor de volgende meting. De stapgradiënt die we
gebruikt hebben voor het opschonen van de kolom staat in figuur 1 van de resultaten. Dit
waren de belangrijkste instellingen en benodigd heden om een goede HPLC analyse uit te
kunnen voeren voor het bepalen van mycotoxines in breimonsters van suikerbieten.

Monster voorbereiding

Voordat een breimonster geanalyseerd kan worden moet deze eerst voorbereid worden,
hiervoor moet het volgende gebeuren. Je weegt op een analytische balans in een buis van
200ml een breitablet af van 15-20gram. Hierna wordt rand schoon gemaakt waar de dop
uiteindelijk op de buis wordt geschroefd. Het gewicht van de breitablet schrijf je op en ook
het nummer van de betreffende zak waar de brei uitgehaald is. Er kan nu 150ml loopvloeistof
A toegevoegd worden.
Nadat de dop stevig is vastgedraaid op de buis,
kan deze in de extraheer machine, zie
afbeelding 1,voor ongeveer 2uur door middel
van rotatie. Vervolgens wordt de buis uit de
extraheermachine gehaald en in een daarvoor
bestemde rek geplaatst, zodat de extractie buis
met daarin het mengsel van brei en de
extractie vloeistof 30 minuten de tijd krijgt om
uit te zakken.

Afbeelding 1: de extractie machine

9


De analyse
IJklijn

Om je monsters te kunnen gaan meten is het nodig om een ijklijn te maken. Via deze ijklijn
kan je dan laten berekenen wat de [DON] en [15-A-DON] van de geanalyseerde breimonsters
is. Dit is als volgt gedaan. Eerst is er een stockoplossing gemaakt van 4,40mg DON en
4,20mg 15-A-DON op te lossen in 10 ml ACN. De [DON] 440µg/ml en [15-A-DON] is dan
420µg/ml. Vanuit deze stockoplossing is de spikeoplossing gemaakt. De spikeoplossing is
gemaakt door 2ml van de stockoplossing te pipetteren in een maatkolf van 50ml en aan te
vullen met ACN. Je krijgt dan een [DON] van 17,6µg/ml. Deze concentratie is de
spikeoplossing, hiermee worden de standaarden gemaakt voor de ijklijn.
De standaarden die gemaakt zijn voor het maken van de ijklijn staan vermeldt in figuur 2 van
het kopje resultaten. De bijbehorende ijklijnen voor DON en 15-A-DON staan onder het
kopje bijlage vermeldbijlage 1 en bijlage 2. In bijlage 3, is een deel van een spectra te zien
van een standaard.
Nadat deze ijklijnen gemaakt waren voor zowel DON als 15-A-DON was het tijd om te
beginnen met de recovery van de spikeoplossing. Het blijkt dan wanneer je wilt gaan werken
met de spikeoplossing, die gemaakt is van de standaardoplossing en vervolgens aangevuld is
met ACN dat je de ACN moet indampen om een betere piekvorming te krijgen, dit is te zien
in bijlage 4 en 4. Op 5 is goed te zien dat de piek vorm asymmetrisch van vorm is.
Als je de spikeoplossing indampt door middel van de vacuüm rotatie verdamper, hiermee laat
je de ACN verdampen en houd je alleen de DON en 15-A-DON over, en er vervolgens
oplossing A toevoegt krijg je een goede symmetrische piek vorm.

De opzuiverings kolommen

De DONprep kolom

Om een goede recovery uit te kunnen voeren is de verdunde spikeoplossing eerst rechtstreeks
gemeten en vervolgens is er van de verdunde spikeoplossing 2ml door de kolom gedaan om te
vergelijken wat het resultaat is.
De verdunde spikeoplossing is als volgt verkregen. Er is 5ml spikeoplossing ingedampt in een
kolf van 50ml op de vacuümrotatie verdamper, vervolgens is er 25ml oplossing A toegevoerd.
17,6µg/ml
De spike oplossing is dan 5x verdund = 3,52µg/ml . Vervolgens is er 2 ml van deze
5
verdunning is rechtstreeks gemeten, hiermee wordt
bedoeld dat de verdunde oplossing niet door de
DONprep kolom is gegaan. In afbeelding 2 in de
DONprep kolom weergegeven.
Afbeelding 2: DONprep kolom

Ook is er 2ml wel door de kolom gegaan, de procedure hiervan is te lezen in bijlage 6. De
resultaten van deze recovery staan in figuur 3 bij de resultaten. De waarden zijn gegeven in
area`s, want er was op het moment van meten nog geen ijklijn gemaakt. Deze is naderhand
erbij gekomen toen er monsters gemeten werden.

10


Uit de metingen is gebleken dat de opbrengst door gebruik te maken van de kolommen slechts
24% en respectievelijk 33% bedraagt. De vraag was nu, waar is de rest van de DON en 15-A-
DON gebleven. Om dit uit te zoeken is er de volgende recovery gedaan.
Hierna zijn er 3 breimonsters gemeten om te kijken of er de te analyseren mycotoxines DON
en 15-DON aanwezig zijn in het monster. De monsters zijn voorbereid op de wijze van
monstervoorbereiding op bladzijde 8 van dit verslag.
Nadat de brei 30 minuten tot rust is gekomen is de bovenstaande vloeistof voorzichtig
afgeschonken in een filtreerspuit met hierop een dubbele filter het filtraat wordt opgevangen
in een aparte kolf. Het eerste monster is als enige door de kolom gegaan, de overige 2 zijn
rechtstreeks gemeten zie de onderstaande tabel.

Breimonsters met of zonder DON en 15A DON?
extractie
ID nr. inweeg (g) vloeistof (ml) kolom (ml) opl.A (ml)
Brei A 32904 15,76 150 2 2
Brei B 32911 18,52 150 - -
Brei C 32902 17,43 150 - -
Figuur 4

Uit het onderzoek bleek dat in geen van de monsters mycotoxines aangetoond konden
worden. Deze meting is nogmaals herhaald. De monsters voor dit onderzoek zijn volgens
dezelfde richtlijnen voorbereid die beschreven staan op bladzijde 8, alleen is het is plaats van
150ml loopvloeistof A te nemen is er 140ml loopvloeistof A genomen en 10ml van de
spikeoplossing (17,6µg/ml). Tevens is er ook een controle standaard meegenomen, in figuur 5
en 5a van de resultaten is te zien wat het resultaat is van dit stukje recovery. Deze monsters
zijn door de DONprep kolom gegaan.

Om uit te zoeken waarom er zo weinig van beide DON soorten overblijft nadat deze door de
kolom zijn gegaan is er een nieuw onderzoek uitgevoerd. We hebben na bepaalde stappen die
in het proces staan voor het opzuiveren van het monster, wanneer deze door de kolom het
residu dat overblijft wordt een aantal elke keer in een aparte kolf op gevangen. Om deze
daarna te laten analyseren op de HPLC.

Uit de recovery is gebleken dat het gebruiken van de DONprep kolom niet veel betere
resultaten heeft opgeleverd. Een extra onderzoek is uitgevoerd om te onderzoeken wat de
oorzaak hiervan kan zijn.
Allereerst gaan we een nieuw standaard aanmaken door middel van 5ml spike oplossing in te
dampen en vervolgens aan te vullen met een pipet van 25ml met MilliQ H2O. We hebben
deze verdunning eerst rechtstreeks gemeten, en vervolgens is deze door de kolom gegaan.
Iedere keer dat de kolom gespoeld moest worden is het residu opgevangen in een aparte kolf.
De eerste opvang was het residu dat overbleef nadat de Combistandaard door de kolom was
gegaan, de tweede opvang is na het spoelen van de kolom met H2O. Dit is tevens de laatste,
want toen kon er een conclusie getrokken worden waarom er zoveel DON en 15-A-DON er
weggespoeld is. Onder het hoofdstuk resultaten en dan figuur 6 is het resultaat van deze proef
te vinden.

11


Het bleek na deze meting dat de DON niet aan de eiwitten in de kolom bleven hechten,
hierdoor wordt de DON die eigenlijk op de pakking van de kolom moet blijven zitten al aan
het begin door de kolom gespoeld wordt.
Daarom is er nogmaals een test gedaan, maar dan hebben we PEG (polyethyleenglycol)
toegevoegd aan 5ml verdunde spike oplossing. Eerst hebben we rechtstreeks gemeten, en
vervolgens hebben we 2ml van dezelfde oplossing gemeten, maar nadat deze door de
DONprep kolom is gegaan. Onder het hoofdstuk resultaten en dan in figuur 7 staan de
resultaten vermeldt van dit stukje van de recovery.

Uit de resultaten van deze metingen bleek dat er tijdens de eerste opvang vrij veel DON is
blijven hangen aan de eiwitten in de kolom. Dit zie je ook aan de gevonden concentratie van
de opgevangen vloeistof na de eerste opvang. Er is 48% door gelaten door de DONprep
kolom, dan is er door de DONprep kolom 52% vastgehouden.

Wederom een recovery onderzoek uitgevoerd, ditmaal naar het effect van PEG in monsters.
Daarvoor is eerst een oplossing van 13g/L in 500ml MilliQ H2O. Dit komt neer op 6,5g per
500ml. Ik heb hiervoor 6,499g afgewogen op een analytische balans en vervolgens
kwantitatief overgebracht in een maatkolf van 500ml.
Ook zijn er breimonsters voorbereid om gemeten te kunnen worden. Dit waren respectievelijk
breimonster TP3 en breimonster TP4. In deze brei mengmonsters is door een extern
laboratorium (TLA) DON aangetoond. Van beide monsters is een bepaalde hoeveelheid
afgewogen tussen de 15-20 gram, waarna aan deze monsters 150ml PEG/MilliQ mengsel is
toegevoegd.
Breimonster inweeg (g)
TP3 22,79
TP4 20,848

De beide breimonsters zijn daarna 2 uur lang geëxtraheerd en daarna hebben de monsters 30
minuten lang laten uitzakken. Dit gevolgd door een dubbele filtratie. Hierbij is er ongeveer
10ml filtraat verkregen van beide breimonsters.
Van beide filtraten is er steeds 1 deel rechtstreeks gemeten en de overige vloeistof is door de
kolom gegaan en naar de 1ste opvang, na de 2de opvang, en na de 3de opvang gemeten. De
resultaten staan vermeld in figuur 8 en figuur 8a van de resultaten. Het spectra van de
rechtstreekse meting en het spectra van na de kolom staat in bijlage 7 vermeld en de spectra
van TP4 rechtstreeks en na kolom staat in bijlage 8.
Om de [DON] in ppb te bereken maak je gebruik van de onderstaande formule.
 [ DON ] × 150 

 inweeg  
[ DON ]( ppb) =   × 10 3
concentratie stap
Nog steeds komt er minder DON van de kolom dan dat er ingegaan is. De BPV-begeleider
Peter Gijssel heeft toen contact opgenomen met de firma Biofarm met de vraag hoe dit komt.
De fabrikant van de kolommen had een mail gestuurd met de mededeling dat de DONprep
maximaal 2µg/ml wordt vastgehouden door de eiwitten die zich in de kolom bevinden.
Vandaar dat er na de 3de zuiveringsstap zo weinig DON wordt teruggevonden, want de
eiwitten in de kolom waren verzadigd met DON. Hierdoor werd de overige DON die
aanwezig was in de recovery standaard weggespoeld, deze vond je daarom terug in 1ste

12


opvang. Wat er dus in de 1ste opvang terug gevonden werd was de rest van de DON die niet op
de eiwitten konden blijven plakken, omdat deze verzadigd waren.

Om die reden te bevestigen is er vandaag een recovery onderzoek uitgevoerd om te kijken of
dit de reden is waardoor er zo`n lage [DON] terug vinden. Het onderzoek is als volgt
uitgevoerd:
 Allereerst de spikeoplossing (17,6µg/ml) 25x verdund. Dit is gedaan door
middel van 2ml van de spikeoplossing te pipetteren in een kolf en vervolgens
in te dampen met de vacuümrotatie verdamper, waarna de kolf is aangevuld
met 50ml MilliQ H2O. Deze oplossing heeft dan een concentratie van
[DON]=0,704µg/ml
 Uit de verdunde oplossing is een vial gevuld voor een rechtstreekse meting.
 Ook is er 2ml van de oplossing gepipetteerd en door een DONprep kolom
gespoeld. Ook van deze methode hebben we 3 vials gevuld en wel de
volgende: de 1ste opvang, de 2e opvang en de opvang na de kolom
 Deze zijn vervolgens geanalyseerd met de HPLC
 Ook is er een monster gemeten, dit was monster TP4, deze is afgewogen op
een balans (17,247) en vervolgens opgelost in 30ml verdunde spikeoplossing
van 0,704µg/ml, en 120ml MilliQ H2O. Twee uur geëxtraheerd, gevolgd door
een dubbele filtratie waarbij minimaal 10ml is verkregen. Ook hiervan zijn
weer 4 vials gemeten.
De eerste vial is rechtstreeks gemeten, dit is dus het gefiltreerde monster. De
overige 3 vials zijn weer van de 1ste opvang, de 2de opvang en opvang na de
kolom.
De resultaten van deze recovery staan in het hoofdstuk resultaten in figuur 9. Hieruit is dus
gebleken dat het inderdaad zo is dat een DONprep kolom een maximum capaciteit van DON
heeft. Ook is het duidelijk geworden dat deze kolom alleen geschikt is voor het bepalen van
DON en niet geschikt voor 15-A-DON, want de eiwitten in deze kolom zorgen er alleen voor
dat ze binden met DON. 15-A-DON wordt er gewoon doorheen gespoeld. Je kunt bij deze
kolom alleen maar 1 soort mycotoxine aantonen, en het kost geld om voor iedere soort
mycotoxine een andere kolom aan te schaffen.

De Varian kolom

De tweede kolom die gebruikt is voor het
onderzoek komt van Varian en heeft hebben
de naam Bond Elute® Mycotoxin. Met deze
kolommen gaan zijn er een aantal recoverys
uitgevoerd, het zijn dezelfde als bij de
voorgaande DONprep kolommen. In
afbeelding 3 is de Varian kolom te zien.
Afbeelding 3: De Varian kolom

Allereerst is de theorie bestudeerd van de kolommen die door Varian geleverd zijn. Het is niet
nodig om de kolom te spoelen met H2O of MeOH. Dit komt omdat deze kolom een andere
eigenschap heeft. De kolom zorgt ervoor dat het monster dat je wilt gaan meten wordt
gezuiverd van verontreinigingen, maar deze kolom laat ook meer soorten mycotoxines door.
Het is dus alleen een kolom die de onzuiverheden weghaalt. Allereerst valt op dat er een
andere voorbewerking van de monsters gedaan moet worden. Er moet tussen de 15-20gram

13


monster ingewogen worden, deze vervolgens 1,5 a 2 uur geëxtraheerd door middel van 100ml
ACN/H2O oplossing. In de verhouding van (80/20). Daarna filtreer je minimaal 10ml van de
bovenstaande vloeistof. Vervolgens pipetteer je 4ml van dit filtraat door de Bond Elut
Mycotoxin kolom. Hierna wordt er 2ml gepipetteerd van het verkregen extract en verdampt.
Wanneer dit gebeurd is wordt er 0,5ml van oplossing ACN/H2O (20/80) toegevoegd.
Vervolgens kun je dit injecteren. Dit was echter voor het bepalen van mycotoxines door
middel van de HPLC/MS.
Er is een aanpassing gedaan om deze kolom toch te gebruiken in plaats van 0,5ml oplossing
ACN/H2O met een verhouding van 20/80 te gebruiken is er gebruik gemaakt van 2ml
oplossing A, zodat dit overeenkomt met de loopvloeistoffen die er gebruikt worden. Het zijn
dezelfde als voor de Biofarm kolom.

Omdat deze kolom zowel DON als 15-A-DON doorlaat
is er een combistandaard gemaakt, deze bevat [DON]=
17,6µg/ml en voor [15-A-DON]= 16,8µg/ml. Hiermee
worden de recovery voor deze kolom uitgevoerd. De
DON en 15-A-DON zijn oplost in 100% acetonitrile.
De oplossing is te geconcentreerd om te gebruiken voor
het onderzoek, daarom is deze oplossing 10x verdund
door 10ml te pipetteren in een rondbodem kolf en
vervolgens in te dampen door middel van de
vacuümrotatie verdamper, in afbeelding 4 is een
vacuümrotatie verdamper te zien, hierna is er een aantal
milliliter oplossing A (ACN/H2O/MeOH) toegevoegd
en even in het trilbad gehouden, zodat de ingedampte
DON en 15-A-DON opgelostten. Dit is vervolgens
kwantitatief overgebracht in een maatkolf van 100ml en
gevuld met oplossing A..

Afbeelding 4: De vacuümrotatie verdamper
17,6µg / ml
De [DON] zou dan moeten zijn: [ DON ] = = 1,76µg / ml . En voor 15-A-DON zou
10
16,8µg / ml
dit dan moeten zijn [15 − A − DON ] = = 1,68µg / ml . Om dit te controleren is er
10
van beide standaarden een analyse verricht deze is in duplo uitgevoerd. De resultaten staan in
figuur 10 onder het hoofdstok resultaten. Beide metingen zijn in duplo uitgevoerd om zeker te
zijn van de eerste waarde. Uit de resultaten is naar voren gekomen dat de verdunning goed is.
Na de controle van de verdunde standaard is, zijn er recoverys uitgevoerd met de Bond Elute®
Mycotoxin kolommen van Varian.

De recovery is als volgt uitgevoerd. Eerst is er 4ml verdunde spikeoplossing in het spuitje
gepipetteerd, dit is vervolgens gemeten. Deze resultaten staan in figuur 11 van de resultaten.
Ook is er nogmaals 4ml Combistandaard ingedampt en vervolgens aangevuld met oplossing
A. Ook deze is door de kolom gegaan. De resultaten zijn te vinden in figuur 11 en 11a.

Na deze recovery is er gekeken of er bij 3 breimonsters waar geen DON en 15-A-DON in
hoort te zitten er ook daadwerkelijk geen DON en 15-A-DON aanwezig is. Hiervoor zijn er 3
breimonsters genomen en gemeten. De bijbehorende resultaten staan in figuur 13. De spectra

14


van deze 3 breimonsters zijn vergeleken met zowel een combistandaard als een breimonster
waar wel DON en 15-A-DON aanwezig zijn, deze spectra zijn te zien in de bijlage 9/10/11. In
deze 3 bijlagen stellen de groene spectra de monsters voor die geen DON en 15-A-DON
zouden bevatten.
Duidelijk is te zien dat deze monsters een lage [DON] bevatten, maar het is de vraag of ze ook
geen 15-A-DON bevatten. Ook in figuur 13 van de resultaten zijn zeer lage [DON] te zien die
gemeten zijn door de HPLC, Er zit misschien zo weinig in dat het haast niet te meten is. De
licht blauwe lijn van is van de standaard, de 15-A-DON piek ligt op de goede plaats, bij de
overige monsters is het de vraag of er wel 15-A-DON aanwezig is of dat het monster
verontreiniging is dat in het monster zit. Dit moet nog verder uitgezocht worden door degene
die met dit onderzoek verder gaat.

15


Resultaten
Figuur 1: De stapgradiënt voor het opschonen van de kolom
Tijd (min) % opl. A % opl. B flow (ml/min)
0,0 100 0 1,0
7,0 100 0 1,0
7,1 75 25 1,0
15,0 75 25 1,0
15,1 0 100 1,5
35,0 0 100 1,5
35,1 100 0 1,0
45,0 100 0 1,0

Figuur 2: Standaardenreeks
Standaard [DON] [15-A-DON] Verdunning
µg/ml µg/ml
1 0,06 0,055 25ml Std 2  50ml opl. A
2 0,12 0,11 25ml Std 3  50ml opl. A
3 0,29 0,28 25ml Std 4  50ml opl. A
4 0,73 0,7 25ml Std 5  50ml opl. A
5 1,83 1,75 25ml Std 6  50ml opl. A
6 4,58 4,37 13ml spike  50ml opl. A

Methode DON (area) 15-A-DON (area)
Rechtstreeks 149000 125000
Rechtstreeks 2 146000 125000
Kolom 36000 0
Kolom 2 45000 0

Figuur 3: Verdunde spike oplossing rechtstreeks en door de kolom

16


Figuur 5: Teruggevonden DON
ID [DON] µg/ml DON (area) recovery DON
CtrlCombi 5,52 149000
BreiA+toev. 1,17 42000 61%
BreiB+toev. 1,17 47000 68%

17


Figuur 5a: Teruggevonden 15A-DON

ID [15-A-DON] 15-A-DON recovery
µg/ml (area) 15A-DON
CtrlCombi 3,36 122000 -
BreiA+toev. 1,12 45500 90%
BreiB+toev. 1,12 50000 82%

Figuur 6: Verdunde DON oplossing

ID [DON] µg/ml
DON rechtstreeks 3,46
DON 1ste opvang 1,82
DON 2e opvang 0,58
*DON rechtstreeks is 5ml spike oplossing ingedampt, en vervolgens aangevuld met 25ml MilliQ H2O en daarna gemeten.
**DON 1ste opvang is 5ml van de verdunde spike oplossing door de DONprep kolom, zonder wassen met H2O en MeOH.

Figuur 7: Verdunde DON oplossing met 2 druppels PEG toegevoegd

ID [DON] µg/ml
DON rechtstreeks* 3,333
DON 1ste opvang** 1,61

*DON rechtstreeks is 5ml spike oplossing ingedampt, en vervolgens aangevuld met 25ml MilliQ H2O en 2 druppels PEG
daarna gemeten
**DON 1ste opvang is 5ml van de verdunde spike oplossing met 2 druppels PEG door de DONprep kolom, zonder wassen
met H2O en MeOH.

Figuur 8: Resultaten TP3

Breimonster Inweeg TP3 [DON] µg/ml [DON] µg/kg (ppb)
TP3 rechtstreeks 22,790 0,123 809,56
TP3 1ste opvang 22,790 <0,02 <150
TP3 2de opvang 22,790 <0,02 <150
TP3 na kolom 22,790 0,259 681,88

Figuur 8a: Resultaten TP4

Breimonster Inweeg TP4 [DON] µg/ml [DON] µg/kg (ppb)
TP4 rechtstreeks 20,848 0,062 446,08
TP4 1ste opvang 20,848 <0,02 <150
TP4 2de opvang 20,848 <0,02 <150
TP4 na kolom 20,848 0,158 454,52

18


Figuur 9: Resultaten ter bevestiging Biofarm

ID [DON] µg/ml
TP4 rechtstreeks 0,17
1ste opvang <0,02
2de opvang <0,02
Na kolom 0,15

Figuur 10: Verdunde spikeoplossing met oplossing A:

µg/ml
[DON] 1,81
[DON] duplo 1,79
[15-A-DON] 1,74
[15-A-DON] duplo 1,76

Figuur 11: Verdunde spikeoplossing door kolom:

µg/ml
[DON] 0,61
[DON] duplo 0,62
[15-A-DON] 1,15

Figuur 11a: Verdunde spike oplossing ingedampt en aangevuld met oplossing A:

µg/ml
[DON] 10,38
[DON] duplo 7,56
[15-A-DON] 9,75

19


Figuur 12: Analyse breimonster op mycotoxines

Analyse [DON] µg/ml [15-A-DON] µg/ml
1. Breimonster in oplossing A 0,13 0,33
rechtstreeks
2. Breimonster in oplossing A na 0,06 0,22
de kolom
3. Breimonster in oplossing A met 0,74 1,61
verdunde standaard (1:10)
rechtstreeks
4. Breimonster in oplossing A met 0,92 0,72
verdunde standaard (1:10) na de
kolom

Figuur 13: Analyse breimonster waar geen mycotoxines aanwezig zijn

Analyse [DON] µg/ml [15-A-DON] µg/ml*
Brei nummer 33558 < 0,04 ?
Brei nummer 03864 < 0,04 ?
Breinummer 7661 < 0,04 ?

* De [15-A-DON] was niet goed te meten, want het leek in het spectra in bijlage 7/8/9
verplaatst te zijn of het is helemaal niet aanwezig. Dit moet verder onderzocht worden.

20


Conclusie en Discussie
De opdracht was naar mijn idee in het begin leek heel eenvoudig te zijn. Een methode
ontwikkelen voor het bepalen van mycotoxines in suikerbieten brei. Dit bleek toch een stuk
moeilijker dan ik had gedacht. Gelukkig had ik goede steun aan Peter Gijssel mijn
stagebegeleider hier binnen IRS. Hij wist heel veel af van mycotoxines. Ik ben samen met
hem begonnen aan het onderzoek. Er was al een voorschrift dit is gebruikt om te dienen als
voorbeeld en als richtlijn.
Er staat onder andere de voorbewerking in van de breimonsters. Dit is onveranderd gebleven
tijdens deze methodeontwikkeling. Wel moesten er veel dingen worden veranderd en
uitgezocht worden wat de beste instellingen waren voor het analyseren van mycotoxines. Het
optimale punt is nog niet bereikt in deze proef, maar er zijn wel een aantal standaard gegevens
nodig om te kunnen beginnen.

De loopvloeistoffen die nodig waren voor het bepalen van de mycotoxines bijvoorbeeld. Er
stond in het voorschrift een mobiele fase oplossing bestaande uit H2O en ACN in de
verhouding 60/40, dit is aangepast naar de huidige loopvloeistoffen/oplossingen.
 Loopvloeistof A (oplossing A): H2O/ ACN/ MeOH
(82,5% / 12,5% / 5%)
 Loopvloeistof B: H2O/ ACN/ MeOH
(15% / 80% / 5%)

Ook is er een aparte stapgradiënt gemaakt om te zorgen dat de kolom van de HPLC mooi
schoon is. De stapgradiënt die hierbij hoort staat in figuur 2 van de resultaten.
Het volgende probleem was of er voorbereiding nodig is om mycotoxines te bepalen in brei.
Het antwoord hierop is ja, want wanneer de brei geëxtraheerd is moet het eerst gefilterd
worden alvorens je de vloeistof in een vial doet om te laten analyseren. Zonder
voorbewerking van het monster kan er niet kwantitatief geanalyseerd worden. Door gebruik te
maken van een zuiverings kolom kan je ervoor zorgen dat de analyse nog nauwkeuriger is,
vooral wanneer je de zuiverings kolom van Varian gebruikt. Deze haalt de onzuiverheden uit
het mengsel waardoor er een zuiverder extract ontstaat. Tevens is deze kolom geschikt om
meerdere soorten mytoxines op te zuiveren. Nog een voordeel van deze kolom is dat er geen
maximale concentratie is, maar ook de prijs van een Varian kolom is een stuk lager dan de
prijs van een DONprep kolom.
De DONprep kolom daarin tegen is meer een kolom die ervoor zorgt dat het filtraat zuiverder
wordt, een nadeel van deze kolom dat deze kolom een maximale [DON] heeft van 2µg/ml,
maar ook dat deze kolommen specifiek zijn voor DON. Je kan hiermee dus geen andere
mycotoxines meten. Verder onderzoek naar een methode voor het goed bepalen van
mycotoxines is noodzakelijk.

21


Bijlage
Bijlage 1; De ijklijn van DON

y=3,88x2+2,32x-0,00
r2=0,999988

Bijlage 2; De ijklijn van 15-A-DON

Y=-1,52x2+2,71x-0,00
r2=0,9999886

22


Bijlage 3: spectra van een standaard

23


Bijlage 4; Spikeoplossing in ACN

Bijlage 5; Spikeoplossing ingedampt en oplossing A

24


Bijlage 6; Procedure om de DONprep kolom te gebruiken

1 2 3 4 5

1. De DONprep kolom met vloeistof om de enzymen goed te houden
2. De aanwezige vloeistof dat dient ter bescherming van de enzymen door de kolom
spoelen en in een spoelkolf opvangen.
3. Voeg 2ml monsterextract toe aan de kolom, en vang dit op in een spoelkolf
4. Was de kolom met demiH2O en blaas deze goed droog, vang wederom de vloeistof op
in de spoelkolf
5. Was de kolom met 2ml MeOH, en van dit op in een rondbodem kolf om dit te
gebruiken voor de vacuümrotatie verdamper.

Bijlage 7: Brei monsters TP3 spectra rechtstreeks en na de kolom

25


Bijlage 8: Brei monsters TP4 spectra rechtstreeks en na de kolom

Bijlage 9: Brei 33558 vergeleken met een standaard en monster dat wel DON en 15-ADON
bevat

26


bevat

bevat

27


Samenvatting
Nederlands:

Op 26 februari 2008 ben ik begonnen met de methode ontwikkeling voor het aantonen van
mycotoxines. De opdracht was om te kijken of er een betere, goedkopere en snellere methode
te ontwikkelen, want de huidige methode die beschreven staat in het voorschrift voor het
gebruik van de DONprep kolom heeft een vrij lange voorbewerking nodig om tot een
resultaat te komen.
In de afgelopen weken en maanden heb ik onderzoek gedaan naar de mogelijkheid om een
methode te ontwikkelen voor het bepalen van mycotoxinen.

De eerste weken van het onderzoek gingen wat stroef, maar hoe langer we er aan bezig waren
des te interessanter het werd. Tijdens de methodeontwikkeling zijn er 2 kolommen getest, een
van Biopharm en een van Varian.
Op beide kolommen zijn er diverse bepalingen uitgevoerd, om te bepalen wat eventueel de
beste kolom is voor het bepalen van mycotoxines in suikerbieten brei. Na het doen van vele
bepalingen met zowel de kolommen van Varian als die van Biofarm is het vrij duidelijk
geworden dat de kolom van Varian het meest geschikt was. Dit komt doordat de monsters
weinig voorbewerkt hoeven te worden voordat ze door de kolom gaan, dit scheelt tijd. Een
tweede reden om te deze kolom te gebruiken voor het bepalen van mycotoxines is dat deze
kolom niet specifiek is voor 1 soort myxotoxine.
Voordat je de kolom van Biofarm kan gebruiken moet het monster wel eerst allerlei stappen
ondergaan en dit kost tijd, daarbij komt dat deze kolom alleen maar specifiek voor
deoxynevalon.

Dus tot dusver kan er geconcludeerd worden dat uit de resultaten is gebleken dat het nodig is
om de monsters voor te bewerken en op te zuiveren door middel van een zuiveringskolom, het
liefst door een kolom die geen specifieke binding aangaat. Uiteraard moet dit onderzoek
verder worden voortgezet om een nieuwe methode te ontwikkelen.

28


Engels:

On the 26th February 2008 I started with the project of developing a method for
demonstrating the presence of mycotoxines. The assignment was to look if there is a better,
cheaper and faster way to determine mycotoxines, because the current method that is wrote in
the prescription for the use of the DONprep column has a quite long treatment needed to get
some results.
In the past weeks and months I have researched the possibility of developing a method for
demonstrating the presence of mycotoxines.

The first weeks of the investigation were difficult, but how longer I was working on it how
interesting it became. During the development of de method there were 2 columns tested. One
from Biopharm and one from Varian.
On both columns were done several experiments, to determine what eventually be the most
suitable column is for measuring mycotoxines in pulp from sugar beets. After doing many
tests with the column of Varian as well as the column of Biopharm it was clear which was the
best to use when you’re going to measure mycotoxines.
The best option is then to take the column of Varian, called Bond Elute® Mycotoxin, because
this column can’t measure only deoxynivalenol and 15-acetyl-deoxynivalenol, but also other
mycotoxines. This is based on several tests during this development of this method. Other
reason to use is that the sample doesn’t have to go as much preparation.

Therefore we can make a conclusion out of the results we have made. It’s needed that you
pre-treatment on the samples that you’re going to measure and clean up the samples by means
of using the purification column. Rather using a column that hasn’t has a specific bond with
one type of mycotoxines. This research must be continued further on off course, so that there
can be make a whole new and better way to determine several mycotoxines.

29


Literatuurbronnen:
Boeken:

Titel: The mycotoxin factbook, food and feed topics
Uitgever: Wageningen Academic Publishers
Plaats en jaar uitgave: Nederland 2006

Internet:

1. http://www.gr.nl/pdf.php?ID=189
2. http://www.r-biopharm.com/product_site.php?
language=english&product_id=141&PHPSESSID=3360f64cc7c096e6eb5613557f7c4
3ca
3. http://www.pdv.nl/lmbinaries/pdf1363_pdf_nl_nl.pdf

30

�ݺ�ߣ

Afstudeerscriptie MLO

More Related Content

Afstudeerscriptie MLO