More Related Content
Similar to an Introduction of RT-PCR extended.en.id.pptx (20)
Recently uploaded (6)
an Introduction of RT-PCR extended.en.id.pptx
- 1. PENGENALAN RT PCR Referensi: 1.Prinsip dan Teknik Biokimia dan Biologi Molekuler 7thedisi oleh Keith Wilson dan John Walker, Teknologi DNA Rekombinan dan Penerapannya: Tinjauan oleh SA Shinde et al, 2.Dasar rekayasa genetika dan bioteknologi, oleh Dr.Mohiuddin Kabir. ANDI ARIYANDY FAKULTAS KEDOKTERAN UNIVERSITAS HASANUDDIN Diterjemahkan dari bahasa Inggris ke bahasa Indonesia - www.onlinedoctranslator.com
- 2. BedanyaPCRKonvensional denganRT-PCR? • Perbedaanyang palingumum antaraPCRKonvensional(PCR KUALITATIF)danRT-PCRyaitu analisis hasil amplifikasi fragmenDNApadaPCRkonvensional dilakukan dengan visualisasi padaagarelektroforesis.SedangkanPCR waktu nyata,jumlahDNA yangdiamplifikasi dapat dideteksi dan diukurdisetiap siklusproses PCR. • RT-PCR = REVERSE TRANSCRIPTASE PCR (Reaksi pengubahanRNAmenjadicDNAdgn menggunakan enzimMembalikkan Transkripsi) • RT-PCR = PCR-WAKTU NYATAatauPCR KUANTITATIF (qPCR)
- 4. Apa ituRT-PCR? • Reaksi berantai polimerase waktu nyataatau sering disebut reaksi berantai polimerase kuantitatif(qPCR),merupakan suatu metode biologis molekuler berbasis reaksi rantai polimerase. • Metode ini mendeteksi amplifikasitarget genselamaproses PCRberlangsung,tidakdiakhir reaksi,seperti padaPCRkonvensional. qPCRmenggunakan fluoresens,dimana peningkatan sinyal fluoresens pertunjukan terjadinya amplifikasitarget genselamaproses PCR.
- 5. DeteksiqPCR • (A)setuju berbasis hijau SYBR. hijau SYBRberikatan dengan semuaDNAutas ganda dan menghasilkan sinyal fluoresens. • (B)setuju berbasisprobe.Jikamengujiutuh,tidak ada sinyalyangdideteksi/tidak adatarget gen.Jikaprimerdanmengujimenempel padatarget genkemudian enzim Taqpolimerasemensintesis utas baruDNA,maka enzim5′eksonuklease akan bekerja pecahmengujisehingga pada akhirnya dihasilkan sinyal fluoresens. • Peningkatan sinyal fluoresens ini pertunjukan terjadinya amplifikasitarget gen. Smith dan Osborn, FEMS, 2008
- 6. qPCR • Jikabahangenetika daritargetadalahRNA,makaRNAdiubah dulu menjadicDNAsebelum dilakukanPCR.Langkah ini disebut transkripsi terbalik(RT). • 2.RTdapat dilakukan dengansatu langkah (RTdan amplifikasi dilakukan sekaligus dalam mesinPCR)ataudua langkah (dibuatcDNAdulu dalam suatu tabung sebelum dilakukanPCR). • 3.qPCRsingleplex:hanya1 target gen yangdiamplifikasiperreaksi. Menyelidiki target gendiberi nama fluoresens tertentu https://www.thermofisher.com/id/en/home/brands/thermo-scientific/molecular-biology/molecular-biology-learning-center/basic-principles-rt-qp
- 7. https://www.thermofisher.com/pengenal/en/home/life- science/cloning/cloning-learning-tengah/invitrogen-sekolah- biologi-molekuler/pcr-pendidikan/pcr-reagen-enzim/pcr- methods.html • 4. multipleks qPCR:lebih dari1 target gen yangdideteksiperreaksi. Mengujimasing-masingtarget gendiberi nama fluoresensyangberbeda sehingga dapat berbedagen mana yangdiamplifikasi. • 5.Saat melakukanqPCR:kontrol negatif,kontrol positif,kontrolinterndiberlari sama dengan
- 8. • 6.Kurva amplifikasi pada hasilqPCRkontrol positif dan sampelyangpositif akan berbentuksigmoid • 7.Ct(ambang siklus)nilaiatau Cq pertunjukan jumlah siklusyangdiperlukan sinyal fluoresens untuk melewati taman/ambang.Nilai Ctberbanding terbalik dengan jumlahDNA sasaranpada sampel(Nilai Ctyangrendah pertunjukan jumlahtarget DNA yangbesar). https://www.cogentech.it/realtime-pcr-eng-technical-details.php
- 10. Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) • PCRnyadigunakan untuk memperkuat fragmen DNA yang tepat dari campuran kompleks bahan awal yang biasanya disebut DNA cetakandan dalam banyak kasus membutuhkan sedikit pemurnian DNA.
- 11. •Membalikkan reaksi berantai polimerase transkripsi(RT-PCR) adalah salah satu dari banyak varian reaksi berantai polimerase (PCR). •Itu diperkenalkan pada tahun 1977 . •Penemuan reverse transcriptase selama studi replikasi virus dari materi genetik menyebabkan pengembangan RT-PCR. •RT-PCR digunakan untuk mendeteksi ekspresi gen secara kualitatif melalui pembuatan DNA komplementer (cDNA) transkrip dari RNA. •Teknik ini umumnya digunakan dalam biologi molekuler untuk mendeteksi ekspresi RNA.
- 12. V/S RT-PCR PCR
- 13. Prinsip RT-PCR Ada beberapa jenis Prinsip RT PCR. Satu langkah RT PCR • RT-PCR juga dapat dilakukan sebagai RT-PCR satu langkah di mana semua komponen reaksi dicampur dalam satu tabung sebelum reaksi dimulai. • RT-PCR satu langkah menawarkan kesederhanaan dan kenyamanan serta meminimalkan kemungkinan kontaminasi. • HasilnyacDNAtidak dapat digunakan untuk mendeteksi banyak pesan dari sampel RNA tunggal seperti pada RT-PCR dua langkah. PCR RT dua langkah • Secara tradisional, RT-PCR melibatkan dua langkah: reaksi RT dan amplifikasi PCR. • RNA pertama-tama ditranskripsi balik menjadi DNA komplementer (cDNA) menggunakan enzim, reverse transcriptase. • HasilnyacDNAdigunakan sebagai template untuk amplifikasi PCR selanjutnya menggunakan primer spesifik untuk satu atau lebih gen.
- 14. Prinsip RT-PCR Kuantifikasi produk RT-PCR sebagian besar dapat dibagi menjadi dua kategori:Titik akhir dan waktu nyata. • RT-PCR titik akhir:pendekatan pengukuran gen deteksi titik akhir RT-PCR tingkat ekspresi dengan menggunakan pewarna neon sepertiethidium bromida,Fosfor-32pelabelan produk PCR menggunakanphosphoimager. RT-PCR titik akhir umumnya dicapai dengan menggunakan tiga metode berbeda: relatif, kompetitif, dan komparatif. • RT-PCR waktu-nyata:analisis dan deteksi produk PCR secara real-time telah menyebabkan adopsi RT-PCR real- time secara luas untuk analisis ekspresi gen. • Ada empat probe DNA fluoresen yang berbeda untuk mendeteksi produk PCR: SYBR Green,TaqMan, Suar Molekul, dan Kalajengking. Semua probe ini memungkinkan deteksi produk PCR dengan menghasilkan sinyal fluoresen.
- 16. DNA gratis (cDNA) vs DNA genom (gDNA) • Perbedaan utama yang harus dibuat antara cDNA dan gDNA adalah keberadaan intron dan ekson.Intronadalah nukleotida dalam gen yang tidak memiliki urutan pengkodean. • cDNA dapat digambarkan sebagai gDNA tanpa semua daerah nonkode yang diperlukan, begitulah namanya sebagai DNA pelengkap. Ketika para ilmuwan menggunakan enzim virus untuk membuat cDNA dari RNA yang diisolasi dari sel dan jaringan yang mereka pelajari, cDNA tidak mengandung intron. karena disambung dalam mRNA.
- 17. Amplifikasi eksponensial melalui reaksi berantai transkripsi polimerase terbalik menyediakan teknik yang sangat sensitif di mana jumlah salinan molekul RNA yang sangat rendah dapat dideteksi. RT-PCR banyak digunakan dalam diagnosis penyakit genetik dan,secara semikuantitatif, dalam penentuan kelimpahan molekul RNA spesifik yang berbeda di dalam sel atau jaringan sebagai ukuran ekspresi gen. •Metode penelitian-Sebagai contoh, Lin et al. digunakanqRT-PCR untuk mengukur ekspresi gen Gal dalam sel ragi. •Penyisipan Gen-RT-PCR juga bisa sangat berguna dalam penyisipan gen eukariotik ke prokariota. RT-PCR biasa digunakan dalam mempelajari genom virus yang genomnya tersusun atas RNA, sepertivirus influenzaA dan retrovirus seperti HIV. •Diagnosis Penyakit Genetik-RT-PCR dapat digunakan untuk mendiagnosis penyakit genetik sepertiLesch– Nyhansindroma. Juga dapat digunakan sebagai tes flu burung-H7N9. •Deteksi Kanker-Para ilmuwan sedang mencari cara untuk menggunakan RT-PCR dalam deteksi kanker untuk membantu meningkatkan prognosis, dan memantau respons terhadap terapi •RT-PCR biasa digunakan dalam mempelajari genom virus yang genomnya tersusun atas RNA, sepertivirus influenzaA dan retrovirus seperti HIV. Penerapan RT-PCR
- 18. 1 8 Interpretasi hasil PCR: validïƒ masukan hasil, tidak validïƒ ulang proses analisis Input data hasil di sistem Verifikasi hasil Pengiriman hasil Pengecekan identitas Pencatatan Pengkodean Penyimpanan Alikuot sampel EkstraksiRNA Pencampuran reaksiPCR PCR Pra-analisis Analisis Pos-analisis Bagaimana sampelmengusappr oses untuk setuju Covid19denganRT- PCR? AlurPemeriksaanMengusap 2-3 jam 7-8 jam 2-3 jam
- 19. 19 alur kerja qPCRuntuk setujuCOVID-19 Analisis Run PCR Reverse transcription (RT) RNA ïƒ cDNA Ekstraksi RNA Swab 200uldigunakan untuk ekstraksi,sisanya disimpandi -80HaiC Manualatau menggunakan alat ekstraktor Metodesatu langkahatauPCR dua langkah Singleplex ataumultipleks Analisis kurva amplifikasidanNilai Ct
- 20. 1. Buku Panduan Dasar-Dasar Kultur Sel oleh GIBCO dan Invitrogen, Prinsip dan teknik Biokimia danMolekulbiologi 7thedisi oleh Keith Wilson dan John Walker, Teknologi DNA Rekombinan dan Penerapannya: Tinjauan oleh SAShindeet al. 2. Dasar rekayasa genetika dan bioteknologi, oleh Dr.Mohiuddin Kabir. 3. PCR laboratoriumUnud Referensi