2. Dagli inizi anni 50 la citometria a flusso 竪 diventata una tecnologia raffinata per lesplorazione delle superfici della cellula. Euna tecnica che permetta la misurazione e la caratterizzazione delle cellule sospese in un mezzo fluido in modo molto rapido e dettagliato sia a livello quantitativo che qualitativo. Le misure di carattere quantitativo e qualitativo riguardano parametri biochimici espressi dalla cellula e qualificati indirettamente per mezzo di marcatori molecolari fluorescenti. Sulla base di ci嘆 si pu嘆 affermare che nellarco di decenni la citometria a flusso 竪 diventata una strumentazione indispensabile nel servizio del biologo nonch辿 del patologo clinico.Citometria a flusso
3. Citrometria a flusso 竪 un metodo di conteggio, selezione e isolamento di particelle,le quali dopo essere state marcate con un colorante fluorescente in modo specifico,vengono singolarmente passate attraverso un sistema rivelatore ottico a flusso laminare e quindi conteggiate. Attraverso i parametri derivati da questi conteggi 竪 possibile analizzare molte caratteristiche delle particelle,dove le propriet in analisi possono essere selezionate dalla marcatura specifica.PRINCIPIO DELLA CITOMETRIA
4. Questa tecnica consta di tre componenti principali :sistema fluidico che controlla la captazione cellulare e il flusso cellulare,in questo processo le cellule in sospensione (sangue periferico,aspirato midollare, cellule in colture) vengono inniettate in singola fila nella camera di flussosistema ottico che interroga le cellule mentre attraversano un raggio laser, ogni singola cellula che attraversa un fascio di luce polarizzata del laser che riflette la luce e genera dei segnali,che vengono raccolti, filtrati e amplificati.Sistema elettronico che controlla gli strumenti e raccoglie, raffigura ed analizza i dati, un softwer converte i segnali in valori digitali e li invia al pc quindi si ha una rappresentazione grafica e statistica.
5. Vediamo il funzionamento di ciascun elemento della citometria analizzandolo pezzo per pezzo in maniera dettagliataLe cellule di una popolazione eterogenea( pu嘆 essere sangue periferico, cellule in colture ecc.) vengono aspirate dalla provetta per mezzo di un ago e spinta da aria compressa in un capillare,alluscita del quale incontra il liquido guaina e dopo aver attraversato il filtro salino di circa 0,45袖 per eliminare le impurit viene inserito attraverso una pressione generata da una pompa ad aria nel citofluorimetro. Il liquido guaina guida il campione nella camera del flusso dove le cellule vengono separate, e trasportate fino alla regione del nozzle fino alla regione ottica.
7. Allinterno della camera di flusso il campione viene avvolto dal liquido guaina ed entra in una prima regione chiamata nozzle dove viene sottoposto a un processo definito focalizzazione idrodinamica ( sarebbe un moto laminare dl fluido dove il flusso viene scomposto in tanti cilindri concentrici che scorrono intorno al core centrale senza che si mescolino con questultimo,in modo che le particelle trasportate abbiano un orientamento longitudinale).fig2
8. lettore otticoVediamo nello specifico il funzionamento del lettore otticoLa parte fondamentale del sistema 竪 il banco ottico di lettura, costituito da una sorgente di luce monocromatica di lunghezza d'onda =633 nm. (nella maggior parte degli strumenti viene impiegato un laser a ioni di Argon con lunghezza donda di 488nm(blu))Specifici coloranti fluorescenti agiscono in modo combinato sulle cellule, per evidenziare i peculiari aspetti citomorfologici e l'accurata individuazione di: Formula leucocitaria a cinque popolazioni Eritroblasti ReticolocitiPiastrine
9. Le cellule, dopo specifica colorazione, vengono trasportate con un fluido laminare nella cella di lettura dove attraversano, una dopo l'altra in un flusso focalizzato idrodinamicamente, il raggio di luce monocromatica. Opportuni sistemi ottici (fotodiodi, fotomoltiplicatori) rilevano la luce diffusa a diverse angolazioni da ciascuna cellulaRifrazione Frontale (ForwardScattered Light) Rifrazione Laterale (Side Scattered Light) Fluorescenza (Side Fluorescence)
10. RIFRAZIONE FRONTALE ("ForwardScatter") La rifrazione frontale 竪 misurata da un fotodiodo posto frontalmente al percorso ottico della luce laser. Quando il raggio luminoso monocromatico colpisce le cellule, una parte dei suoi raggi viene deviata in diverse direzioni e angolazioni. La quantit di luce che riesce a raggiungere il fotodiodo rilevatore 竪 direttamente proporzionale alle dimensioni (volume) della cellula. La misura di rifrazione frontale 竪 utilizzata per l'analisi di: Globuli Bianchi e Granulociti Basofili Reticolociti e Piastrine Eritroblasti .
11. RIFRAZIONE LATERALE ("Side Scatter")La rifrazione laterale 竪 rilevata da un tubo fotomoltiplicatore posto in posizione ortogonale alla sorgente luminosa. Esso quindi raccoglie in modo selettivo, per mezzo di uno specchio dicroico, la luce diffratta da ciascuna cellula ad un angolo di 90 gradi rispetto alla luce incidente. A tale angolazione la luce rifratta dalla cellula dipende da:Regolarit di forma del nucleo Densit della cromatina nucleare Granularit del citoplasma
12. La quantit di luce rifratta lateralmente da un granulocita, pertanto, 竪 molto pi湛 elevata della quantit di luce rifratta da un linfocita per la maggiore quantit di granulazioni citoplasmatiche e la maggiore irregolarit di forma del nucleo.La misura di rifrazione laterale e utilizzata per l'analisi di:formula leucocitaria Globuli Bianchi e Granulociti Basofili
13. FLUORESCENZA ("Side Fluorescence")La coniugazione di specifici fluorocromi a particolari componenti chimici o strutturali delle cellule (proteine, materiale nucleare) consente di differenziare in modo accurato e sensibile le diverse popolazioni cellulari. Un fluorocromo, quando 竪 eccitato da una luce monocromatica di idonea lunghezza d'onda, 竪 in grado di emettere un raggio luminoso a una frequenza minore. Quindi, dopo essersi legato allo specifico componente cellulare, il colorante fluorescente emetter in tutte le direzioni dello spazio una luce di lunghezza d'onda maggiore.Un tubo fotomoltiplicatore (posto ad un angolo di 90 gradi rispetto alla sorgente di luce laser) rileva la quantita di luce fluorescente emessa da ciascuna cellula, trasformandola in un segnale elettrico. Per rendere pi湛 sensibile e accurata tale misurazione, il tubo fotomoltiplicatore 竪 preceduto da un filtro ottico che seleziona la lunghezza d'onda caratteristica del fluorocromo in esame.
14. La misura di fluorescenza竪 utilizzata per l'analisi di:formula leucocitaria eritroblasti reticolociti e piastrine Per ciascuna analisi viene utilizzato uno specifico colorante polimetinico in grado di coniugarsi al DNA e all'RNA contenuto nel nucleo e negli organuli citoplasmatici. L'intensit di fluorescenza emessa da ciascuna cellula, combinata alla quantit di luce rifratta lateralmente e/o frontalmente consente una eccellente classificazione delle diverse popolazioni cellulari del sangue e, all'interno della stessa popolazione, un ulteriore e pi湛 specifica classificazione in base al grado di immaturit cellulare.
17. PARAMETRI FISICIQuando viene colpita dal fascio di luce emesso dal laser,la cellula emette segnali di luce diffusa in base alle proprie caratteristiche fisiche e morfologiche.La luce incidente sulla cellula d origine ad uno scatter frontale che d informazioni sul volume della cellula, ed uno scatter laterale che viene rilevato da un sensore di 90属 che valuta la granularit cellulare. In questo modo si possono determinare il fenotipo, le dimensioni e la composizione citoplasmatica elle cellule.Fig 5
19. I segnali di fluorescenza emessi dalla cellula vengono portati ciascuno a un diverso sensore, il quale trasforma lenergia luminosa raccolta i cosiddetti fotoni in intensit di corrente gli elettroni e li amplifica in modo da creare un logaritmo. Va precisato che prima dellacquisizione di un campione , si va a stabilire un valore soglia al di sotto del quale il nostro strumento considera un processo come inesistente e quindi non lo va ad includere nella nostra analisi.Dettaglio del sistema elettronico e dei risultati
20. Lelaborazione dei dati e eseguita grazie al computer collegato allo strumento,che tramite specifici software provvede a tradurre i segnali in grafici e alla loro rappresentazione su display video in tempo realeFig 7
21. I dati da noi raccolti per mezzo di questo apparecchio vengono evidenziati per attraverso delle rappresentazioni grafiche quali possono essere o ISTOGRAMMI dove in ascissa viene riportata lintensit di fluorescenza e in ordinata il numero di cellule che esprimono o meno lantigeneo il diagramma a dispersione punti, il quale correla due parametri, ogni punto rappresenta un singolo evento con un valore per ciascun parametro
23. Compensazione: processo che ha lo scopo di sottrarre da un certo canale una quota fissa di segnale relativo allemissione di un altro fluorocromo.Nonostante il complesso sistema di lenti, specchi e filtri, e lattenzione posta nella selezione di fluorocromi con spettri di emissione separati, succede infatti che una radiazione di una certa intensita di un fluorocromo si sovrappone alla lunghezza donda del fluorocromo successivo.Compensazione
24. Si sottrae dal canale (rosso),una quota fissa di segnale dovuta alla interferenza (verde),e viceversa.FIG10
25. Siamo giunti al fase finale del nostro strumnto di importanza fondamentale per le diagnosi ossia le analisi dei dati.Lanalisi dei dati consente di avere informazioni sui seguenti parametri:1.Numero di cellule appartenenti ad una determinata popolazione rispetto al numero totale di eventi acquisiti 2.Percentuale di cellule positive per un antigene di interesse3.Intensit di espressione di un antigeneAnalisi dei dati
26. Numero di cellule appartenenti ad una determinata popolazioneVediamo alcuno esempiFIG 11
30. MEAN(media aritmetica): intensit media di un parametro in una popolazione, utilizzato per i valori in scala lineareGEO MEAN (media geometrica): utilizzato per i valori in scala logaritmica, perch辿 la media aritmetica 竪 troppo sensibile a numeri ridotti di eventi ad alta intensitCV(coefficiente di variazione):esprime lampiezza del piccoMEDIAN(mediana):valore che divide esattamente a met gli eventiPEAK CHANNEL: 竪 il valore che compare pi湛 frequentemente nella distribuzione dei dati, 竪 una misura inaccurata del centro della distribuzioneSe la distribuzione degli eveni 竪 ha un andamento di tipo Gaussiano, media, mediana e peakchannel coincidono
31. Inserimento dei siti dove ho estrapolato le immagginiFigura 1 http://biotec.casaccia.enea.itFigura2 http://www.evsrl.it/vet.journal/approfondimento.php?codnotizia=4133Figura 3 http://www.ematologiainfluorescenza.it/cms/ita/32/citometriaflusso.htmlFigura 4 http://www.ematologiainfluorescenza.it/cms/ita/32/citometriaflusso.htmlFigure 5 e 6 scannerizzati dal libro metodologie di laboratorioFigure 7 8 9 10 http://smart.thinktag.orgFigura 11 12 13 14 http://www.unife.it/scienze/lm.biomolecolare/insegnamenti/biochimica-applicata/materiale-didattico/presentazioni-2010-11/16b0-18-maggio-lab-citometria.pdfBIBLIOGRAFIA DELLE IMMAGGINI
