際際滷

際際滷Share a Scribd company logo

CRISPR-CAS

Pasi Vilpas
Pasi Vilpas

CRISPR-CAS bakteereissa ja geenitekniikassa.

1 of 10
Download to read offline
9.2.13. CRISPR-CAS (CRISPR = Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats) Ymm辰rt辰辰ksesi t辰ss辰 esille tulevat asiat sinun tulisi valmiiksi osata restriktioentsyymien, geenikoettimien, k辰辰nteistranskriptaasin ja RNA-interferenssin (RNAi) k辰ytt旦tapa. RNA-interferenssi on syyt辰 osata siksi, ett辰 CRISPR-CAS on ik辰辰n kuin bakteereiden n辰kemys RNA-interferenssist辰. CRISPR-CAS on bakteereille ja arkeille ominainen puolustusj辰rjestelm辰 viruksia vastaan. Aluksi k辰ymme l辰pi joukon aiheeseen liittyvi辰 alak辰sitteit辰. Sitten katsomme yksityiskohtaisemmin, miten -j辰rjestelm辰 toimii bakteereissa. N辰iden j辰lkeen luomme yhteenvedon siit辰, miten CRISPR-CAS-puolustusj辰rjestelm辰辰 hy旦dynnet辰辰n geenitekniikan tutkimusv辰lineen辰. CRISPR CRISPR on geenisekvenssi bakteerin DNA:ssa. Se sis辰lt辰辰 toisaalta tasaisin v辰limatkoin sijaitsevia palindromisia toistojaksoja (repeats), mutta my旦s niiden v辰lisi辰 monimuotoisempia v辰likejaksoja (spacers). Seuraavaksi esittelen kummatkin n辰ist辰 erikseen. Palindromiset toistojaksot (repeats) SAIPPUAKAUPPIAS on palindromi, sill辰 se tuottaa saman sanan my旦s takaperin luettuna. Genetiikassa palindromisia eiv辰t ole samat, vaan toistensa kanssa pariutumiskykyiset em辰sjaksot, jotka sijaitsevat samassa DNA-juosteessa, joskus kaukanakin toisistaan. Jakson alussa olevan em辰sj辰rjestyksen on oltava peilikuva jakson per辰p辰辰ss辰 olevasta em辰sj辰rjestyksest辰. Esimerkiksi em辰sj辰rjestys ACAATGTTGCGGTCCATTGT on palindrominen (sinisell辰 merkityt em辰sj辰rjestykset ovat toistensa kanssa pariutumiskykyisi辰 em辰sj辰rjestyksi辰). Palindromiset geenisekvenssit tulevat genetiikassa vastaan muuallakin. Esimerkiksi kolmiapilan muotoon taipuvissa siirt辰j辰-RNA-molekyyleiss辰 on palindromisia jaksoja silmukoiden alku- ja loppukohdassa. Samoin aitotumallisten solujen geeneiss辰 esiintyvien introni-jaksojen alussa ja lopussa on toisiinsa sopivat palindromiset em辰sj辰rjestykset. N辰iden kohdalta sn旦rpit (snRNA) osaavat katkaista ja poistaa intronit. V辰likkeet (spacers) V辰likkeet (spacers) ovat CAS-proteiinin pilkkomia muutaman kymmenen nukleotidin mittaisia DNA-jaksoja, jotka bakteeri on alunperin irrottanut viruksista ja liitt辰nyt ne sitten oman genominsa osiksi. Geenisekvenssist辰, johon v辰likkeet liitet辰辰n, k辰ytet辰辰n nimityst辰 CRISPR (kuva 73). CRISPR-sekvenssi on bakteerin genomissa jakso, jossa v辰likkeet ja palindromiset toistojaksot vuorottelevat. CAS on proteiini, joka toimii endonukleaasina CAS on proteiinirakenteinen endonukleaasi, joka katkoo nukleiinihappoja (DNA ja RNA) solun sis辰ll辰 (siit辰 sanan alku: endo-). T辰ss辰 mieless辰 se muistuttaa restriktioentsyymej辰, jotka nekin
ovat bakteereissa esiintyvi辰 endonukleaaseja. Yhteist辰 on my旦s se, ett辰 sek辰 CAS ett辰 restriktioentsyymit ovat bakteereiden puolustautumiskeinoja bakteeriofageiksi kutsuttuja viruksia vastaan. CAS-proteiineja tunnetaan useita erilaisia: esim. CAS9-pilkkoo kaksijuosteista DNA:ta, CAS13 yksijuosteista RNA:ta, CAS14 puolestaan yksijuosteista DNA:ta. Eri bakteerilajeissa esiintyy hieman toisistaan poikkeavia CAS-proteiineja. Uuden virusper辰isen DNA:n liitt辰minen CRISPR-sekvenssiin (kuva 73) Kuva 73 esitt辰辰 virusinfektion etenemist辰 bakteerisolussa, johon kyseinen virustyyppi on asettumassa ensimm辰ist辰 kertaa. Kyseinen virus on siis bakteerille tuntematon. T辰ss辰 tapahtumat etenemisj辰rjestyksess辰. a. Bakteeri tuottaa CAS1-nimist辰 endonukleaasia (kuvassa kohta 3). T辰m辰 proteiini katkoo nukleiinihappoja, siis DNA:ta tai RNA:ta. b. Kun bakteeriin tulee viruksen DNA:ta, CAS1 pilkkoo sen lyhyiksi p辰tkiksi (kuvassa 73 kohdat 1, 2 ja 3). CAS1 tunnistaa n辰m辰, sill辰 virus-DNA:ssa esiintyy tiettyj辰, juuri viruksille ominaisia em辰sj辰rjestyksi辰 ns. PAM-sekvenssej辰. c. CAS1 toimii yhteisty旦ss辰 CAS2-proteiinin kanssa. CAS2 istuttaa CAS1:n tuottamat lyhyet virusgenomijaksot bakteerin CRISPR-sekvenssiin. T辰ll旦in bakteeri "muistaa" infektion ja voi my旦hemmin puolustautua sit辰 vastaan. CAS1 ja CAS2 toimivat bakteereissa dimeerin辰, toisin sanoen toisiinsa liittynein辰. (Samaan tapaan dimeerin辰 toimivat soluissa vaikkapa ribosomin isompi ja pienempi puolikas. My旦s monet aitotumallisille soluille ominaiset transkriptiofaktorit ovat kaksiosaisia dimeerej辰.)
CRISPR-CAS
Mit辰 ovat tracr-RNA (trans-activating CRISPR-RNA), CAS9, pre-crRNA (pre-CRISPR-RNA), crRNA (CRISPR-RNA) sek辰 sgRNA (single stranded guide-RNA) (kuva 74)? Bakteereissa CRISPR-CAS-koneisto edellytt辰辰 kolmen eri geenin samanaikaista toimintaa. Menetelm辰辰 k辰sittelev辰ss辰 keskustelussa n辰iden geenien tuottamat molekyylit tulevat usein esille. Siksi ne on tarpeen t辰ss辰 yhteydess辰 selitt辰辰, vaikka solubiologisessa tutkimuksessa osa bakteereissa toteutuvista geenitoiminnoista voidaankin ohittaa. T辰llaisia molekyylej辰 ja niit辰 koodaavia geenej辰 ovat tracr-RNA, pre-crRNA sek辰 CAS9. Lis辰ksi kuvan 74 selitetekstiss辰 esiintyv辰t k辰sitteet crRNA ja sgRNA. Tracr-RNA ja pre-crRNA-geeni tuottavat pelkki辰 RNA-molekyylej辰. N辰iden geenien koodaamat RNA-molekyylit eiv辰t siis etene translaatioon asti, joten ne eiv辰t koodaa proteiinirakenteita. CAS9-geeni sen sijaan tuottaa asianomaisen proteiinin CAS9. CAS9-proteiini ei pysty virusten torjuntaan sellaisenaan, vaan sen aktivoimiseen tarvitaan samanaikaisesti kahta edell辰 mainittua RNA-molekyylityyppi辰: tracr- (=Trans-Activating-CRISPR-RNA) ja crRNA (=CRISPR- RNA). crRNA syntyy pre-crRNA-molekyylin pilkkoutuessa lyhyemmiksi jaksoiksi. Tutkijat pystyv辰t valmistamaan tracr- ja crRNA-molekyylien yhdistelmi辰. N辰it辰 kutsutaan nimell辰 opas-RNA (sgRNA = single stranded guide-RNA). sgRNA aktivoi CAS9-proteiinin kiinnittym辰ll辰 siihen. SgRNA:ssa oleva geenikoetin voidaan muokata em辰sj辰rjestykselt辰辰n sellaiseksi, ett辰 se tunnistaa tutkijoiden haluamia DNA-jaksoja. CRISPR-CAS-geenist旦n toiminta bakteerille jo ennest辰辰n tuttujen viruksien torjunnassa (kuva 74) Koska CRISPR-CAS-toimintoihin osallistuvat geenit toimivat bakteerissa samanaikaisesti, alla olevassa kuvassa 74 esiintyv辰t numerot eiv辰t suoranaisesti kuvaa toimintojen tapahtumisj辰rjestyst辰. Siksi seuraavassa on tiivis, etenemisj辰rjestyst辰 paremmin ilment辰v辰 yhteenveto kuvan 74 tapahtumista (selitykset my旦s kuvassa). 1. Aluksi bakteeri tuottaa CRISPR-sekvenssist辰辰n (kohta 10) koko sekvenssin mittaisia pitki辰 pre-crRNA-molekyylej辰 (kohdat 3 ja 4). 2. Samanaikaisesti CAS9-proteiinia (kohta 6) koodaava geeni (kohta 5) tuottaa CAS9- proteiinia. 3. My旦s tracr-RNA:ta (kohta 8) koodaava geeni (kohta 7) transkriptoituu hiuspinni辰 muistuttavaksi RNA-molekyyliksi. Se sis辰lt辰辰 pre-crRNA-molekyyliss辰 esiintyvien palindromisten (kohta 1) jaksojen peilikuvia. Lis辰ksi tracr-RNA:ssa on jaksoja, joiden avulla se kiinnittyy CAS9-proteiinin poimuihin toimien samalla CAS9-molekyylin aktivaattorina (kohta 9) (tracr-RNA on lyhenne sanoista trans activating crRNA). 4. Toisiinsa liittynein辰 tracr-RNA ja CAS9 katkovat pitk辰n pre-crRNA-molekyylin lyhyiksi crRNA-molekyyleiksi (kohdat 2, 9 ja 11) palindromijaksojen osoittamista kohdista (crRNA tulee sanoista CRISPR-RNA).
5. Valmiit crRNA-molekyylit liittyv辰t CAS9-molekyyliin (kohta 11). Niiden sis辰lt辰m辰 em辰sj辰rjestys toimii 20 nukleotidin mittaisena geenikoettimena (kohta 12). T辰m辰 pystyy tarvittaessa tunnistamaan virusgenomissa olevan komplementaarisen em辰sj辰rjestyksen ja kiinnittym辰辰n siihen (kohdat 11, 12 ja 13). 6. Jos t辰llaisia em辰sj辰rjestyksi辰 sis辰lt辰v辰 virus-DNA-jakso ilmestyy bakteerisoluun, CAS9 kiinnittyy t辰h辰n, pilkkoo viruksen DNA:n toimimattomaksi ja est辰辰 viruksen lis辰辰ntymisen. 7. Tutkijoiden valmistamia crRNA-molekyylej辰 kutsutaan nimell辰 opas-RNA (sgRNA = single stranded guide-RNA). Opas-RNA-molekyyliss辰 molemmat bakteereissa esiintyv辰t RNA-jaksot (tracr- ja crRNA) ovat yhten辰 yhten辰isen辰 RNA-molekyylin辰. T辰m辰 pystyy sek辰 kiinnittym辰辰n CAS9-proteiiniin ett辰 toimimaan ohjelmoitavana geenikoettimena. sgRNA:n em辰sj辰rjestys voidaan nimitt辰in muokata tunnistamaan haluttuja DNA-jaksoja.
CRISPR-CAS
Mihin bakteeri tarvitsee CRISPR-sekvenssin tuottamia geenikoettimia, jos kerran jo CAS- proteiinitkin toimivat restriktioentsyymien tapaan? Kun virus infektoi bakteerin, on torjunnan tapahduttava nopeasti. Usein k辰ykin niin, ett辰 jotkin virusyksil旦t onnistuvat ohittamaan CAS-proteiinit ja ehtiv辰t jo istuttamaan oman genominsa bakteerigenomin osaksi. Virusgenomin toimiessa solulimaan alkaa pursuta virukselle ominaisia l辰hetti-RNA-molekyylej辰. Mutta, jos CRISPR-lokus tuottaakin crRNA-molekyylej辰, joissa on viruksen l辰hetti-RNA- molekyyleihin n辰hden komplementaarinen em辰sj辰rjestys, tuloksena on RNA-interferenssi. crRNA vaientaa viruksen tuottamat l辰hetti-RNA-molekyylit tarttumalla em辰ksill辰辰n niihin ja infektio pys辰htyy t辰h辰n. CRISPR-CAS-j辰rjestelm辰ss辰 on toinenkin olennainen etu restriktioentsyymeihin verrattuna. Restriktioentsyymit ovat proteiineja. Niist辰 syntyy uusia muotoja vain, jos niiden rakennetta koodaavissa geeneiss辰 tapahtuu mutaatioita. Mutaatiopohjainen tuotekehittely on hidasta onnenkauppaa. CRISPR-CAS sen sijaan pysyy aina ajan tasalla alati muuttuvassa virusekosysteemiss辰. Ratkaiseva toimija on crRNA:ssa oleva em辰ssekvenssi, jolloin proteiinirakenteen muutoksia ei tarvita. Bakteerin jakautuessa CRISPR-CAS-geenist旦 siirtyy my旦s bakteerin j辰lkel辰isille. Siksip辰 niill辰 jo syntyess辰辰n on k辰ytett辰viss辰辰n kaiken kokeneiden esi-isiens辰 hankkima geneettinen immunologinen muisti. PAM-sekvenssi? CRISPR-CAS-asioissa vastaasi tulee ennen pitk辰辰 kirjainyhdistelm辰 PAM. PAM on lyhenne sanoista Proto-spacer Adjacent Motif (= spacerin esimuodon vieress辰 oleva em辰sj辰rjestys). Se on lyhyt, yleens辰 kolmen em辰ksen mittainen, sekvenssi, joka esiintyy virusgenomissa, mutta sit辰 ei esiinny bakteerin omassa DNA:ssa. CAS2 havaitsee virusgenomin nimenomaan PAM-sekvenssien perusteella. Lis辰ksi, CRISPR- sekvenssiin istutettavat SPACER-jaksot leikataan irti tarkalleen PAM-sekvenssin edest辰. Ennen istuttamista niit辰 kutsutaan proto-spacereiksi. PAM-sekvenssi辰 niihin ei kelpuuteta mukaan. PAM-sekvenssi辰 ei esiinny bakteerin omassa geneettisess辰 koodissa miss辰辰n, eik辰 sen CRISPR-lokuksessakaan. Jos esiintyisi, CAS-proteiinit pilkkoisivat virusten lis辰ksi my旦s bakteerin omaa DNA:ta. PAM:in perusteella bakteeri tiet辰辰 PAMauttaa nenuun juuri virusgenomia, ei vahingossakaan omaansa. CRISPR-CAS-menetelm辰t geenitekniikassa (Vertaa n辰it辰kin kuvaan 74) CRISPR-CAS on t辰m辰n hetken merkitt辰vin geenitekniikan tutkimusmenetelm辰. Menetelm辰ss辰 on paljon yht辰l辰isyyksi辰 restriktioentsyymien, geenikoettimien ja RNA-interferenssin kanssa. Erilaisia CAS-proteiineja tuotetaan nykyisin teollisesti ja niit辰 voidaan mikroinjektiona lorauttaa my旦s aitotumallisiin soluihin. crRNA:n tilalle voidaan t辰ll旦in tuottaa opas-RNA-jakso. T辰llaista ihmisen valmistamaa opas-RNA-sekvenssi辰 merkit辰辰n sgRNA (enkuksi single stranded guide RNA). Opas-RNA:n avulla CAS9 p辰辰tyy kohdesolun DNA:ssa sellaisen sekvenssin luo, jossa on opas- RNA:han sopiva em辰sj辰rjestys (RNA-DNA-pariutumiss辰nn旦n mukaan). CAS katkaisee vastaanottavan DNA:n kyseiselt辰 kohdalta. Lis辰ehtona on t辰h辰n asti ollut, ett辰 my旦s sopiva
PAM-sekvenssi osuu tuolle kohdalle. (Kev辰辰ll辰 2020 uutisoitiin tutkijaryhm辰st辰, joka on onnistunut kehitt辰m辰辰n CAS-proteiinista my旦s sellaisen muodon, joka toimii l辰hes t辰ysin ilman PAM-sekvenssin asettamia rajoituksia (Near PAMless CAS). Pelkk辰 gRNA riitt辰辰 t辰ss辰 ohjaamaan CAS-proteiinin oikeaan kohtaan kohdesolun genomissa.) CAS tuottaa DNA:n katkaisukohtaan tylp辰n p辰辰n. Tylpp辰 kohta syntyy, kun DNA- kaksoisjuosteen molemmat puolikkaat katkeavat saman nukleotidiparin kohdalta. Tylp辰t vauriot tarkoittavat sit辰, ett辰 kromosomin jokin k辰sivarsi on kokonaan poikki. T辰ll旦in solu on vaarassa hukata kerralla suuren m辰辰r辰n geenej辰辰n. T辰llainen mutaatio on solulle erityisen vaarallinen. Ligaasi 4 niminen DNA:ta korjaava proteiini on erikoistunut korjaamaan juuri t辰llaisia vaurioita. Yleens辰 ligaasi 4 toiminnan tuloksena joitakin nukleotidej辰 kuitenkin katoaa. Koska geenin koko lukukehys muuttuu silloin virheelliseksi, geeni ei en辰辰 tuota toimivaa proteiinirakennetta. Tuloksena on knock out geeni (vaiennettu geeni). Knock out -geenien avulla voidaan tutkia, millainen merkitys jonkin geenin toiminnalla / puuttumisella on solulle tai eli旦lajille. Jos ligaasi 4 toiminta estet辰辰n ja soluun lis辰t辰辰n DNA-jaksoja, joiden molemmissa p辰iss辰 on katkaisukohdan molempiin puoliin sopivat lyhyetkin komplementaariset DNA-jaksot (kutsutaan my旦s homologisiksi jaksoiksi), katkaisupaikkaan saadaan helposti napsahtamaan siirtogeeni tai muu haluttu DNA-jakso. CRISPR-CAS-menetelm辰 on geenisiirtojen ja knock out -geenitekniikan yleisin ty旦kalu. Menetelm辰n kehittiv辰t Jennifer Doudna Berkleyn yliopistosta ja Max Planck instituutissa ty旦skentelev辰 Emmanuelle Charpentier. CRISPR- CAS9-menetelm辰n muita k辰ytt旦tapoja CAS-proteiinista on kehitetty my旦s muunnoksia, joista on poistettu sen kyky katkaista DNA:ta. T辰llaisia CAS-proteiineja kutsutaan kuolleiksi ja merkit辰辰n dCAS (dead CAS). dCAS-proteiiniin voidaan liitt辰辰 transkriptiofaktoreita joko suoraan CAS:iin tai pienen linkkerin (siis suorahkon aminohappoketjun) p辰辰h辰n roikkumaan. N辰in opas-RNA johdattaa transkriptiofaktorit haluttuihin geeneihin, jolloin niiden toimintaa voidaan s辰辰dell辰 halutulla tavalla. CAS:iin voidaan my旦s liitt辰辰 valoa hohtavia proteiineja (Green Fluorescent Protein GFP), jolloin n辰hd辰辰n, miss辰 solun tai tuman osassa tietty geeni toimii. Deaminaasi on entsyymi, joka vaihtaa DNA:n em辰ksi辰 toisiksi. Jos deaminaasi liitet辰辰n CAS:iin, voidaan geenien em辰sj辰rjestyst辰 muuttaa sgRNA:han ohjelmoiduista kohdista. Geeneihin voidaan my旦s lis辰t辰 kolmen em辰ksen mittaisia STOP-merkkej辰 kohtiin, joissa niit辰 ei luonnostaan sijaitsisi. CAS yhdistettyn辰 k辰辰nteistranskriptaasiin = Prime editing (Prime-muokkaus) K辰辰nteistranskriptaasi on retroviruksille ominainen proteiini, joka tekee transkription v辰辰rin p辰in, muodostaen RNA-molekyylist辰 sit辰 vastaavan DNA-molekyylin. Kaupalliseen levitykseen on tuotettu yhdistelm辰geeni, joka koodaa sek辰 CAS- ett辰 k辰辰nteistranskriptaasiproteiinia. Yhdistelm辰proteiini paitsi l旦yt辰辰 halutun katkaisukohdan muokattavasta DNA-jaksosta my旦s saman tien taikoo opas-RNA:n sis辰lt辰m辰n em辰sj辰rjestyksen
DNA-molekyyliksi katkaisupaikan kohdalle. Siksi soluun ei lainkaan tarvitse injektoida siirtogeenisi辰 DNA-jaksoja. Melkoisen k辰tev辰辰! T辰m辰 Prime editing niminen menetelm辰 mahdollistaa perinn旦llisten sairauksien hoidon yksinkertaisesti niin, ett辰 opas-RNA:han valitaan terveen geenin mukainen em辰sj辰rjestys. Kovin pitkien DNA-jaksojen muokkaamiseen t辰m辰 menetelm辰 ei sovellu, sill辰 opas-RNA on vain 20 nukleotidin mittainen. Onneksi useimmat perinn旦lliset sairaudet ovat yhden tai muutaman nukleotidin mittaisia mutaatioita. Tyypillinen esimerkki yhden em辰ksen pistemutaatiosta on sirppisoluanemia. Prime-muokkauksen kehittiv辰t Harvardin yliopistossa ja MIT:ss辰 David Liu ja Andrew Anzalone tutkimusryhmineen. Geeniajurit (=Gene drives) Tavallisessa CRISPR-CAS9-tekniikassa siirtogeenisi辰 soluja tuotetaan mikroinjektoimalla CAS9-proteiinia, sgRNA:ta sek辰 siirtogeenin kopioita kohdesoluun. Injektiossa siirret辰辰n siis erikseen kolmenlaisia molekyylej辰: proteiinia, RNA:ta ja DNA:ta. Geenisiirron vaikutuksia seurataan usein vain yhdess辰 solussa. Tai, jos kyseess辰 on munasolu, joka seuraavaksi hedelm旦itet辰辰n, saattavat siin辰 esiintyv辰t siirtogeenit kopioitua alkion muihinkin soluihin alkionkehityksen aikana. Geeniajuriksi kutsutaan sellaista CRISPR-CAS9-mikroinjektiota, joka koostuu pelk辰st辰 DNA:sta. T辰ss辰 DNA-jaksossa, ns. kasetissa, on CAS-proteiinia, sgRNA:ta ja siirtogeeni辰 koodaava yhdistelm辰geeni. N辰in soluun siirtyy kokonainen geneettinen j辰rjestelm辰, jolla on kyky ketjureaktion tavoin istuttaa itsens辰 kohdekromosomiin, itsekopioitua t辰st辰 kromosomista uusiin kohdekromosomeihin ja saada sama siirtymisen ja kopioitumisen keh辰 jatkumaan loputtomiin my旦s siirtogeenisen yksil旦n j辰lkel辰isiss辰. Geeniajurissa voi olla esimerkiksi geeni, joka est辰辰 Anopheles-hyttysen hajuaistin kehittymisen. Kun geeniajurilla varustettu yksil旦 parittelee luonnonvaraisen hyttysen kanssa, j辰lkel辰inen saa kyseisest辰 vastinkromosomista yhden kappaleen geenimuunnellulta emoltaan, toisen taas luonnonvaraiselta hyttyselt辰. N辰in j辰lkel辰isest辰 tulee heterotsygootti geeniajurin suhteen. Kuitenkin, kun geeniajuri alkaa toimia, CAS9-proteiini ja luonnonvaraiseen geenimuotoon sopiva opas-RNA l旦yt辰v辰t toisensa. Opas-RNA johdattaa CAS9-proteiinin kyseiselle kohdalle luonnonvaraiselta hyttyselt辰 per辰isin olevassa luonnonvaraisessa vastinkromosomissa, jolloin CAS9 katkaisee t辰m辰nkin kromosomin. Geeniajurissa on mukana my旦s koodijakso, jolla solu saadaan korjaamaan katkaistu kromosomi k辰ytt辰en mallina kasettia itse辰辰n. N辰in muuntogeenin siirtokoneisto, mukanaan hajuaistin kehittymisen est辰v辰 geeni, asettuvat toiseenkin vastinkromosomiin. Samalla heterotsygoottinen genotyyppi muuttuu homotsygoottiseksi. Aina, kun t辰llainen hyttynen tekee j辰lkel辰isi辰, niiss辰 toteutuu sama kehityskulku. Siksi hajuaistin tuhoava geeniversio levi辰辰 kaikkiin populaation j辰lkel辰isiin nopeasti ja homotsygoottisesti eiv辰tk辰 hyttyset en辰辰 l旦yd辰 ihmisi辰 veriateriansa l辰hteiksi. Malariatartunnat saadaan v辰henem辰辰n ilman, ett辰 kalojen, sammakkoel辰inten, lintujen ja lepakoiden merkitt辰v辰n辰 ravinnonl辰hteen辰 toimivat hyttyset kuitenkaan katoavat luonnon ekosysteemeist辰.
CRISPR-CAS

More Related Content

CRISPR-CAS

  • 1. 9.2.13. CRISPR-CAS (CRISPR = Clustered Regularly-Interspaced Short Palindromic Repeats) Ymm辰rt辰辰ksesi t辰ss辰 esille tulevat asiat sinun tulisi valmiiksi osata restriktioentsyymien, geenikoettimien, k辰辰nteistranskriptaasin ja RNA-interferenssin (RNAi) k辰ytt旦tapa. RNA-interferenssi on syyt辰 osata siksi, ett辰 CRISPR-CAS on ik辰辰n kuin bakteereiden n辰kemys RNA-interferenssist辰. CRISPR-CAS on bakteereille ja arkeille ominainen puolustusj辰rjestelm辰 viruksia vastaan. Aluksi k辰ymme l辰pi joukon aiheeseen liittyvi辰 alak辰sitteit辰. Sitten katsomme yksityiskohtaisemmin, miten -j辰rjestelm辰 toimii bakteereissa. N辰iden j辰lkeen luomme yhteenvedon siit辰, miten CRISPR-CAS-puolustusj辰rjestelm辰辰 hy旦dynnet辰辰n geenitekniikan tutkimusv辰lineen辰. CRISPR CRISPR on geenisekvenssi bakteerin DNA:ssa. Se sis辰lt辰辰 toisaalta tasaisin v辰limatkoin sijaitsevia palindromisia toistojaksoja (repeats), mutta my旦s niiden v辰lisi辰 monimuotoisempia v辰likejaksoja (spacers). Seuraavaksi esittelen kummatkin n辰ist辰 erikseen. Palindromiset toistojaksot (repeats) SAIPPUAKAUPPIAS on palindromi, sill辰 se tuottaa saman sanan my旦s takaperin luettuna. Genetiikassa palindromisia eiv辰t ole samat, vaan toistensa kanssa pariutumiskykyiset em辰sjaksot, jotka sijaitsevat samassa DNA-juosteessa, joskus kaukanakin toisistaan. Jakson alussa olevan em辰sj辰rjestyksen on oltava peilikuva jakson per辰p辰辰ss辰 olevasta em辰sj辰rjestyksest辰. Esimerkiksi em辰sj辰rjestys ACAATGTTGCGGTCCATTGT on palindrominen (sinisell辰 merkityt em辰sj辰rjestykset ovat toistensa kanssa pariutumiskykyisi辰 em辰sj辰rjestyksi辰). Palindromiset geenisekvenssit tulevat genetiikassa vastaan muuallakin. Esimerkiksi kolmiapilan muotoon taipuvissa siirt辰j辰-RNA-molekyyleiss辰 on palindromisia jaksoja silmukoiden alku- ja loppukohdassa. Samoin aitotumallisten solujen geeneiss辰 esiintyvien introni-jaksojen alussa ja lopussa on toisiinsa sopivat palindromiset em辰sj辰rjestykset. N辰iden kohdalta sn旦rpit (snRNA) osaavat katkaista ja poistaa intronit. V辰likkeet (spacers) V辰likkeet (spacers) ovat CAS-proteiinin pilkkomia muutaman kymmenen nukleotidin mittaisia DNA-jaksoja, jotka bakteeri on alunperin irrottanut viruksista ja liitt辰nyt ne sitten oman genominsa osiksi. Geenisekvenssist辰, johon v辰likkeet liitet辰辰n, k辰ytet辰辰n nimityst辰 CRISPR (kuva 73). CRISPR-sekvenssi on bakteerin genomissa jakso, jossa v辰likkeet ja palindromiset toistojaksot vuorottelevat. CAS on proteiini, joka toimii endonukleaasina CAS on proteiinirakenteinen endonukleaasi, joka katkoo nukleiinihappoja (DNA ja RNA) solun sis辰ll辰 (siit辰 sanan alku: endo-). T辰ss辰 mieless辰 se muistuttaa restriktioentsyymej辰, jotka nekin
  • 2. ovat bakteereissa esiintyvi辰 endonukleaaseja. Yhteist辰 on my旦s se, ett辰 sek辰 CAS ett辰 restriktioentsyymit ovat bakteereiden puolustautumiskeinoja bakteeriofageiksi kutsuttuja viruksia vastaan. CAS-proteiineja tunnetaan useita erilaisia: esim. CAS9-pilkkoo kaksijuosteista DNA:ta, CAS13 yksijuosteista RNA:ta, CAS14 puolestaan yksijuosteista DNA:ta. Eri bakteerilajeissa esiintyy hieman toisistaan poikkeavia CAS-proteiineja. Uuden virusper辰isen DNA:n liitt辰minen CRISPR-sekvenssiin (kuva 73) Kuva 73 esitt辰辰 virusinfektion etenemist辰 bakteerisolussa, johon kyseinen virustyyppi on asettumassa ensimm辰ist辰 kertaa. Kyseinen virus on siis bakteerille tuntematon. T辰ss辰 tapahtumat etenemisj辰rjestyksess辰. a. Bakteeri tuottaa CAS1-nimist辰 endonukleaasia (kuvassa kohta 3). T辰m辰 proteiini katkoo nukleiinihappoja, siis DNA:ta tai RNA:ta. b. Kun bakteeriin tulee viruksen DNA:ta, CAS1 pilkkoo sen lyhyiksi p辰tkiksi (kuvassa 73 kohdat 1, 2 ja 3). CAS1 tunnistaa n辰m辰, sill辰 virus-DNA:ssa esiintyy tiettyj辰, juuri viruksille ominaisia em辰sj辰rjestyksi辰 ns. PAM-sekvenssej辰. c. CAS1 toimii yhteisty旦ss辰 CAS2-proteiinin kanssa. CAS2 istuttaa CAS1:n tuottamat lyhyet virusgenomijaksot bakteerin CRISPR-sekvenssiin. T辰ll旦in bakteeri "muistaa" infektion ja voi my旦hemmin puolustautua sit辰 vastaan. CAS1 ja CAS2 toimivat bakteereissa dimeerin辰, toisin sanoen toisiinsa liittynein辰. (Samaan tapaan dimeerin辰 toimivat soluissa vaikkapa ribosomin isompi ja pienempi puolikas. My旦s monet aitotumallisille soluille ominaiset transkriptiofaktorit ovat kaksiosaisia dimeerej辰.)
  • 4. Mit辰 ovat tracr-RNA (trans-activating CRISPR-RNA), CAS9, pre-crRNA (pre-CRISPR-RNA), crRNA (CRISPR-RNA) sek辰 sgRNA (single stranded guide-RNA) (kuva 74)? Bakteereissa CRISPR-CAS-koneisto edellytt辰辰 kolmen eri geenin samanaikaista toimintaa. Menetelm辰辰 k辰sittelev辰ss辰 keskustelussa n辰iden geenien tuottamat molekyylit tulevat usein esille. Siksi ne on tarpeen t辰ss辰 yhteydess辰 selitt辰辰, vaikka solubiologisessa tutkimuksessa osa bakteereissa toteutuvista geenitoiminnoista voidaankin ohittaa. T辰llaisia molekyylej辰 ja niit辰 koodaavia geenej辰 ovat tracr-RNA, pre-crRNA sek辰 CAS9. Lis辰ksi kuvan 74 selitetekstiss辰 esiintyv辰t k辰sitteet crRNA ja sgRNA. Tracr-RNA ja pre-crRNA-geeni tuottavat pelkki辰 RNA-molekyylej辰. N辰iden geenien koodaamat RNA-molekyylit eiv辰t siis etene translaatioon asti, joten ne eiv辰t koodaa proteiinirakenteita. CAS9-geeni sen sijaan tuottaa asianomaisen proteiinin CAS9. CAS9-proteiini ei pysty virusten torjuntaan sellaisenaan, vaan sen aktivoimiseen tarvitaan samanaikaisesti kahta edell辰 mainittua RNA-molekyylityyppi辰: tracr- (=Trans-Activating-CRISPR-RNA) ja crRNA (=CRISPR- RNA). crRNA syntyy pre-crRNA-molekyylin pilkkoutuessa lyhyemmiksi jaksoiksi. Tutkijat pystyv辰t valmistamaan tracr- ja crRNA-molekyylien yhdistelmi辰. N辰it辰 kutsutaan nimell辰 opas-RNA (sgRNA = single stranded guide-RNA). sgRNA aktivoi CAS9-proteiinin kiinnittym辰ll辰 siihen. SgRNA:ssa oleva geenikoetin voidaan muokata em辰sj辰rjestykselt辰辰n sellaiseksi, ett辰 se tunnistaa tutkijoiden haluamia DNA-jaksoja. CRISPR-CAS-geenist旦n toiminta bakteerille jo ennest辰辰n tuttujen viruksien torjunnassa (kuva 74) Koska CRISPR-CAS-toimintoihin osallistuvat geenit toimivat bakteerissa samanaikaisesti, alla olevassa kuvassa 74 esiintyv辰t numerot eiv辰t suoranaisesti kuvaa toimintojen tapahtumisj辰rjestyst辰. Siksi seuraavassa on tiivis, etenemisj辰rjestyst辰 paremmin ilment辰v辰 yhteenveto kuvan 74 tapahtumista (selitykset my旦s kuvassa). 1. Aluksi bakteeri tuottaa CRISPR-sekvenssist辰辰n (kohta 10) koko sekvenssin mittaisia pitki辰 pre-crRNA-molekyylej辰 (kohdat 3 ja 4). 2. Samanaikaisesti CAS9-proteiinia (kohta 6) koodaava geeni (kohta 5) tuottaa CAS9- proteiinia. 3. My旦s tracr-RNA:ta (kohta 8) koodaava geeni (kohta 7) transkriptoituu hiuspinni辰 muistuttavaksi RNA-molekyyliksi. Se sis辰lt辰辰 pre-crRNA-molekyyliss辰 esiintyvien palindromisten (kohta 1) jaksojen peilikuvia. Lis辰ksi tracr-RNA:ssa on jaksoja, joiden avulla se kiinnittyy CAS9-proteiinin poimuihin toimien samalla CAS9-molekyylin aktivaattorina (kohta 9) (tracr-RNA on lyhenne sanoista trans activating crRNA). 4. Toisiinsa liittynein辰 tracr-RNA ja CAS9 katkovat pitk辰n pre-crRNA-molekyylin lyhyiksi crRNA-molekyyleiksi (kohdat 2, 9 ja 11) palindromijaksojen osoittamista kohdista (crRNA tulee sanoista CRISPR-RNA).
  • 5. 5. Valmiit crRNA-molekyylit liittyv辰t CAS9-molekyyliin (kohta 11). Niiden sis辰lt辰m辰 em辰sj辰rjestys toimii 20 nukleotidin mittaisena geenikoettimena (kohta 12). T辰m辰 pystyy tarvittaessa tunnistamaan virusgenomissa olevan komplementaarisen em辰sj辰rjestyksen ja kiinnittym辰辰n siihen (kohdat 11, 12 ja 13). 6. Jos t辰llaisia em辰sj辰rjestyksi辰 sis辰lt辰v辰 virus-DNA-jakso ilmestyy bakteerisoluun, CAS9 kiinnittyy t辰h辰n, pilkkoo viruksen DNA:n toimimattomaksi ja est辰辰 viruksen lis辰辰ntymisen. 7. Tutkijoiden valmistamia crRNA-molekyylej辰 kutsutaan nimell辰 opas-RNA (sgRNA = single stranded guide-RNA). Opas-RNA-molekyyliss辰 molemmat bakteereissa esiintyv辰t RNA-jaksot (tracr- ja crRNA) ovat yhten辰 yhten辰isen辰 RNA-molekyylin辰. T辰m辰 pystyy sek辰 kiinnittym辰辰n CAS9-proteiiniin ett辰 toimimaan ohjelmoitavana geenikoettimena. sgRNA:n em辰sj辰rjestys voidaan nimitt辰in muokata tunnistamaan haluttuja DNA-jaksoja.
  • 7. Mihin bakteeri tarvitsee CRISPR-sekvenssin tuottamia geenikoettimia, jos kerran jo CAS- proteiinitkin toimivat restriktioentsyymien tapaan? Kun virus infektoi bakteerin, on torjunnan tapahduttava nopeasti. Usein k辰ykin niin, ett辰 jotkin virusyksil旦t onnistuvat ohittamaan CAS-proteiinit ja ehtiv辰t jo istuttamaan oman genominsa bakteerigenomin osaksi. Virusgenomin toimiessa solulimaan alkaa pursuta virukselle ominaisia l辰hetti-RNA-molekyylej辰. Mutta, jos CRISPR-lokus tuottaakin crRNA-molekyylej辰, joissa on viruksen l辰hetti-RNA- molekyyleihin n辰hden komplementaarinen em辰sj辰rjestys, tuloksena on RNA-interferenssi. crRNA vaientaa viruksen tuottamat l辰hetti-RNA-molekyylit tarttumalla em辰ksill辰辰n niihin ja infektio pys辰htyy t辰h辰n. CRISPR-CAS-j辰rjestelm辰ss辰 on toinenkin olennainen etu restriktioentsyymeihin verrattuna. Restriktioentsyymit ovat proteiineja. Niist辰 syntyy uusia muotoja vain, jos niiden rakennetta koodaavissa geeneiss辰 tapahtuu mutaatioita. Mutaatiopohjainen tuotekehittely on hidasta onnenkauppaa. CRISPR-CAS sen sijaan pysyy aina ajan tasalla alati muuttuvassa virusekosysteemiss辰. Ratkaiseva toimija on crRNA:ssa oleva em辰ssekvenssi, jolloin proteiinirakenteen muutoksia ei tarvita. Bakteerin jakautuessa CRISPR-CAS-geenist旦 siirtyy my旦s bakteerin j辰lkel辰isille. Siksip辰 niill辰 jo syntyess辰辰n on k辰ytett辰viss辰辰n kaiken kokeneiden esi-isiens辰 hankkima geneettinen immunologinen muisti. PAM-sekvenssi? CRISPR-CAS-asioissa vastaasi tulee ennen pitk辰辰 kirjainyhdistelm辰 PAM. PAM on lyhenne sanoista Proto-spacer Adjacent Motif (= spacerin esimuodon vieress辰 oleva em辰sj辰rjestys). Se on lyhyt, yleens辰 kolmen em辰ksen mittainen, sekvenssi, joka esiintyy virusgenomissa, mutta sit辰 ei esiinny bakteerin omassa DNA:ssa. CAS2 havaitsee virusgenomin nimenomaan PAM-sekvenssien perusteella. Lis辰ksi, CRISPR- sekvenssiin istutettavat SPACER-jaksot leikataan irti tarkalleen PAM-sekvenssin edest辰. Ennen istuttamista niit辰 kutsutaan proto-spacereiksi. PAM-sekvenssi辰 niihin ei kelpuuteta mukaan. PAM-sekvenssi辰 ei esiinny bakteerin omassa geneettisess辰 koodissa miss辰辰n, eik辰 sen CRISPR-lokuksessakaan. Jos esiintyisi, CAS-proteiinit pilkkoisivat virusten lis辰ksi my旦s bakteerin omaa DNA:ta. PAM:in perusteella bakteeri tiet辰辰 PAMauttaa nenuun juuri virusgenomia, ei vahingossakaan omaansa. CRISPR-CAS-menetelm辰t geenitekniikassa (Vertaa n辰it辰kin kuvaan 74) CRISPR-CAS on t辰m辰n hetken merkitt辰vin geenitekniikan tutkimusmenetelm辰. Menetelm辰ss辰 on paljon yht辰l辰isyyksi辰 restriktioentsyymien, geenikoettimien ja RNA-interferenssin kanssa. Erilaisia CAS-proteiineja tuotetaan nykyisin teollisesti ja niit辰 voidaan mikroinjektiona lorauttaa my旦s aitotumallisiin soluihin. crRNA:n tilalle voidaan t辰ll旦in tuottaa opas-RNA-jakso. T辰llaista ihmisen valmistamaa opas-RNA-sekvenssi辰 merkit辰辰n sgRNA (enkuksi single stranded guide RNA). Opas-RNA:n avulla CAS9 p辰辰tyy kohdesolun DNA:ssa sellaisen sekvenssin luo, jossa on opas- RNA:han sopiva em辰sj辰rjestys (RNA-DNA-pariutumiss辰nn旦n mukaan). CAS katkaisee vastaanottavan DNA:n kyseiselt辰 kohdalta. Lis辰ehtona on t辰h辰n asti ollut, ett辰 my旦s sopiva
  • 8. PAM-sekvenssi osuu tuolle kohdalle. (Kev辰辰ll辰 2020 uutisoitiin tutkijaryhm辰st辰, joka on onnistunut kehitt辰m辰辰n CAS-proteiinista my旦s sellaisen muodon, joka toimii l辰hes t辰ysin ilman PAM-sekvenssin asettamia rajoituksia (Near PAMless CAS). Pelkk辰 gRNA riitt辰辰 t辰ss辰 ohjaamaan CAS-proteiinin oikeaan kohtaan kohdesolun genomissa.) CAS tuottaa DNA:n katkaisukohtaan tylp辰n p辰辰n. Tylpp辰 kohta syntyy, kun DNA- kaksoisjuosteen molemmat puolikkaat katkeavat saman nukleotidiparin kohdalta. Tylp辰t vauriot tarkoittavat sit辰, ett辰 kromosomin jokin k辰sivarsi on kokonaan poikki. T辰ll旦in solu on vaarassa hukata kerralla suuren m辰辰r辰n geenej辰辰n. T辰llainen mutaatio on solulle erityisen vaarallinen. Ligaasi 4 niminen DNA:ta korjaava proteiini on erikoistunut korjaamaan juuri t辰llaisia vaurioita. Yleens辰 ligaasi 4 toiminnan tuloksena joitakin nukleotidej辰 kuitenkin katoaa. Koska geenin koko lukukehys muuttuu silloin virheelliseksi, geeni ei en辰辰 tuota toimivaa proteiinirakennetta. Tuloksena on knock out geeni (vaiennettu geeni). Knock out -geenien avulla voidaan tutkia, millainen merkitys jonkin geenin toiminnalla / puuttumisella on solulle tai eli旦lajille. Jos ligaasi 4 toiminta estet辰辰n ja soluun lis辰t辰辰n DNA-jaksoja, joiden molemmissa p辰iss辰 on katkaisukohdan molempiin puoliin sopivat lyhyetkin komplementaariset DNA-jaksot (kutsutaan my旦s homologisiksi jaksoiksi), katkaisupaikkaan saadaan helposti napsahtamaan siirtogeeni tai muu haluttu DNA-jakso. CRISPR-CAS-menetelm辰 on geenisiirtojen ja knock out -geenitekniikan yleisin ty旦kalu. Menetelm辰n kehittiv辰t Jennifer Doudna Berkleyn yliopistosta ja Max Planck instituutissa ty旦skentelev辰 Emmanuelle Charpentier. CRISPR- CAS9-menetelm辰n muita k辰ytt旦tapoja CAS-proteiinista on kehitetty my旦s muunnoksia, joista on poistettu sen kyky katkaista DNA:ta. T辰llaisia CAS-proteiineja kutsutaan kuolleiksi ja merkit辰辰n dCAS (dead CAS). dCAS-proteiiniin voidaan liitt辰辰 transkriptiofaktoreita joko suoraan CAS:iin tai pienen linkkerin (siis suorahkon aminohappoketjun) p辰辰h辰n roikkumaan. N辰in opas-RNA johdattaa transkriptiofaktorit haluttuihin geeneihin, jolloin niiden toimintaa voidaan s辰辰dell辰 halutulla tavalla. CAS:iin voidaan my旦s liitt辰辰 valoa hohtavia proteiineja (Green Fluorescent Protein GFP), jolloin n辰hd辰辰n, miss辰 solun tai tuman osassa tietty geeni toimii. Deaminaasi on entsyymi, joka vaihtaa DNA:n em辰ksi辰 toisiksi. Jos deaminaasi liitet辰辰n CAS:iin, voidaan geenien em辰sj辰rjestyst辰 muuttaa sgRNA:han ohjelmoiduista kohdista. Geeneihin voidaan my旦s lis辰t辰 kolmen em辰ksen mittaisia STOP-merkkej辰 kohtiin, joissa niit辰 ei luonnostaan sijaitsisi. CAS yhdistettyn辰 k辰辰nteistranskriptaasiin = Prime editing (Prime-muokkaus) K辰辰nteistranskriptaasi on retroviruksille ominainen proteiini, joka tekee transkription v辰辰rin p辰in, muodostaen RNA-molekyylist辰 sit辰 vastaavan DNA-molekyylin. Kaupalliseen levitykseen on tuotettu yhdistelm辰geeni, joka koodaa sek辰 CAS- ett辰 k辰辰nteistranskriptaasiproteiinia. Yhdistelm辰proteiini paitsi l旦yt辰辰 halutun katkaisukohdan muokattavasta DNA-jaksosta my旦s saman tien taikoo opas-RNA:n sis辰lt辰m辰n em辰sj辰rjestyksen
  • 9. DNA-molekyyliksi katkaisupaikan kohdalle. Siksi soluun ei lainkaan tarvitse injektoida siirtogeenisi辰 DNA-jaksoja. Melkoisen k辰tev辰辰! T辰m辰 Prime editing niminen menetelm辰 mahdollistaa perinn旦llisten sairauksien hoidon yksinkertaisesti niin, ett辰 opas-RNA:han valitaan terveen geenin mukainen em辰sj辰rjestys. Kovin pitkien DNA-jaksojen muokkaamiseen t辰m辰 menetelm辰 ei sovellu, sill辰 opas-RNA on vain 20 nukleotidin mittainen. Onneksi useimmat perinn旦lliset sairaudet ovat yhden tai muutaman nukleotidin mittaisia mutaatioita. Tyypillinen esimerkki yhden em辰ksen pistemutaatiosta on sirppisoluanemia. Prime-muokkauksen kehittiv辰t Harvardin yliopistossa ja MIT:ss辰 David Liu ja Andrew Anzalone tutkimusryhmineen. Geeniajurit (=Gene drives) Tavallisessa CRISPR-CAS9-tekniikassa siirtogeenisi辰 soluja tuotetaan mikroinjektoimalla CAS9-proteiinia, sgRNA:ta sek辰 siirtogeenin kopioita kohdesoluun. Injektiossa siirret辰辰n siis erikseen kolmenlaisia molekyylej辰: proteiinia, RNA:ta ja DNA:ta. Geenisiirron vaikutuksia seurataan usein vain yhdess辰 solussa. Tai, jos kyseess辰 on munasolu, joka seuraavaksi hedelm旦itet辰辰n, saattavat siin辰 esiintyv辰t siirtogeenit kopioitua alkion muihinkin soluihin alkionkehityksen aikana. Geeniajuriksi kutsutaan sellaista CRISPR-CAS9-mikroinjektiota, joka koostuu pelk辰st辰 DNA:sta. T辰ss辰 DNA-jaksossa, ns. kasetissa, on CAS-proteiinia, sgRNA:ta ja siirtogeeni辰 koodaava yhdistelm辰geeni. N辰in soluun siirtyy kokonainen geneettinen j辰rjestelm辰, jolla on kyky ketjureaktion tavoin istuttaa itsens辰 kohdekromosomiin, itsekopioitua t辰st辰 kromosomista uusiin kohdekromosomeihin ja saada sama siirtymisen ja kopioitumisen keh辰 jatkumaan loputtomiin my旦s siirtogeenisen yksil旦n j辰lkel辰isiss辰. Geeniajurissa voi olla esimerkiksi geeni, joka est辰辰 Anopheles-hyttysen hajuaistin kehittymisen. Kun geeniajurilla varustettu yksil旦 parittelee luonnonvaraisen hyttysen kanssa, j辰lkel辰inen saa kyseisest辰 vastinkromosomista yhden kappaleen geenimuunnellulta emoltaan, toisen taas luonnonvaraiselta hyttyselt辰. N辰in j辰lkel辰isest辰 tulee heterotsygootti geeniajurin suhteen. Kuitenkin, kun geeniajuri alkaa toimia, CAS9-proteiini ja luonnonvaraiseen geenimuotoon sopiva opas-RNA l旦yt辰v辰t toisensa. Opas-RNA johdattaa CAS9-proteiinin kyseiselle kohdalle luonnonvaraiselta hyttyselt辰 per辰isin olevassa luonnonvaraisessa vastinkromosomissa, jolloin CAS9 katkaisee t辰m辰nkin kromosomin. Geeniajurissa on mukana my旦s koodijakso, jolla solu saadaan korjaamaan katkaistu kromosomi k辰ytt辰en mallina kasettia itse辰辰n. N辰in muuntogeenin siirtokoneisto, mukanaan hajuaistin kehittymisen est辰v辰 geeni, asettuvat toiseenkin vastinkromosomiin. Samalla heterotsygoottinen genotyyppi muuttuu homotsygoottiseksi. Aina, kun t辰llainen hyttynen tekee j辰lkel辰isi辰, niiss辰 toteutuu sama kehityskulku. Siksi hajuaistin tuhoava geeniversio levi辰辰 kaikkiin populaation j辰lkel辰isiin nopeasti ja homotsygoottisesti eiv辰tk辰 hyttyset en辰辰 l旦yd辰 ihmisi辰 veriateriansa l辰hteiksi. Malariatartunnat saadaan v辰henem辰辰n ilman, ett辰 kalojen, sammakkoel辰inten, lintujen ja lepakoiden merkitt辰v辰n辰 ravinnonl辰hteen辰 toimivat hyttyset kuitenkaan katoavat luonnon ekosysteemeist辰.