際際滷

際際滷Share a Scribd company logo

In vitro modeli hepatotoksicnosti

I
improvemed

In vitro modeli hepatotoksicnosti

1 of 11
Improved Medical Education in Basic Sciences for Better Medical Practicing ImproveMEd U vitro modeli od hepatotoksinost
Materijali i metode koriste za prouavanje hepatotoksinosti in vitro
Izvor: http://cellbank.nibiohn.go.jp/legacy/celldata/jcrb0403.htm 1. Hepatocita stanine kulture Izvor: https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/HB-8065.aspx?geo_country=h
2. Tripan Test modrilom Izvor: https://bitesizebio.com/13687/cell-counting-with-a-hemocytometer-easy-as-1-2-3/ Izvor: http: //www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/cellcounting.html Izvor: https: //www.researchgate.net/figure/51450741_Trypan-blue- staining-Optical-microscopic-images-of-the-CT-26-cells- treated-with-a
3. Ulje crveni O bojenje Fiksirajte stanice s ohlaenim 4% paraformaldehidom. Remove fixative and rinse twice with cooled PBS. Add Oil red O to cells by using 0.2 micron syringe filter. Dobro isperite dH2O dok voda ne pone tei. Dodajte kontrastnu boju hematoksilina. Remove and rinse well with dH2O until the water runs clear. Leave the final dH2O rinse on the cells for microscopy. Lipidi e izgledati crveno, a jezgre e izgledati plavo. Izvor: https: //atomscientific.com/product/Oil_red_O_Stain_Kit
4. MTT Stanice ploe, obino u ploi s 96 ja転ica (npr. 2x103 stanica po ja転ici tijekom jednog tjedna eksperimenta). Nakon 24 h inkubacije, stanice tretirati s odgovarajuim vremenom. Remove medium and add fresh medium with 0.5 mg/ml MTT. Uklonite MTT medij. Dodati jednaki volumen 0,04 M HCl u izopropanolu ili 10% -tnoj otopini SDS-a kako bi se stanice otopile. Oitajte apsorbanciju na itau mikroploe. Ni転e vrijednosti apsorbancije oznaavaju smanjenje proliferacije stanica (u usporedbi s kontrolama), a vi邸e vrijednosti ukazuju na poveanje proliferacije stanica. Izvor: https: //www.slideshare.net/ChanderKNegi/mtt-cell-proliferation-assay
5. RT-PCR Pomije邸ajte 邸ablonu RNA, poetnice i DEPC- H2O do 14亮l u PCR epruveti i inkubirajte. Svakom uzorku dodajte 7,8-8 亮l reakcijske smjese i inkubirajte 50 minuta na 42 属 C. Svakom uzorku dodajte 1亮l inhibitora RNaze (10 亮g) i inkubirajte 20 minuta na 37 属 C. Dodajte 10 亮l svakog primera u PCR epruvete. Nakon toga dodajte 15,5 亮l master smjese. Dodajte 1-10 mg razrjeenja RT-PCR cDNA i DEPC H2O do 65亮l. Svaki uzorak prekrijte s 3 kapi mineralnog ulja i pokrenite uzorke. U PCR ciklusu
6. Zapadna upijajui SDS-PAGE electrophoresis Navla転ite membranu u MetOH i spu転vu i filter papir u prijenosnom puferu. Napravite sendvi za prijenos. Premjestite sendvi u ureaj za prijenos i dodajte prijenosni pufer u ureaj. Zatim postavite elektrode i premjestite ih 45-90 minuta. Blokirajte membranu sa 5% obranim mlijekom u TBST-u tijekom 1 sata. Dodati primarno antitijelo u 5% BSA i inkubirati na mukalici. Isprati membranu 3 puta s TBST i zatim inkubirati s preporuenim razrjeenjem konjugiranih sekundarnih antitijela u blokirajuem puferu. Ponovite postupak pranja. Detektirati membranu signalom koji proizvodi HRP- obilje転eno antitijelo. Izvor: https: //www.creative-diagnostics.com/Sample-Gel-Preparation.htm
Masne kiseline - in vitro modeli NAFLD 1. Dodajte obian medij 2. Dodati medij plus MetOH 99%. 3. Dodajte medij plus 0,33 mM otopine PA. 4. Dodajte medij plus 0,66 mM otopine PA. 5. Dodajte medij plus 0,66 mM otopine OA. 6. Dodajte medij plus 1.32 mM otopinu OA. Inkubirajte 24 sata i provedite gore navedene testove.
Hepatotoksinost inducirana acetaminofenom 1. Dodajte obian medij. 2. Dodati medij plus 100% DMSO. 3. Dodati medij plus 0,5 mM otopine APAP. 4. Dodajte medij plus 5 mM otopine APAP. 5. Dodajte medij plus 10 mM otopine APAP. 6. Dodajte medij plus 20 mM otopine PA. Inkubirajte 2, 6 i 24h i izvr邸ite gore navedene testove.
Hepatotoksinost izazvana amiodaronom i tamoksifenom 1. Dodajte obian medij. 2. Dodati medij plus MetOH 99%. 3. Dodajte medij plus 10 亮M otopinu amiodarona. 4. Dodajte medij plus 20 亮M otopinu amiodarona. 5. Dodajte medij plus 5 亮M otopine tamoksifena. 6. Dodajte medij plus 10 亮M otopine tamoksifena. Inkubirajte 24h i 48h i izvr邸ite gore navedene testove.

More Related Content

In vitro modeli hepatotoksicnosti

  • 1. Improved Medical Education in Basic Sciences for Better Medical Practicing ImproveMEd U vitro modeli od hepatotoksinost
  • 2. Materijali i metode koriste za prouavanje hepatotoksinosti in vitro
  • 3. Izvor: http://cellbank.nibiohn.go.jp/legacy/celldata/jcrb0403.htm 1. Hepatocita stanine kulture Izvor: https://www.lgcstandards-atcc.org/products/all/HB-8065.aspx?geo_country=h
  • 4. 2. Tripan Test modrilom Izvor: https://bitesizebio.com/13687/cell-counting-with-a-hemocytometer-easy-as-1-2-3/ Izvor: http: //www.ruf.rice.edu/~bioslabs/methods/microscopy/cellcounting.html Izvor: https: //www.researchgate.net/figure/51450741_Trypan-blue- staining-Optical-microscopic-images-of-the-CT-26-cells- treated-with-a
  • 5. 3. Ulje crveni O bojenje Fiksirajte stanice s ohlaenim 4% paraformaldehidom. Remove fixative and rinse twice with cooled PBS. Add Oil red O to cells by using 0.2 micron syringe filter. Dobro isperite dH2O dok voda ne pone tei. Dodajte kontrastnu boju hematoksilina. Remove and rinse well with dH2O until the water runs clear. Leave the final dH2O rinse on the cells for microscopy. Lipidi e izgledati crveno, a jezgre e izgledati plavo. Izvor: https: //atomscientific.com/product/Oil_red_O_Stain_Kit
  • 6. 4. MTT Stanice ploe, obino u ploi s 96 ja転ica (npr. 2x103 stanica po ja転ici tijekom jednog tjedna eksperimenta). Nakon 24 h inkubacije, stanice tretirati s odgovarajuim vremenom. Remove medium and add fresh medium with 0.5 mg/ml MTT. Uklonite MTT medij. Dodati jednaki volumen 0,04 M HCl u izopropanolu ili 10% -tnoj otopini SDS-a kako bi se stanice otopile. Oitajte apsorbanciju na itau mikroploe. Ni転e vrijednosti apsorbancije oznaavaju smanjenje proliferacije stanica (u usporedbi s kontrolama), a vi邸e vrijednosti ukazuju na poveanje proliferacije stanica. Izvor: https: //www.slideshare.net/ChanderKNegi/mtt-cell-proliferation-assay
  • 7. 5. RT-PCR Pomije邸ajte 邸ablonu RNA, poetnice i DEPC- H2O do 14亮l u PCR epruveti i inkubirajte. Svakom uzorku dodajte 7,8-8 亮l reakcijske smjese i inkubirajte 50 minuta na 42 属 C. Svakom uzorku dodajte 1亮l inhibitora RNaze (10 亮g) i inkubirajte 20 minuta na 37 属 C. Dodajte 10 亮l svakog primera u PCR epruvete. Nakon toga dodajte 15,5 亮l master smjese. Dodajte 1-10 mg razrjeenja RT-PCR cDNA i DEPC H2O do 65亮l. Svaki uzorak prekrijte s 3 kapi mineralnog ulja i pokrenite uzorke. U PCR ciklusu
  • 8. 6. Zapadna upijajui SDS-PAGE electrophoresis Navla転ite membranu u MetOH i spu転vu i filter papir u prijenosnom puferu. Napravite sendvi za prijenos. Premjestite sendvi u ureaj za prijenos i dodajte prijenosni pufer u ureaj. Zatim postavite elektrode i premjestite ih 45-90 minuta. Blokirajte membranu sa 5% obranim mlijekom u TBST-u tijekom 1 sata. Dodati primarno antitijelo u 5% BSA i inkubirati na mukalici. Isprati membranu 3 puta s TBST i zatim inkubirati s preporuenim razrjeenjem konjugiranih sekundarnih antitijela u blokirajuem puferu. Ponovite postupak pranja. Detektirati membranu signalom koji proizvodi HRP- obilje転eno antitijelo. Izvor: https: //www.creative-diagnostics.com/Sample-Gel-Preparation.htm
  • 9. Masne kiseline - in vitro modeli NAFLD 1. Dodajte obian medij 2. Dodati medij plus MetOH 99%. 3. Dodajte medij plus 0,33 mM otopine PA. 4. Dodajte medij plus 0,66 mM otopine PA. 5. Dodajte medij plus 0,66 mM otopine OA. 6. Dodajte medij plus 1.32 mM otopinu OA. Inkubirajte 24 sata i provedite gore navedene testove.
  • 10. Hepatotoksinost inducirana acetaminofenom 1. Dodajte obian medij. 2. Dodati medij plus 100% DMSO. 3. Dodati medij plus 0,5 mM otopine APAP. 4. Dodajte medij plus 5 mM otopine APAP. 5. Dodajte medij plus 10 mM otopine APAP. 6. Dodajte medij plus 20 mM otopine PA. Inkubirajte 2, 6 i 24h i izvr邸ite gore navedene testove.
  • 11. Hepatotoksinost izazvana amiodaronom i tamoksifenom 1. Dodajte obian medij. 2. Dodati medij plus MetOH 99%. 3. Dodajte medij plus 10 亮M otopinu amiodarona. 4. Dodajte medij plus 20 亮M otopinu amiodarona. 5. Dodajte medij plus 5 亮M otopine tamoksifena. 6. Dodajte medij plus 10 亮M otopine tamoksifena. Inkubirajte 24h i 48h i izvr邸ite gore navedene testove.