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Enrico Pieroni
ep@crs4.it
27 Maggio 2015
Modellistica molecolare
e applicazioni alla sclerosi multipla

Outline

Cos'è un modello?

Cos'è una simulazione?

L'importanza delle scale temporali e spaziali

Il riconoscimento antigenico

La sclerosi multipla

Il mimetismo molecolare

Riconoscimento molecolare in sclerosi multipla

Risultati delle simulazioni sulle proteine collegate alla
sclerosi multipla

Modello
Situazione “reale”.
Modello:
concettualizzazione,
semplificazione della
realtà, spesso con
formalismo matematico
(grafo) ... che cattura aspetti essenziali
(connettività) e
elimina quelli non rilevanti
(distanze, geome_
tria, direzioni, ...)
per gli scopi che ci
si prefigge [sele_
zione caratteristiche, gradi di libertà]. Idea: Markus J. Buehler (MIT)

Simulazione
Cosa succederebbe se cavalcassi un
raggio di luce? (A. Einstein, 1905)

Simulazione
Soluzione (delle equazioni) del modello.
Rappresenta una sorta di esperimento virtuale.
Perchè simulare? Gli esperimenti talvolta sono impossibili,
costosi, pericolosi, richiedono tempi lunghi, alcune scale
temporali e spaziali di interesse non sono accessibili, ...
Inoltre, la simulazione consente di: interpretare i dati
“sperimentali”, aiutare a capire i meccanismi sottostanti e predire
nuove proprietà del sistema reale, suggerire/selezionare
esperimenti, aiutarne la progettazione, ...
La simulazione offre un quadro dinamico, dove è possibile
cambiare i parametri del sistema alla ricerca di proprietà
emergenti (sistemiche).

Simulazione al Calcolatore
Oggi la simulazione avviene spesso tramite computer, ... e
la velocità di simulazione scala con la potenza computazionale!
Per cui oggi è possibile simulare sistemi complessi, quindi
interessanti, quali i sistemi biologici.
Blue Gene 2011,
circa 700 TeraFLOPS:
700 000 000 000 000 op./s
1 giorno
ENIAC 1946, 5 000 operazioni/s
circa 2.5 milioni di secoli

Sistemi a diverse scale L-T
Elaborazione da idea di Aatto Laaksonen (Stokholm U.)
ps
ns
μs
fs
m = 1 / 1 000
μ = 1 / 1 000 000
n = 1 / 1 000 000 000
p = 1 / 1 000 000 000 000
f = 1 / 1 000 000 000 000 000
psps
1 Å
Cristallografia a raggi X, spettroscopia NMR,

Simulazione a diverse scale
Simulazioni da
Principi Primi
(Meccanica
Quantistica)
Simulazione Classica
(Meccanica Molecolare)
Simulazione di strutture a scala
mesoscopica, su tempi
biologici, della Soft Matter
(Coarse Grained MM)
Cortesia di Aatto Laaksonen (Stokholm U.)
Dimensioni
“Tempo tipico dei moti da considerare”

μicro – Macroscopico

Simulazione molecolare: genera tante configurazioni del
sistema, misura le proprietà statistiche e (tramite la fisica
statistica) le collega a quelle macroscopiche

Alcuni parametri importanti:

Scala temporale dei moti inclusi nel modello (condiziona il passo
di risoluzione delle equazioni)

Scala temporale degli effetti osservabili di interesse su scala
macroscopica (condiziona il tempo totale di simulazione)

Dimensione del sistema (condiziona il tempo totale di
simulazione)
Comportamento μ:
moto atomico e
molecolare,
forze interatomiche ed
intermolecolari
Comportamenti M osservabili:
proprietà termodinamiche (T,P,V),
di trasporto (velocità di diffusione),
ottiche, ...
Comportamento M bio:
Legame, modifiche strutturali,
attivazione recettore,
diffusione farmaci
attraverso membrana, ...

Applicazioni della Modellistica Molecolare
Struttura delle proteine, per omologia con strutture cristallografiche.
Interazione Proteina:Molecola, ad esempio Farmaco:Recettore.
Interazione Proteina:Peptide, ad esempio in segnalazione e
regolazione cellulare, riconoscimento degli antigeni (p:MHC).
Proteina:Proteina ad es. pMHC:TCR, metabolismo,
segnalazione cellulare, funzionamento muscolare.
Proteina:Lipide, ad es. Recettore:Lipide, segnalazazione cellulare,
sistema immunitario, sindrome metabolica.
Proteina:Carboidrato, ad es. in infiammazioni, riconoscimento
patogeni, adesione e segnalamento cellulare.
Proteina:Polimero, ad esempio per il trasporto dei farmaci.

Nella SM il rivestimento mielinico dei nervi
viene “attaccato” dalle cellule del sistema
immunitario, compromettendo la
trasmissione degli impulsi nervosi ...
... con danni
neurologici
importanti e
relative
disabilità.
Cos'è la Sclerosi Multipla

Fattori Genetici
Evidenza:
Gemelli monozigotici: 25-30%
Gemelli dizigotici: 3-4%
MHC (HLA): principale
determinante genetica
Quali sono le cause?
Fattori Ambientali
(sconosciuti!)
-Esposizione solare (Vit. D),
-Agenti patogeni, part. virus
di Epstein-Barr (EBV),
Micobatterio MAP
-Fumo.
Cocco, E., Sardu, C., Pieroni, E., et al. 2012 PLoS One
International Multiple Sclerosis Genetics, C., Wellcome Trust Case Control, Sawcer, S.,et al. 2011 Nature
Inaugurazione AA 2014-2015 Prolusione della Prof.ssa MG Marrosu, “Immunità in Sardegna: dono degli dei
o mela avvelenata?” http://www.unica.it/UserFiles/File/Utenti/verdeoro/2014/12/prolusione2014_marrosu.pdf

http://www.drbriffa.com/2011/10/20/why-might-shift-workers-be-at-increased-risk-of-multiple-sclerosis/
Cocco E, et al. 2013 PLoS ONE 8(4): e59790.
Distribuzione Geografica
Prevalenza = numero di casi in
una determinata popolazione ad un
dato istante

T Cell Signalling Group. Oxford U.
Interazione linfocita T – Cellula
specializzata che presenta l'antigene
APC = principalmente macrofagi,
cellule dendritiche e linfociti B, ...

CMAJ July 18, 2006 vol. 175 no. 2 165-170
TCR : [peptide : MHC]
Ecco qua il nostro
attore principale
Peptide o
Antigene

PDB 3RDT Crystal Structure of 809.B5 TCR + MHC Class II I-Ab/3k peptide
TCR : [peptide : MHC] Struttura Cristallografica
T Cell
peptide
MHC
Tasca di
legame

Presentazione antigene (o peptide)
Craig R. Roy-Nature 425, 351-352 (25 September 2003)
Peptidi generati
in continuo dagli
enzimi proteolitici
che tagliano
agenti
patogeni e
le proteine del
corpo;
le proteine
MHC li
trasportano
e li presentano
all'esterno,
in attesa dei linfo-
citi T che riconos-
cano il complesso
binario tramite
TCR e avviino
la reazione
immunitaria.

La Dinamica
Molecolare
HLA-DRB1:1501
- EBV
La DM è, in pratica,
un filmino, con tante
informazioni visive
sulle configurazioni
del complesso, che
vanno poi
quantificate
attraverso l'analisi
statistica di tutti i
fotogrammi.

Investigare la plasticità del sistema peptide-
MHC, confrontare i risultati per peptidi del
proprio corpo e provenienti da agenti patogeni,
correlare le caratteristiche strutturali e
dinamiche del complesso peptide-MHC alla
suscettibilità verso la malattia, utilizzando
tecniche di Dinamica Molecolare.
Il nostro Obiettivo

In particolare ... mimetismo molecolare
C. Münz, J.D. Lünemann, M.T. Getts, S.D. Miller, Nature Reviews Immunology 9, 246-258 (2009)
Alcune proteine mieliniche self (MBP, MOG, PLP, …) hanno similarità di
sequenza, strutturale o funzionale con proteine di agenti patogeni
nonself (EBV/EBNA-1, MAP).

Le prime simulazioni molecolari

RMSD
(root mean square deviation)
distanza media fra gli atomi fra due strutture sovrapposte
(tipicamente tali atomi sono Cα del backbone-ossatura, e la
sovrapposizione è ottenuta in maniera rigida ed ottimale)
In un filmino di DM, le due strutture
sono quella iniziale (frame a t=0) e
quella ad un certo istante (frame al
tempo t)
Distribuzione (Istogramma)
Quante volte un dato valore è stato
osservato in un frame del filmino
generato dalla Dinamica Molecolare.
Negli esempi successivi: RMSD e
larghezza della tasca di legame

Stabilità globale
e Flessibilità per
DRB1*15:01 pred.
& *16:01 prot.
La proteina predisponente libera
è più flessibile, 1o
indizio che esso
può legare in maniera simile
entrambi i peptidi, come
confermato dal picco comune.
RMSD vs tempo di simulazione
Distribuzione RMSD

Flessibilità locale della tasca
… sulle tracce di Yaneva, 2010

DRB1*15:01 (predisponente)
(a)
(b)
(c)
Nella struttura
originale PDB
+ MBP: profilo
unimodale, stretto
+ EBNA1: in D1, D2
multimodale, +largo
D3: picco comune
per MBP, EBNA1
Proteina libera:
(a) recettivo MBP
(b) recettivo EBNA1
(c) libero

DRB1*16:01 (protettivo)
+MBP:
distribuzione
unimodale
+EBNA: in D1,
D2 multimodale,
+larga
EBNA-1
+flessibile in D1-
3
EBNA-1, Free
profili simili in
D3, D4
D1
D2
D4D3

Legami idrogeno
ed
interazioni di stacking

Entrambe le proteine MHC
(predisponente e protettiva) col peptide
MBP: reti di interazione simili
sia per i legami H (tranne R71-K93 in *15:01)
che per le IS

Le due proteine MHC (pred. e prot.) col
peptide EBNA: profili di
interazione diversi sia per HB che
SI (Y78-H407 in *15:01)

Energie di legame
... confermano che i) la proteina
predisponente lega il peptide self
ed il nonself in maniera simile, e che
ii) il contrario vale per la proteina
protettiva.

Primo “take home message”

La proteina MHC DR2 predisponente
lega in maniera simile sia il peptide derivato da
MBP che quello derivato da EBV, ...

... mentre la proteina protettiva si lega più
debolmente al peptide virale e mostra
configurazioni di legame nettamente distinte
coi due peptidi.

Questo è in accordo con l'ipotesi di
mimetismo molecolare: il peptide self
(derivato dalla mielina) e quello nonself (virale)
hanno somiglianza strutturale e
funzionale nel legarsi alla

Supporto Sperimentale
I pazienti EBV+ hanno risposta immunitaria anticorpale (mediata dai linfociti B)
simile nei confronti dei peptidi EBNA1 ed MBP.
Anticorpi reattivi contro il peptide MBP sono cross-reattivi contro il peptide EBNA1.
EBNA1 ed MBP non hanno omologia di sequenza, quindi devono condividere
omologia conformazionale quando sono presentati dalla proteina MHC.

Estensionealleproteine
MHC“ditipo”DQ

Modellistica molecolare e applicazioni alla sclerosi multipla

Caratteristiche DRB1-DQB1 (WT)
DRB1
Mimetismo molecolare
DQB1
Complementarità

Altre analisi ...
Un breve accenno: l'analisi delle reti di
interazione idrogeno e di
stacking, le distribuzioni di
larghezza locale della tasca di
legame, sia sulle proteine WT che su
quelle mutanti, mostrano i dettagli del
processo molecolare di riconoscimento da
parte delle proteine DRB1 e DQB1, in
particolare della specificità relativamente al
tipo di antigene (self/nonself) e di tessuto, e
nel loro complesso confermando l'ipotesi di

Secondo “take home message”

APC con proteine protettive presenta
complessi con MBP stabili e duraturi sia
attraverso la proteina DRB1 che la proteina
DQB1, ...

... e complessi con EBNA1 di vita intermedia
solo attraverso la proteina DQB1.
Livelli più alti di presentazione dell'antigene
Efficienza di attivazione superiore (forse)
tramite percorsi di attivazione del TCR
complementari.

Le proteine predisponenti DRB1 hanno in parte
perso l'abilità di discriminazione self/nonself,
per cui
la predisposizione verso la SM può

Terzo “take home message”
Le proteine DRB e DQB sembrano avere un sistema di
riconoscimento complementare e specifico a seconda
del tessuto.
Dato che: i) l'espressione delle proteine DRB1 e DQB1 è
dipendente dal tessuto e ii) il mimetismo molecolare
richiede una attivazione periferica dei linfociti T prima della
riattivazione dei linfociti autoreattivi a livello del sistema
nervoso centrale ....

Il ruolo della proteina DRB1 potrebbe essere
maggiormente rilevante nella fase di attivazione
periferica, ossia di “incontro” iniziale con il fattore
scatenante ambientale, mentre ...

... il ruolo della proteina DQB1 potrebbe essere
fondamentale nella riattivazione periferica del repertorio
di linfociti T clonalmente espansi a partire dal primo
incontro, che andrebbero poi “all'attacco” della mielina.

Supporto sperimentale del ruolo DRB/DQB

Progetto di piccoli peptidi ...
che modulino l'affinità verso peptidi self/nonself,
tramite l'aumento o la soppressione del carico
del peptide nella tasca MHC,
... che agiscano selettivamente rispetto ai tessuti
(e quindi alle fasi di arruolamento erroneo dei linfociti T).
Integrazione di dati fenotipici, clinici, medici, genetici, metabolici e
di modelistica, al fine di realizzare un
modello individuale di rischio nei confronti della
malattia e personalizzare il trattamento terapeutico.
Potenzialità in Terapia

Conclusioni
La modellistica computazionale a scala molecolare
consente di:

Integrare le informazioni genetiche e “sperimentali”;

Esplorare potenziali meccanismi funzionali nella
SM;<
In prospettiva:

Aiutare il progetto di molecole e peptidi terapeutici;

Suggerire nuovi “esperimenti”.
Come è tipico per i sistemi biologici, non abbiamo
una teoria generale, quanto visto si applica a
determinate proteine (pur collegate alla malattia) e
determinati peptidi, occorreranno altri esperimenti,

(Modeling) Limits/Perspectives

MS: + alleles, + peptides, TCR;

FMS: less relevant lysoPCs, in general interaction of
molecules diet-derived with biological processes;

CASQ2: cardiac isoform;

Therapeutical peptides, tissue- and antigen-selective,
modulating autoimmune response;

Molecules interfering with PAFR & modulating pain
response;

FMS bio-markers from metabolic profiles:

Clinical and phenotypical data integration;

Individual Risk model, Prognosis and Drug response in
MS;

Un nuovo potenziale antigene: il MAP

PCA
Ogni struttura a un determinato istante (frame) è quindi
rappresentata dalla combinazione lineare dei due primi
autovettori = un punto sul piano (v1,v2).
Osserviamo che i punti si raggruppano secondo patterns che
possono essere associati alle caratteristiche che portano alla
malattia (ed ovviamente anche alle configurazioni chimiche
Per ciascun frame del film:
1) calcolare la matrice di
covarianza σ degli angoli
diedrici del legame
petidico.
2) effettuare una PCA,
ossia diagonalizzare σ e
identifcare gli autovalori più
grandi ed i corrispondenti
autovettori.

Dinamica dell'acqua ed Energia di legame
Ci sono più molecole
d'acqua attorno alle
proteine protettive
Valori di entropia maggiori
per MAP che lega le
proteine predisponenti

S.H. Kim, M.H. Lamm, Polymers 2012, 4(1), 463-485
Scalespazialietemporali

DR2
Sequence-based clustering
Two clusters: pos. 9 (W/E) & 133 (L/R)
In the new cluster: 74 (P4 R/E) &
57 (P9 D/A) distinguish
03:01 and 14:01 NEW

*03:01 vs *14:01
P4
P4, P9 role
P4>P9 (Barcelos)
K93: primary TCR
contact point
(Wucherpfennig)
Total accessible area

WT DRB1-DQB1:p Energie di Legame
Level of discrimination
self/nonself:
 DRB1-prot: high
 DQB1-prot: intermediate,
 DRB1-pred: low
 DQB1-pred: intermediate to
high
w/ 'opposite sign'
 La proteina DRB1-
DQB1 protettiva ha affinità
maggiore per MBP che
per EBNA;
 e vale l'opposto per la
proteina predisponente.

Discussion
*03:01, *04:01: very similar by sequence
but striking functional differences,
particularly binding MBP.
Synergistic interactive effect: resistance
allele *14:01 binds MBP weaker at P9 and
stronger at P4 pos. 70 than susceptibility
allele *03:01.
*03:01 shows a quite distinct P4 polar
environment, respect to *14:01.

Mimetismo Molecolare
Alcune proteine mieliniche (MBP, MOG, PLP, …) hanno regioni
con sufficiente similarità di sequenza, struttruale o funzionale a
proteine di agenti patogeni (EBV/EBNA-1, MAP).
(Chastain
2012)

Gruppo serologico DR2 – Sequenze aa
Val86: interagisce con piccoli res alifatici
Gly86: interagisce con grandi res alifatici
Ala38: interagisce con residui +grandi
Val38: interagisce con residui +piccoli
V
Tipo aa --> volume e polarità tasca
--> tipo di legame col peptide
--> “forza” dell'interazione col TCR

Gli attori/ici principali del “film”
MBP(85-98)
EBNA-1(400-413)
Dimero con 2
catene A, B,
ciascuna con
2 domini α, β
Residui
specifici per
ancoraggio e
riconoscimento
profili di
legame del
peptide

�ݺ�ߣ

Modellistica molecolare e applicazioni alla sclerosi multipla

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