ݺߣ

ݺߣShare a Scribd company logo

Multi̇pl sklerozda akson dahi̇li̇nde mi̇tokondri̇al deği̇şi̇kli̇kler

•
•
Oğuzhan Ay
Oğuzhan Ay

Multipl Skleroz patogenezinin mitokondri açısından açıklanması.MS'li aksonlarda meydana gelen mitokondrial fonksiyon değişiklikleri ve bu değişimlerin nasıl tedavi hedefi haline gelebileceğini anlatan Oxford Brain Journal'dan makale çevirisi.

1 of 6
Download to read offline
MULTİPL SKLEROZDA AKSON DAHİLİNDE MİTOKONDRİAL DEĞİŞİKLİKLER GİRİŞ Multipl skleroz genç erişkinlerde nontravmatik nörolojik bozukluğun en sık nedenidir;bununla birlikte multipl sklerozda;akson dejenerasyonunda enerji eksikliği sorumlu tutulmuş olup,hastalık progresyonuyla patolojik değişikler koreledir. Demiyelinizasyonu ve sonraki değişen ilerlemedeki kayıpları takiben; aksonların demiyelinize kısımlarında,sodyum kanal sayısı artışı olmak üzere biri değişiklik görülür.İntra aksonal iyonik dengenin işlerliği ve sodyum akımına bağlı;membran dinlenme potansiyeli,artan sodyum kanalları üzerinden ,MSS’de enerjinin en büyük tüketicisidir.Akson enerji tüketimindeki bu artış;myelin basic proteini defektli shiverer farelerinde yapılan deneysel çalışmalarda;mitokondrial yoğınluk ve aktivite artışının görülmesiyle anlaşılır. Mitokondri;ATP’nin en etkili üreticisidir ve apoptozda,reaktif oksijen radikalleri sentezinde ,kalsiyum homeostazında rol oynamaktadır.Muhtemel inflamasyon,travma,iskemiyi içeren bir dizi etki nedeniyle akson dejenerasyonunda;intraaksonal kalsiyum dengesizliği görülür. Mitokondirial solunum zinciri;mitokondrial membran içine lokalize olup compleks I,II,III,IV ve doğrudan ATP sentezinden sorumlu compleks V’den oluşur.Mitokondrial solunum zincirinin su taşıyıcısı compleks IV- veya sitokromoksidaz COX-%90 üzerinde oksijenin suya dönüştüğü yerdir. Konsantrasyonuna ve maruz kalma süresine bağlı olarak,MS lezyonlarında olduğu gibi complek IV NO hedefidir ve geri dönüşümsüz inhibe olabilir.İnflamatuar çevrelerde;mitokondiral solunum zincir aktivitesi non-nükleler DNA-mitokondirial DNA’ya zarar veren subunitlerin alımı ve postranskripsyonel modifikasyonu etkileyen reaktif oksijen radikallerine bağlı bozulmuş olabilir. Mitokondrinin tüketimi ve solunum zincirindeki defekt,sadece enerji defisitinin sebebi değildir;kalsiyum tutma kapasitesini bozan sitotoksik hasarın aksonlardaki hassaslığını artırabilir. Artan kanıtlar multipl skleroz patogenezine mitokondriyi yerleştiriyor. -Mitokondrial solunum zincir kompleks I ve III aktivitesi;mitokondrideki nükleer DNA kodlu transkriptleri proteinlerin azaldığı non lezyonel motor kortekste düşer. -Compleks I aktivitesindeki düşüle ilişkili olarak;kronik aktif beyaz cevher lezyonlarında mitokondrial DNA için oksidatif hasar söz konusudur. -İlginç olarak;kompleks IV aktivitesi ve mitokondrial DNA kopya sayısı,muhtemelen kompansasyonla ilişkili olacak şekilde kronik aktif lezyon homojenatlarında ve normal görünümlü gri cevher nörönlarında artmıştır. Alıntı yapılan çalışma,compleks IV aktivite eksikliğinin kronik aktif lezyonlarda aksonal dejenerasyonda major bir rol oynadığını öne sürmektedir. METOD A)OTOPSİ DOKULARI VE LEZYONLARIN KALSİFİKASYONLARI 9 MS vakasından;posterior frontal lobdan 6 makroskopik lezyon;5 MS vakasından servikal ve /veya torasik spinal kordan 6 makroskopik lezyon ,Luxol Fast Blue dağılımı ve kriostat bölümlerinde proteolipidoprotein ve HLA-D eksprasyonu boyanmasına bağlı ;daha önceki prtokollere uygun olarak kronik aktif ve yavaş ilerleyen kronik aktif lezyonları şeklinde tanımlanmıştır. MS vakaları için ölüm sebebi;pnomoni(n=7),kardiak yetersizlik(n=1),sepsis(n=2) ve kontrol grubu için kardiyopulmoner arrest ve pnomoniydi. B)İMMÜNOHİSTOKİMYA
Çift ve üçlü etiketleme immunflorasan etiketleme için;anında dondurulmuş bölümler,hidrojen peroksit olmadan ,immünohistokimya için olduğu gibi hazırlanmış bir alt sınıfı belirli bir ikincil antikorlar doğrudan florokromlar ile moleküler prob kullanılarak konjuge edilmiştir. Uygun kontroller,çapraz reaktivite ve çiftli- üçlü etiketlenme deneylerinde spesifik olmayan bağlanmayı dışlamak için gerçekleştirilmiştir. C)COX VE SDH HİSTOKİMYASI Beyin ve spinal kord doku blokları ,belirili bir kimyasal işlemden geçtikten sonra COX ortamına inkübe edildi.İnkübasyon sonrası,akson ve mitokondri çift immünoflorans histokimya kullanılarak tanımlandı.Compleks II aktivitesini tespit etmek için SDH ortamına inkübe edildi,sonrasında COX ortamı içinde 50 dakika süreyle yıkandı. COX histokimyasının tanımlanmasının ardında ,aksonlardaki kompleks IV aktivitesini tanımlamak için ;protokollere uygun olarak nörofilament ve amiloid prekürsör proteine karşı antikorlarla immunflorasan olarak etiketlendi. D)COX ELEKTRON MİKROSKOPİSİ 1 mm kalınlığında normal görünümlü beyaz cevherden ve spinal kord lezyonlarından disseke edilen doku örnekleri;CompleksIV aktivitesini tespit etmek adına protokolüne uygun belirli bir işlemden geçirilmiş ve Philips CM 100 EM ile incelenmiştir. E) WESTERN BLOTTİNG Homojenatları hazırlamak için;CON’dan (n=6) beyaz cevher,normal görünümlü beyaz cevher (n=6) ve posterior frontal korteksten kronik inaktif multipls skleroz lezyonları (n=6);kriostatkesitlerinden 20 mm kalınlıkla, dikkatlice;scalpel ve 250 mM sukroz,2mM HEPES ve 0.1 mM EDTA katılmış homojenize tampon kullanılarak çıkarıldı. Homojenatlardaki proteinlerin elektrofonetik olarak 4 derecede 0.45 mm poliviliden florür membranlara dönüştürülmesinin ardından bir dizi işlem sonrası ; B-actin,porin fosforile total nöröfilament,sintafilin ve compleks II alt birimine karşı primer antikorlarla inkübe edildi. Adından yapılan çözeltilerle yıkanma ve inkübasyon işlemleri sonrası ECL plus Western Blotting kullanılarak tespit edildi. F)NÖRON KÜLTÜRÜ Vahşi tip fare embrionik kök hücresi çizgisinden farklılaşmış nöronları kullanılıp,yapılan işlemlerle olgunlaştırılması sonrası,;olgun nöronlar sodyum azid-spesifik kompleks IV inhibitörü- ve glutamatın çeşitli konstarasyonlarına tek veya birlikte maruz bırakıldı;bu işlemlerle subletal sodyum azid ve glutamat konsanrasyonu tespit edildi. Böylelikle nöron kültürlerinin 10 mM sodyum azid maruziyetinin compleks IV aktivitesini %86 oranında düşürdüğü spektrofotometre kullanılarak tespit edildi. G)MİKROSKOPİ Mitokondrial makrofaj yoğunluyla ilişkili kompleks IV aktivite analizi için;COX histokimyasal ve alan başına HLA immünohistokimyasal boyanmaının dört parlak alan gri ölçekli görüntüleri;seri bölümlerinde 20 büyütme ile elde edildi. Doku kesitlerinde akson dahilinde mitokondrial kitele analizi için;porin ,sintafilin ve aksonal markırlarla üçlü etiketlenmiş kesitler;63 xoil lense ve Leicolaser scanning mikroskop kullanılarak görüntülendi. Nöron kültürlerinde aksonlar,B-tubulin immunoflrasan etiketiyle tanımlandı ve 50 B- tubulin pozitif akson SMI32 veya amiloid prekürsör protein ile kapak silip başına,bitişik olanlarda görüntülendi. F)MİTOKONDRİAL KİTLENİN ve AKSONAL KOMPLEKS IV’ün KANTİTASYONU Geniş aksonlardaki compleks IV aktif bileşenlerini tanımlamak için ,SMI31,SMI32,APP immünoflorasan yoluyla
etiketlenmiş aksonların ana hattı,COX histokimyanın parlak alan resminin üzerine bindirildi ardından;dansiteometri ve Zeiss Axio Vision sürüm 4.6 kullanılarak yoğunlukla ilgili daha fazla analize tabi tutuldu.Ek olarak,COX histokimyasal ürünlerinin dansitometrik analizi;doku kesitlerinde kompleks IV aktivitesinin değerlendirilmesi için geçerli bir araçtır. Mikroglial/makrofaj ile compleks IV aktivitesinin (ters) korelasyonu için;COX histokimyasal boyamanın tüm 20x gri ton görüntülerinin dansitometrik değeri,normal görünümlü beyaz cevherin değerine göre belirlendi,;iç kontrol olarak lezyonun karşılık gelen değerinden çıkarıldı. G)İSTATİSK SPPS version 14;demylenize ve mylenize aksonlarda compleks IV aktivitesi ve porin immün reaktivitesinin kıyaslanması için kullanıldı. SONUÇLAR Alıntı yapılan çalışma;MS ve aksonal dejenreasyonda ,mitokondrial defektin önemli olduğu düşünülerek kronik aktif ve inaktif lezyonlarda mitokondrial aktivite ve kitle çalışılmıştır. 1)APP ve SMI32 İMMÜNREAKTİF HASARLI DEMYLENİZE AKSONLARDA COMPLEKS IV DEFEKTİ VARDIR. APP pozitif aksonlardan compleks IV aktivitesi; SMI31 pozitif myelinize ve demyelinize kontrol grubu beyaz cevher ve inaktif kronik lezyon aksonlarıyla kıyaslandığında anlamlı şekilde düşüktür. Ayrıca compleks IV aktivitesinde anlamlı düşüklük;kronik lezyonların inaktif alanlarının SMI32 pozitif kronik demyelinize alanlarında ;SMI31 pozitif kronik demyelinize aksonlara kıyasla mevcuttu. Porin reaktivitesine bağlı mitokondrial kitle APP pozitif demyelinize aksonlarda değişmemişken ,SMI32 reaktif kronik demyelinize aksonlar mitokondrial aktivte için önemli bir azalma ortaya koydular. Bu bilgiler,APP pozitif demyelinize aksonlarda kompleks IV defektiyle tutarlıdır;oysa SMI 31 ile kıyasla SMI32 reaktif kronik demyelinize aksonlarda compleks IV aktivite eksikliği,kısmen mitokondrial tükenmeye bağlı görünmektedir. 2)MULTİPL SKLEROZ LEZYONLARININ KRONİK İNAKTİF ALANLARINDA MİTOKONDRİAL SOLUNUM ZİNCİR KOMPLEKS IV AKTİVİTESİ ARTMIŞTIR. Sürpriz olacak şekilde;inaktif lezyonlarda ve kronik aktif lezyonların inaktif merkezinde özellikle mitokondrial solunum zincir kompleks II ve IV’ün histokimyanının ortaya koyduğu aktivitesi artmıştır.Mitokondrinin tipik noktasal kompleks IV aktif bileşenleri;normal görünümlü beyaz cevhere kıyasla kronik demyelinize alanlarda dansite ve intensite açısından daha belirgindir.Bununla birlikte;normal görünümlü beyaz cevherin myelinize aksonlarlakıyaslandığında;göreceli inaktif kronik lezyonlardaki demyelinize aksonlarda,COX elektron mikroskopisi mitokondride büyük compleks IV aktivitesi göstermiştir. Compleks IV aktivitesinin %95 güven aralığına dayanarak;kontrol grubu beyaz cevherdeki myelinize aksonlarına kıyasla;multipl sklerozlu beyin ve spinal kordaki kronik demyelinze aksonların sırasıyla %55 ve %59 artmış compleks IV aktivitesi göstermiştir. 3)MS LEZOYNLARININ İNAKTİF ALANLARINDAKİ MORFOLOJİK OLARKA İNTAKT DEMYELİNİZE AKSONLARINDA MİTOKONDRİAL KİTLE,SİNTAFİLN VE FOSFORİLE NÖROFİLAMENT ARTMIŞTIR Alıntı yapılan çalışmada;tüm mitokondrilerin dış membranı üzerinde eksprese olan voltaj bağımlı anyon kanal ve porine karşı monoklonal antikorlar ;histokimya,üçlü etiketleme ve immunoflorasan ve Western Blot kullanılarak akson dahilinde ve lezyonlarda mitokondrial kitle belirlendi;sırasıyla sintafilin a,mitokondrial yerleştirme protein ve SMI31 özellikle aksonlarda eksprese edildiği görülmüştür.
Porin,sintafilin ve SMI31’in üçlü etiketlemesi ve confocal mikroskopi;myelinli kısımlara göre demyelinize aksonlarda mitokondrinin bol miktarda olduğunu göstermiştir. Mitokondri,özellikle nörofilament H’nin yan kolları olmak üzere yüksek molekül ağırlıklı nörofilament ile etkileşir;Nörofilamet H’nin yan kollarının fosforilasyon durumu,mitokondrinin metabolik aktivitesine bağlı bir şekilde,nörofilament ve mitokondri arasındaki etkileşimi etkiler.Alıntı yapılan çalışmada,B-avtin için doğrulandığında ;kontrol grubu (1.86 kat 6 olguda p=0.02) beyaz cevher ve normal görünümlü beyaz cevher(1.83 kat 6 olguda ile kıyaslandığında fosforile nörofilament –H’de anlamlı artış bulunmuştur ancak toplam nörofilament miktarı kontrol grubu ve normal beyaz cevherle kıyaslandığında anlamı fark bulunmamıştır.Yani;fosforile ve tüm nörofilament H arasındaki oran kontrol gurubu beyaz cevher ve normal görünümlü beyaz cevhere kıyasla kronik lezyonlarda fosforilasyon oranında anlamlı artış tanımlandı. 4)KRONİK MS LEZYONLARINDA KOMPLEKS IV AKTİVİTESİ MİKROGLİA VE MAROFAJ KONSANTRASYONUYLA TERS ORANTILIDIR Aksonal yaralanmanın inflmasyon ile ilişkili olduğu gerçeğine dayanarak;mikroglia/makrofajlar MS lezyonlarında reaktif oksijen ürünlerinin kayanağıdırlar ve compleks IV ROÜ aracılıklı hasara hassastır.Alıntı yapılan çalışma ,kronik lezyonun inaktif (n=22) ve aktif (n=8) aksonlarında mikroglia ve makrofaj yoğunluğu tespit edilmiş olup,bu yoğunluk seri kesitlerde compleks IV akitivtesiyle ters korelasyon göstermiştir. 5)Na/K ATPaz POZİTİF DEMYELİNİZE AKSONLAR KOMPLEKS IV DİSFONKSİYONU İÇERİR Alıntı yapılan çalışma; sinir uyarıları , Na/K ATP az enerji bağımlı iken ,kronik lezyonlarda Na/K ATP az pozitif aksonların populasyonunu tanımlayarak bu durumun compleks IV üzerindeki yansımalarını araştırmıştır. Kronik inaktif lezyonlarda,toplam nörofilament reaktivitesi ve rastgele 100 x görüntüler kullanılıp demyelinize aksonlar tanımlandığında ;Na/K ATP az 1 pozitif demyelinize aksonlar dahilinde compleks IV aktif bileşenlerinin oranı 2.56 ortalama ile 0.0- 8-54 arasında değişmekteydi. 6)COMPLEKS IV İNHİBİSYONU GLUTAMAT ARACII AKSONAL HASARI ARTIRMAKTADIR Daha önce değinildiği gibi,yapılan çalışmada ;nöron kültürleri ;aktivitesini %36’ya düşüren ,compleks IV inhibitörü sodyum azidin ardından,sodyum azid gib,glutamatın subletal konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır.İlginç şekilde,compleks IV inhibisyonu aktivite azalmasına yol açtı fakat,kısmi enerji eksikliğinde azaltılmış hızlı aksonal transportu yansıtabilen APP immünreaktivitesinde,kontrol grubun kıyasla anlamlı azalmaya yol açtı. TARTIŞMA Alıntı yapılan çalışma; mitokondrial defekt aksonal dejenerasyona yol açar ve demyelinize aksonlarda enerji ihtiyacı daha fazladır hipotezi temelinde ,MS ve kontrol beyin ve spinal dokularındaki mitokondrial solunum zincir compleks IV aktivtesi ve mitokondrial kiteleyi belirlemiştir. Kronik lezyonlarda,aksonal dejenerasyon,inflmasyon derecesiyle koreledir ve bu durum aksonal kayba dönüşür.Aksonal hasatın patolojik işaretleri;APP gibi proteinlerinde intrakasonal birikimi ve hızlı aksonal transport bloğunun belirteci nörofilament defosforilasyonunu içerir.Bununla birlikte;güçlü nonfosforile nörofilament reaktivitesi gösteren morfolojik olarak intakt kronik demyelinize aksonlar,SMI31 pozitif kronik demyelinize aksonlarla kıyaslandığında ,büyük oranda mitokondrial tüketime bağlı olacak
şekilde,compleks IV aktivitesinde anlamlı azalma göstermiştir.Aksonal transport bozukluğu sonucu oluşan mitokondrial tükenme; SOD-1 mutant deney modelinde de gösterilmiştir Yapılan çalışma;beyinde ve spinal korda kronik multipl skleroz lezyonlarının göreceli inaktif bölgelerinde geniş kronik demyelinize SMI31 pozitif aksonların yaklaşık yarısında;geniş myelinli aksonlara kıyasla mitokondrial kitlede olduğu gibi compleks IV aktivitesinde de anlamlı artış rapor etmiştir. Nörofilament fosforilasyonu ve APP birikimi döneminde compleks IV aktivitesi artmış kronik demyelinize aksonlarda yapısal değişikliklerin eksikliği;yukarıda anlatılan mitokondrial değişikliklerin patolojik proçes yerine ;demyelinizasyonla ilişkişi potansiyel adaptif proçes olduğunu gösteriyor ve bu adaptif değişiklikler mitokondrial kitle ve aktivitede değişiklikleri içierir. MS vakalarında beyindeki mylenize aksonlarda compleks IV aktivitesinde anlamlı artışın önerdiği şekliyle,lezyondaki lokal çevresel faktörlerin ;artmış mitokondirial DNA gibi mitokondriel değişiklerinin major yönlendiricisi olması muhtemeldir. Demyelinizasyonla ilişkli compleks IV aktivitesindeki artış,akson dahilindeki mitokondriel kitlede artış ile ilişkilidir. Yapılan çalışmada ,sintafilinin irdelenmesinin sebebi;karboksi terminal kutruğu ve mikrotubul bağlanmasıyla,dış mitokondierl membranı hedefleyerek mitokondriyi immobilize etmesidir.Bu nedenle sintafilin aksonlardaki immobil mitokondriyi tanımlamak için güvenilir bir araçtır ve sintafilin MS’deki demyelinize akson dahilinde artmış mitokondrial kitle için destek sağlar. Mitokondri;nöroflamentlerin fosforilasyon durmu ve metabolik aktivitesine bağımlı olarak;enerji üretim kapasitesi artmış mitokondrinin daha fazla fosforile nörofilament bağlaması temeli üzerinde etkileşir.Akut lezyonlarda hiperfosforile nörofilament arışı,kronik lezyonlarda artmış fosforile nörofilament artışı mevcuttur. Akson dahilinde,mitokondri ve fosforile nörofilamentler arasındaki etkileşimin mitokondrial hareketliliği etkileyip etkilemediği bilinmiyor ancak kronik lezyonlarda sintafilin artışı;geniş kronik demyelinize aksonlardaki mitokondrinin myelinize aksonlara kıyasla göreceli immobil ve mitokondrial aktivite azalışının ;bu etkileşimin demyelinize aksonlarda mitokondrial aktiviteyi kısmen belirlediğini önermektedir. İnflamasyon ;mitokondriel disfonksiyonun potent bir uyarıcısı ve aktive makrofaj ve mikroglia lezyonda nitrik oksit ve reaktif oksijen ürünlerinin üreticisidir.Nitrik oksit ve reaktif oksijen ürünleri compleks IV aktivitesini irreversible inhibe edebilir, meydana gelen oksidatif hasar sonucu post- translasyonel modifikasyonlar mitokondrial DNA’ya yöneliktir. Yapılan çalışma;global compleks IV aktivitesi ve mikroglial makrofaj dansitesi arasında ters korelasyon;compleks IV disfonksiyonun primer belirleyicisi olarak mikrogliayı tanımlar. 1960’larda Hodgkin ve arkadaşları,compleks IV’ü dinlenme membran potansiyelini koruma ve Na/K ATP az açısından sodyum akışı için temel bileşen olarak tanımlamışlardır.NO- compleks IV inhibitörü-‘in sık bir iletim bloğu nedeni olduğu gösterilmiştir.Bundan dolayı mitokondrial solunum zincir kompleks IV sinir iletimi için bir ihtiyaçtır.Yapılan çalışma,dinlenme membran potansiyelini korumanın mümkün olmadığı Na/K ATP az pozitif kronik demyelinize bir dizi aksonda kompleks IV aktivitesinin tam eksikliğini tespit etmiştir. Enerji kusuru yanı sıra,kalsiyum taşıma kapasitesindeki işleyiş bozukluğu mitokondrial solunum zincir defektinin önemli bir sonucudur. Multipl Sklerozda inhibitör nöron azalır ve bu azalış ekstitatör nörotasnmitterleri ve demyelinize aksondaki ateşlemeleri artırır.
SONUÇ Kompleks IV defekti;Na /K ATP az aktivitesi,dinlenme membran potansiyeli ve sinir impulslarını büyük oranda bozmaktadır;muhtemelen progresiv multipl sklerozlu hastada kalıcı nörolojik bozukluğun bir kısmında pay sahibir. Mitokondriel solunum zincir aktivitesini;koruma MS’li hastada aksonal dejenerasyonu önlemek ve fonksiyonunu geliştirmek açısından teröpatik yarara sahip olabilir. YAYHYAYSE

More Related Content

Multi̇pl sklerozda akson dahi̇li̇nde mi̇tokondri̇al deği̇şi̇kli̇kler

  • 1. MULTİPL SKLEROZDA AKSON DAHİLİNDE MİTOKONDRİAL DEĞİŞİKLİKLER GİRİŞ Multipl skleroz genç erişkinlerde nontravmatik nörolojik bozukluğun en sık nedenidir;bununla birlikte multipl sklerozda;akson dejenerasyonunda enerji eksikliği sorumlu tutulmuş olup,hastalık progresyonuyla patolojik değişikler koreledir. Demiyelinizasyonu ve sonraki değişen ilerlemedeki kayıpları takiben; aksonların demiyelinize kısımlarında,sodyum kanal sayısı artışı olmak üzere biri değişiklik görülür.İntra aksonal iyonik dengenin işlerliği ve sodyum akımına bağlı;membran dinlenme potansiyeli,artan sodyum kanalları üzerinden ,MSS’de enerjinin en büyük tüketicisidir.Akson enerji tüketimindeki bu artış;myelin basic proteini defektli shiverer farelerinde yapılan deneysel çalışmalarda;mitokondrial yoğınluk ve aktivite artışının görülmesiyle anlaşılır. Mitokondri;ATP’nin en etkili üreticisidir ve apoptozda,reaktif oksijen radikalleri sentezinde ,kalsiyum homeostazında rol oynamaktadır.Muhtemel inflamasyon,travma,iskemiyi içeren bir dizi etki nedeniyle akson dejenerasyonunda;intraaksonal kalsiyum dengesizliği görülür. Mitokondirial solunum zinciri;mitokondrial membran içine lokalize olup compleks I,II,III,IV ve doğrudan ATP sentezinden sorumlu compleks V’den oluşur.Mitokondrial solunum zincirinin su taşıyıcısı compleks IV- veya sitokromoksidaz COX-%90 üzerinde oksijenin suya dönüştüğü yerdir. Konsantrasyonuna ve maruz kalma süresine bağlı olarak,MS lezyonlarında olduğu gibi complek IV NO hedefidir ve geri dönüşümsüz inhibe olabilir.İnflamatuar çevrelerde;mitokondiral solunum zincir aktivitesi non-nükleler DNA-mitokondirial DNA’ya zarar veren subunitlerin alımı ve postranskripsyonel modifikasyonu etkileyen reaktif oksijen radikallerine bağlı bozulmuş olabilir. Mitokondrinin tüketimi ve solunum zincirindeki defekt,sadece enerji defisitinin sebebi değildir;kalsiyum tutma kapasitesini bozan sitotoksik hasarın aksonlardaki hassaslığını artırabilir. Artan kanıtlar multipl skleroz patogenezine mitokondriyi yerleştiriyor. -Mitokondrial solunum zincir kompleks I ve III aktivitesi;mitokondrideki nükleer DNA kodlu transkriptleri proteinlerin azaldığı non lezyonel motor kortekste düşer. -Compleks I aktivitesindeki düşüle ilişkili olarak;kronik aktif beyaz cevher lezyonlarında mitokondrial DNA için oksidatif hasar söz konusudur. -İlginç olarak;kompleks IV aktivitesi ve mitokondrial DNA kopya sayısı,muhtemelen kompansasyonla ilişkili olacak şekilde kronik aktif lezyon homojenatlarında ve normal görünümlü gri cevher nörönlarında artmıştır. Alıntı yapılan çalışma,compleks IV aktivite eksikliğinin kronik aktif lezyonlarda aksonal dejenerasyonda major bir rol oynadığını öne sürmektedir. METOD A)OTOPSİ DOKULARI VE LEZYONLARIN KALSİFİKASYONLARI 9 MS vakasından;posterior frontal lobdan 6 makroskopik lezyon;5 MS vakasından servikal ve /veya torasik spinal kordan 6 makroskopik lezyon ,Luxol Fast Blue dağılımı ve kriostat bölümlerinde proteolipidoprotein ve HLA-D eksprasyonu boyanmasına bağlı ;daha önceki prtokollere uygun olarak kronik aktif ve yavaş ilerleyen kronik aktif lezyonları şeklinde tanımlanmıştır. MS vakaları için ölüm sebebi;pnomoni(n=7),kardiak yetersizlik(n=1),sepsis(n=2) ve kontrol grubu için kardiyopulmoner arrest ve pnomoniydi. B)İMMÜNOHİSTOKİMYA
  • 2. Çift ve üçlü etiketleme immunflorasan etiketleme için;anında dondurulmuş bölümler,hidrojen peroksit olmadan ,immünohistokimya için olduğu gibi hazırlanmış bir alt sınıfı belirli bir ikincil antikorlar doğrudan florokromlar ile moleküler prob kullanılarak konjuge edilmiştir. Uygun kontroller,çapraz reaktivite ve çiftli- üçlü etiketlenme deneylerinde spesifik olmayan bağlanmayı dışlamak için gerçekleştirilmiştir. C)COX VE SDH HİSTOKİMYASI Beyin ve spinal kord doku blokları ,belirili bir kimyasal işlemden geçtikten sonra COX ortamına inkübe edildi.İnkübasyon sonrası,akson ve mitokondri çift immünoflorans histokimya kullanılarak tanımlandı.Compleks II aktivitesini tespit etmek için SDH ortamına inkübe edildi,sonrasında COX ortamı içinde 50 dakika süreyle yıkandı. COX histokimyasının tanımlanmasının ardında ,aksonlardaki kompleks IV aktivitesini tanımlamak için ;protokollere uygun olarak nörofilament ve amiloid prekürsör proteine karşı antikorlarla immunflorasan olarak etiketlendi. D)COX ELEKTRON MİKROSKOPİSİ 1 mm kalınlığında normal görünümlü beyaz cevherden ve spinal kord lezyonlarından disseke edilen doku örnekleri;CompleksIV aktivitesini tespit etmek adına protokolüne uygun belirli bir işlemden geçirilmiş ve Philips CM 100 EM ile incelenmiştir. E) WESTERN BLOTTİNG Homojenatları hazırlamak için;CON’dan (n=6) beyaz cevher,normal görünümlü beyaz cevher (n=6) ve posterior frontal korteksten kronik inaktif multipls skleroz lezyonları (n=6);kriostatkesitlerinden 20 mm kalınlıkla, dikkatlice;scalpel ve 250 mM sukroz,2mM HEPES ve 0.1 mM EDTA katılmış homojenize tampon kullanılarak çıkarıldı. Homojenatlardaki proteinlerin elektrofonetik olarak 4 derecede 0.45 mm poliviliden florür membranlara dönüştürülmesinin ardından bir dizi işlem sonrası ; B-actin,porin fosforile total nöröfilament,sintafilin ve compleks II alt birimine karşı primer antikorlarla inkübe edildi. Adından yapılan çözeltilerle yıkanma ve inkübasyon işlemleri sonrası ECL plus Western Blotting kullanılarak tespit edildi. F)NÖRON KÜLTÜRÜ Vahşi tip fare embrionik kök hücresi çizgisinden farklılaşmış nöronları kullanılıp,yapılan işlemlerle olgunlaştırılması sonrası,;olgun nöronlar sodyum azid-spesifik kompleks IV inhibitörü- ve glutamatın çeşitli konstarasyonlarına tek veya birlikte maruz bırakıldı;bu işlemlerle subletal sodyum azid ve glutamat konsanrasyonu tespit edildi. Böylelikle nöron kültürlerinin 10 mM sodyum azid maruziyetinin compleks IV aktivitesini %86 oranında düşürdüğü spektrofotometre kullanılarak tespit edildi. G)MİKROSKOPİ Mitokondrial makrofaj yoğunluyla ilişkili kompleks IV aktivite analizi için;COX histokimyasal ve alan başına HLA immünohistokimyasal boyanmaının dört parlak alan gri ölçekli görüntüleri;seri bölümlerinde 20 büyütme ile elde edildi. Doku kesitlerinde akson dahilinde mitokondrial kitele analizi için;porin ,sintafilin ve aksonal markırlarla üçlü etiketlenmiş kesitler;63 xoil lense ve Leicolaser scanning mikroskop kullanılarak görüntülendi. Nöron kültürlerinde aksonlar,B-tubulin immunoflrasan etiketiyle tanımlandı ve 50 B- tubulin pozitif akson SMI32 veya amiloid prekürsör protein ile kapak silip başına,bitişik olanlarda görüntülendi. F)MİTOKONDRİAL KİTLENİN ve AKSONAL KOMPLEKS IV’ün KANTİTASYONU Geniş aksonlardaki compleks IV aktif bileşenlerini tanımlamak için ,SMI31,SMI32,APP immünoflorasan yoluyla
  • 3. etiketlenmiş aksonların ana hattı,COX histokimyanın parlak alan resminin üzerine bindirildi ardından;dansiteometri ve Zeiss Axio Vision sürüm 4.6 kullanılarak yoğunlukla ilgili daha fazla analize tabi tutuldu.Ek olarak,COX histokimyasal ürünlerinin dansitometrik analizi;doku kesitlerinde kompleks IV aktivitesinin değerlendirilmesi için geçerli bir araçtır. Mikroglial/makrofaj ile compleks IV aktivitesinin (ters) korelasyonu için;COX histokimyasal boyamanın tüm 20x gri ton görüntülerinin dansitometrik değeri,normal görünümlü beyaz cevherin değerine göre belirlendi,;iç kontrol olarak lezyonun karşılık gelen değerinden çıkarıldı. G)İSTATİSK SPPS version 14;demylenize ve mylenize aksonlarda compleks IV aktivitesi ve porin immün reaktivitesinin kıyaslanması için kullanıldı. SONUÇLAR Alıntı yapılan çalışma;MS ve aksonal dejenreasyonda ,mitokondrial defektin önemli olduğu düşünülerek kronik aktif ve inaktif lezyonlarda mitokondrial aktivite ve kitle çalışılmıştır. 1)APP ve SMI32 İMMÜNREAKTİF HASARLI DEMYLENİZE AKSONLARDA COMPLEKS IV DEFEKTİ VARDIR. APP pozitif aksonlardan compleks IV aktivitesi; SMI31 pozitif myelinize ve demyelinize kontrol grubu beyaz cevher ve inaktif kronik lezyon aksonlarıyla kıyaslandığında anlamlı şekilde düşüktür. Ayrıca compleks IV aktivitesinde anlamlı düşüklük;kronik lezyonların inaktif alanlarının SMI32 pozitif kronik demyelinize alanlarında ;SMI31 pozitif kronik demyelinize aksonlara kıyasla mevcuttu. Porin reaktivitesine bağlı mitokondrial kitle APP pozitif demyelinize aksonlarda değişmemişken ,SMI32 reaktif kronik demyelinize aksonlar mitokondrial aktivte için önemli bir azalma ortaya koydular. Bu bilgiler,APP pozitif demyelinize aksonlarda kompleks IV defektiyle tutarlıdır;oysa SMI 31 ile kıyasla SMI32 reaktif kronik demyelinize aksonlarda compleks IV aktivite eksikliği,kısmen mitokondrial tükenmeye bağlı görünmektedir. 2)MULTİPL SKLEROZ LEZYONLARININ KRONİK İNAKTİF ALANLARINDA MİTOKONDRİAL SOLUNUM ZİNCİR KOMPLEKS IV AKTİVİTESİ ARTMIŞTIR. Sürpriz olacak şekilde;inaktif lezyonlarda ve kronik aktif lezyonların inaktif merkezinde özellikle mitokondrial solunum zincir kompleks II ve IV’ün histokimyanının ortaya koyduğu aktivitesi artmıştır.Mitokondrinin tipik noktasal kompleks IV aktif bileşenleri;normal görünümlü beyaz cevhere kıyasla kronik demyelinize alanlarda dansite ve intensite açısından daha belirgindir.Bununla birlikte;normal görünümlü beyaz cevherin myelinize aksonlarlakıyaslandığında;göreceli inaktif kronik lezyonlardaki demyelinize aksonlarda,COX elektron mikroskopisi mitokondride büyük compleks IV aktivitesi göstermiştir. Compleks IV aktivitesinin %95 güven aralığına dayanarak;kontrol grubu beyaz cevherdeki myelinize aksonlarına kıyasla;multipl sklerozlu beyin ve spinal kordaki kronik demyelinze aksonların sırasıyla %55 ve %59 artmış compleks IV aktivitesi göstermiştir. 3)MS LEZOYNLARININ İNAKTİF ALANLARINDAKİ MORFOLOJİK OLARKA İNTAKT DEMYELİNİZE AKSONLARINDA MİTOKONDRİAL KİTLE,SİNTAFİLN VE FOSFORİLE NÖROFİLAMENT ARTMIŞTIR Alıntı yapılan çalışmada;tüm mitokondrilerin dış membranı üzerinde eksprese olan voltaj bağımlı anyon kanal ve porine karşı monoklonal antikorlar ;histokimya,üçlü etiketleme ve immunoflorasan ve Western Blot kullanılarak akson dahilinde ve lezyonlarda mitokondrial kitle belirlendi;sırasıyla sintafilin a,mitokondrial yerleştirme protein ve SMI31 özellikle aksonlarda eksprese edildiği görülmüştür.
  • 4. Porin,sintafilin ve SMI31’in üçlü etiketlemesi ve confocal mikroskopi;myelinli kısımlara göre demyelinize aksonlarda mitokondrinin bol miktarda olduğunu göstermiştir. Mitokondri,özellikle nörofilament H’nin yan kolları olmak üzere yüksek molekül ağırlıklı nörofilament ile etkileşir;Nörofilamet H’nin yan kollarının fosforilasyon durumu,mitokondrinin metabolik aktivitesine bağlı bir şekilde,nörofilament ve mitokondri arasındaki etkileşimi etkiler.Alıntı yapılan çalışmada,B-avtin için doğrulandığında ;kontrol grubu (1.86 kat 6 olguda p=0.02) beyaz cevher ve normal görünümlü beyaz cevher(1.83 kat 6 olguda ile kıyaslandığında fosforile nörofilament –H’de anlamlı artış bulunmuştur ancak toplam nörofilament miktarı kontrol grubu ve normal beyaz cevherle kıyaslandığında anlamı fark bulunmamıştır.Yani;fosforile ve tüm nörofilament H arasındaki oran kontrol gurubu beyaz cevher ve normal görünümlü beyaz cevhere kıyasla kronik lezyonlarda fosforilasyon oranında anlamlı artış tanımlandı. 4)KRONİK MS LEZYONLARINDA KOMPLEKS IV AKTİVİTESİ MİKROGLİA VE MAROFAJ KONSANTRASYONUYLA TERS ORANTILIDIR Aksonal yaralanmanın inflmasyon ile ilişkili olduğu gerçeğine dayanarak;mikroglia/makrofajlar MS lezyonlarında reaktif oksijen ürünlerinin kayanağıdırlar ve compleks IV ROÜ aracılıklı hasara hassastır.Alıntı yapılan çalışma ,kronik lezyonun inaktif (n=22) ve aktif (n=8) aksonlarında mikroglia ve makrofaj yoğunluğu tespit edilmiş olup,bu yoğunluk seri kesitlerde compleks IV akitivtesiyle ters korelasyon göstermiştir. 5)Na/K ATPaz POZİTİF DEMYELİNİZE AKSONLAR KOMPLEKS IV DİSFONKSİYONU İÇERİR Alıntı yapılan çalışma; sinir uyarıları , Na/K ATP az enerji bağımlı iken ,kronik lezyonlarda Na/K ATP az pozitif aksonların populasyonunu tanımlayarak bu durumun compleks IV üzerindeki yansımalarını araştırmıştır. Kronik inaktif lezyonlarda,toplam nörofilament reaktivitesi ve rastgele 100 x görüntüler kullanılıp demyelinize aksonlar tanımlandığında ;Na/K ATP az 1 pozitif demyelinize aksonlar dahilinde compleks IV aktif bileşenlerinin oranı 2.56 ortalama ile 0.0- 8-54 arasında değişmekteydi. 6)COMPLEKS IV İNHİBİSYONU GLUTAMAT ARACII AKSONAL HASARI ARTIRMAKTADIR Daha önce değinildiği gibi,yapılan çalışmada ;nöron kültürleri ;aktivitesini %36’ya düşüren ,compleks IV inhibitörü sodyum azidin ardından,sodyum azid gib,glutamatın subletal konsantrasyonlarına maruz bırakılmıştır.İlginç şekilde,compleks IV inhibisyonu aktivite azalmasına yol açtı fakat,kısmi enerji eksikliğinde azaltılmış hızlı aksonal transportu yansıtabilen APP immünreaktivitesinde,kontrol grubun kıyasla anlamlı azalmaya yol açtı. TARTIŞMA Alıntı yapılan çalışma; mitokondrial defekt aksonal dejenerasyona yol açar ve demyelinize aksonlarda enerji ihtiyacı daha fazladır hipotezi temelinde ,MS ve kontrol beyin ve spinal dokularındaki mitokondrial solunum zincir compleks IV aktivtesi ve mitokondrial kiteleyi belirlemiştir. Kronik lezyonlarda,aksonal dejenerasyon,inflmasyon derecesiyle koreledir ve bu durum aksonal kayba dönüşür.Aksonal hasatın patolojik işaretleri;APP gibi proteinlerinde intrakasonal birikimi ve hızlı aksonal transport bloğunun belirteci nörofilament defosforilasyonunu içerir.Bununla birlikte;güçlü nonfosforile nörofilament reaktivitesi gösteren morfolojik olarak intakt kronik demyelinize aksonlar,SMI31 pozitif kronik demyelinize aksonlarla kıyaslandığında ,büyük oranda mitokondrial tüketime bağlı olacak
  • 5. şekilde,compleks IV aktivitesinde anlamlı azalma göstermiştir.Aksonal transport bozukluğu sonucu oluşan mitokondrial tükenme; SOD-1 mutant deney modelinde de gösterilmiştir Yapılan çalışma;beyinde ve spinal korda kronik multipl skleroz lezyonlarının göreceli inaktif bölgelerinde geniş kronik demyelinize SMI31 pozitif aksonların yaklaşık yarısında;geniş myelinli aksonlara kıyasla mitokondrial kitlede olduğu gibi compleks IV aktivitesinde de anlamlı artış rapor etmiştir. Nörofilament fosforilasyonu ve APP birikimi döneminde compleks IV aktivitesi artmış kronik demyelinize aksonlarda yapısal değişikliklerin eksikliği;yukarıda anlatılan mitokondrial değişikliklerin patolojik proçes yerine ;demyelinizasyonla ilişkişi potansiyel adaptif proçes olduğunu gösteriyor ve bu adaptif değişiklikler mitokondrial kitle ve aktivitede değişiklikleri içierir. MS vakalarında beyindeki mylenize aksonlarda compleks IV aktivitesinde anlamlı artışın önerdiği şekliyle,lezyondaki lokal çevresel faktörlerin ;artmış mitokondirial DNA gibi mitokondriel değişiklerinin major yönlendiricisi olması muhtemeldir. Demyelinizasyonla ilişkli compleks IV aktivitesindeki artış,akson dahilindeki mitokondriel kitlede artış ile ilişkilidir. Yapılan çalışmada ,sintafilinin irdelenmesinin sebebi;karboksi terminal kutruğu ve mikrotubul bağlanmasıyla,dış mitokondierl membranı hedefleyerek mitokondriyi immobilize etmesidir.Bu nedenle sintafilin aksonlardaki immobil mitokondriyi tanımlamak için güvenilir bir araçtır ve sintafilin MS’deki demyelinize akson dahilinde artmış mitokondrial kitle için destek sağlar. Mitokondri;nöroflamentlerin fosforilasyon durmu ve metabolik aktivitesine bağımlı olarak;enerji üretim kapasitesi artmış mitokondrinin daha fazla fosforile nörofilament bağlaması temeli üzerinde etkileşir.Akut lezyonlarda hiperfosforile nörofilament arışı,kronik lezyonlarda artmış fosforile nörofilament artışı mevcuttur. Akson dahilinde,mitokondri ve fosforile nörofilamentler arasındaki etkileşimin mitokondrial hareketliliği etkileyip etkilemediği bilinmiyor ancak kronik lezyonlarda sintafilin artışı;geniş kronik demyelinize aksonlardaki mitokondrinin myelinize aksonlara kıyasla göreceli immobil ve mitokondrial aktivite azalışının ;bu etkileşimin demyelinize aksonlarda mitokondrial aktiviteyi kısmen belirlediğini önermektedir. İnflamasyon ;mitokondriel disfonksiyonun potent bir uyarıcısı ve aktive makrofaj ve mikroglia lezyonda nitrik oksit ve reaktif oksijen ürünlerinin üreticisidir.Nitrik oksit ve reaktif oksijen ürünleri compleks IV aktivitesini irreversible inhibe edebilir, meydana gelen oksidatif hasar sonucu post- translasyonel modifikasyonlar mitokondrial DNA’ya yöneliktir. Yapılan çalışma;global compleks IV aktivitesi ve mikroglial makrofaj dansitesi arasında ters korelasyon;compleks IV disfonksiyonun primer belirleyicisi olarak mikrogliayı tanımlar. 1960’larda Hodgkin ve arkadaşları,compleks IV’ü dinlenme membran potansiyelini koruma ve Na/K ATP az açısından sodyum akışı için temel bileşen olarak tanımlamışlardır.NO- compleks IV inhibitörü-‘in sık bir iletim bloğu nedeni olduğu gösterilmiştir.Bundan dolayı mitokondrial solunum zincir kompleks IV sinir iletimi için bir ihtiyaçtır.Yapılan çalışma,dinlenme membran potansiyelini korumanın mümkün olmadığı Na/K ATP az pozitif kronik demyelinize bir dizi aksonda kompleks IV aktivitesinin tam eksikliğini tespit etmiştir. Enerji kusuru yanı sıra,kalsiyum taşıma kapasitesindeki işleyiş bozukluğu mitokondrial solunum zincir defektinin önemli bir sonucudur. Multipl Sklerozda inhibitör nöron azalır ve bu azalış ekstitatör nörotasnmitterleri ve demyelinize aksondaki ateşlemeleri artırır.
  • 6. SONUÇ Kompleks IV defekti;Na /K ATP az aktivitesi,dinlenme membran potansiyeli ve sinir impulslarını büyük oranda bozmaktadır;muhtemelen progresiv multipl sklerozlu hastada kalıcı nörolojik bozukluğun bir kısmında pay sahibir. Mitokondriel solunum zincir aktivitesini;koruma MS’li hastada aksonal dejenerasyonu önlemek ve fonksiyonunu geliştirmek açısından teröpatik yarara sahip olabilir. YAYHYAYSE