際際滷

際際滷Share a Scribd company logo
Pokusi na izoliranim vaskularnim
prstenovima
Doc.dr.sc. Martina Mihalj, dr. med.
FIZIOLOGIJA KRVNIH 貼ILA
 Dobro razumijevanje fiziologije vaskularnog sustava nu転no je za
razumijevanje tijeka pokusa
 Mehanizmi vazodilatacije i vazokonstrikcije
Unutarstanina signalizacija
V r s t e r e c e p t o r a:
1. R e c e p t o r o v i s n i i o n s k i k a n a l i (ionotropni receptori)
2. R e c e p t o r i s p r e g n u t i s G -p r o t e i n o m (metabotropni
receptori)
3. K i n a z n i r e c e p t o r i
4. N u k l e a r n i r e c e p t o r i
R R E R
G G
Stanini
odgovor Stanini odgovor
Stanini
odgovor
Stanini
odgovor
Hiperpolarizacija ili
depolarizacija
Promjena
podra転lji-
vosti
Drugi glasnici
Otpu邸tanje
Ca2+
Fosforilacija
proteina drugo
Fosforilacija
proteina
Transkripcija gena
Sinteza proteina
R
Transkripcija
gena
Sinteza proteina
1. Receptor-ovisni
ionski kanali
2. Receptori spregnuti sa
G-proteinima
(metabotropni receptori)
3. Kinazni
receptori
4. Nuklearni
receptor
Vremenska skala:
Milisekunde
Primjer:
Nikotinski
receptor za Ach
Vremenska skala:
Sati
Primjer:
Citokinski
receptor
Vremenska skala:
Sati
Primjer:
Estrogenski
receptori
Vremenska skala:
sekunde
Primjer:
Muskarinski receptor za Ach
Meta 1Meta 2
留
GDP
Meta 1
GTP
硫粒
GDP
P
Hidroliza
Receptori spregnuti s G - proteinom
Unutarstanina signalizacija
Receptori spregnuti sa G proteinom
Meta
1
Meta
2 留 硫粒
GDP
Meta
1
Meta
2 留 硫粒
GDP
GTP
Meta
1
Meta
2 留 硫粒
GTP
Meta
1
Meta
2 留 硫粒
GDP
+
P
Receptor zauzet
Meta aktiviranaGTP hidroliziran
1.
4. 3.
2.
GDP
Unutarstanina signalizacija
Adenilat ciklaza
AC
留
硫粒
GTP
ATP
cAMP
Inaktivna
Proteinkinaza A
Aktivna
Proteinkinaza A
Fosfodiesteraza
ATP
cAMP
AC
Pojaana lipoliza
 sinteza glikogena
 razgradnja glikogena
...
Ca2+
Fosfolipaza C
Fos.
C
留
硫粒
GTP
PIP2
DAG
IP3
IP4
aktivacija
Protein kinaze C
Oslobaanje
Unutarst. Ca++
Ulaz Ca++
kroz membranu
kalmodulin
Ciljni enzimi
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Pokusi na izoliranim vaskularnim prstenovima
Metabolizam arahidonske kiseline
News Physiol. Sci. 14;238-242, 1999; posueno iz prezentacije prof.dr.sc. Ines Drenjanevi - Peri
20-HETE and EETs in Control of Renal Vascular Tone
留1
Fos.
C
留
硫粒
GTP
PIP2
IP3
IP4
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
kalmodulin
Kinaza lakih miozinskih
lanaca
IP3
GLATKA MIINA STANICA
L Ca2+ kanali
ovisni o naponu
Ca2+ kanali
ovisni o ligandu
ATP
ATP
Ca2+ kanali regulirani
zalihom
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Na+
Pokusi na izoliranim vaskularnim prstenovima
L-arginin NO
eNOS
GMP
Gvanilat
ciklaza cGMP
Endotelna
stanica
Glatka
mi邸ina
stanica
Bazalna
membrana
PK
NO: endotelni faktor relaksacije
Ca2+ - kalmodulin
+ -
Fiziolo邸ka humoralna regulacija
VAZOKONSTRIKTORI
 Noradrenalin
 Angiotenzin II.
 Vazopresin (ADH)
 Endotelin
VAZODILATATORI
 Bradikinin
 Serotonin
 Histamin
 Prostaglandini
 NO (EDRF)
 C-natriuretski peptid
 Adrenomodulin
 EDHF (endotelni hiperpolarizacijski
faktor)
Fiziolo邸ka 転ivana regulacija
VAZOKONSTRIKTORI
 Simpatikus: NA putem 留1 留2
VAZODILATATORI
 Parasimpatikus: Ach
 Simpatikus: Na putem 硫2
UINCI VAZOAKTIVNIH LIJEKOVA NA
KRVNE 貼ILE
 ACETILKOLIN
 L-NAME
 INDOMETACIN
 KOTRIMAZOL
 VERAPAMIL
 NO donori
 KCl
 NORADRENALIN
Noradrenalin
留1
Fos.
C
留
硫粒
GTP
PIP2
DAG
IP3
aktivacija
Protein kinaze C
Oslobaanje
Unutarst. Ca++ Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
Ca2+
kalmodulin
Ciljni enzimi
IP3 R-IP3
Ca2+
Ca2+
Acetilkolin
L-arginin NO
eNOS
GMP
Gvanilat
ciklaza cGMP
Endotelna
stanica
Glatka
mi邸ina
stanica
Bazalna
membrana
M
Fosf.
C
留硫粒
GTP
PIP2
IP3
Ca2+
kalmodulin
Ca2+
L - N A M E
L-arginin NO
eNOS
GMP
Gvanilat
ciklaza
cGMP
Endotelna
stanica
Glatka
mi邸ina
stanica
Bazalna
membrana
Indometacin
Arahidonska
kiselina
PGI2
COX
AMP
Adenilat
ciklaza
cAMP
Endotelna
stanica
Glatka
mi邸ina
stanica
- Udio PGI2 (prostaciklina) u endotel ovisnoj vazodilataciji je relativno mal
Bazalna
membrana
Klotrimazol
Na-nitroprusid, SNP
L-arginin NO
eNOS
GMP
Gvanilat
ciklaza
cGMP
Endotelna
stanica
Glatka
mi邸ina
stanica
Bazalna
membrana
PRIPREMA ZA POKUS
 Pokretanje sustava (temp . 37 C, doprema O2 itd.)
 Kalibracija sustava
 Priprema Krebs Henseleitove otopine
 Razrijaivanje lijekova
4-vero kanalni sustav kupki za izolirane organe
sadr転i:
 etverokanalni standardni sustav kupki za izolirane organe (tkivne prstenove i trakice) sa svom
prikljunom opremom (cijevi, kablovi itd.)
 etverokanalni pojaiva mjerene sile
 Izometrini pretvara sile
 Softwer za prikupljanje i obradu podataka
 Sustav za primanje i prijenos siganala sa sustava kupki za izolirane organe na raunalo (etverokanalni s
moguno邸u pro邸irivanja na osamkanalni sustav)
 Sustav za grijanje i cirkulaciju vode sa spremnikom od 20 l i moguno邸u prilagodbe temperature u
rasponu od 20  50 尊C te s precizno邸u od 賊0,1 尊C
Pokusi na izoliranim vaskularnim prstenovima
Pretvara sile
20 mL bazeni
Makro i mikro vijak za
pode邸enje napetosti
Pokusi na izoliranim vaskularnim prstenovima
Sastojak Koncentracija/mM Masa/g Masa/g
Deionizirana voda - 4 L 6L
NaCl 113 27,580 41,37
KCl 4,7 1,402 2,103
CaCl2 x 2H2O 2,5 1,470 2,205
EDTA 0,026 0,0304 0,05
MgSO4 x 6H2O 1,2 1,185 1,78
KH2PO4 1,2 0,653 0,98
NaHCO3 22 7,395 11,09
Glukoza - 7,999 11,99
Krebs  Henseleitova otopina
PRIPREMA LIJEKOVA ZA POKUS
 Lijekovi se pripremaju kao 20 mM (iznimno 3M i 2mM)
 uvaju se 2 do 3 mjeseca na -20 C
 KCl
Lijek/aktivna tvar Mr (g/L)
Priprema
20 mM
otopine
Koncentra-cija u
bazenu
Potrebno dodatno razrjeenje
20 mM otopine
Vol. koji se dodaje
u bazeni (亮L)
KCl 74,56
Priprema se 3M
11,3g/50mL
60 mM Ne 400
Noradrenalin 205,0 41mg/10mL 10-4 M
Zamorac: 100 x (10-6)
takor: 1000x (10-7)
100
Acetilkolin 181,7 36,4mg/10mL 10-4 M
Zamorac: 10 x (10-5)
takor: 100x (10-6)
100
L-NAME 268,0 53,6mg/10mL 3x10-4 M Ne 300
Indometacin 358,0 71,6mg/10mL 10-4 M 10x (10-5 M) 100
Klotrimazol 344,8 69mg/10mL 10-4 M 10x (10-5 M) 100
Verapamil
491,0
amp: 5mg/2mL
Priprema se 2 mM
4 mL iz amp. + 6 mL H2O
20 亮M Ne 200
* Otapalo za Indometasin je 96% etanol ili DMSO/ ponekad i dr. Ovisno o proizvoau
KIRURGIJA
Pokusi na izoliranim vaskularnim prstenovima
Pokusi na izoliranim vaskularnim prstenovima
Pokusi na izoliranim vaskularnim prstenovima
STANDARDNI PROTOKOL
1. Stabilizacija krvne 転ile
2. Inicijalni prekontrakcijski test
3. Test intaktnosti endotela
4. Ispitivanje vazoaktivne tveri
1. Stabilizacija krvne 転ile (60 min)
 Krvna 転ila se prenapregne za 20 mN
 U vi邸e navrata napetosti krvne 転ile se ispravlja
na 20 mN (ili 0 mN ako sustav bazino pode邸en
na  20 mN)
 Tijekom tog perioda bazenii se ispiru 3-4puta
(cca. svakih 15 min)
2. Inicijalni prekontrakcijski test
400亮L 3M KCl
(60 mM)
Ispiranje
Ispiranje
Ispiranje
4 min
1 min
1 min
1 min
3 x
3. Testiranje intaktnosti endotela
100亮L 1000x razr. 20 mM
NORADRENALINA
(10-7M)
100亮L 100x razr. 20 mM
ACETILKOLINA
(10-6M)
Ispiranje4 min 1 min
1 min
Ispiranje
Ispiranje
4 min
4. Testiranje vazoaktivne tvari
100亮L 1000x razr. 20 mM
NORADRENALINA
(10-7M)
VAZODILATATOR
u razliitim dozama
4 min
Pokusi na izoliranim vaskularnim prstenovima
OBRADA PODATAKA
Formule za izraun % vazodilatacije...
X0
Xmax
X3
% Vazodilatacije =
Xmax  X3
Xmax  X0
% Preostale kontrakcije =
X3  X0
Xmax  X0
POKUS
Primjer pokusa: Uinci hiperbarine terapije na konduktivne krvne 転ile
DM 邸takora
24 邸takora
12 Ctrl.
(kontrola)
12 DM
(diabetikih
tretirani s STZ)
6 Ctrl.
6 Ctrl. + Citrat
6 DM
6 DM + HBOT
L-NAME
Klotrimazol
1. 2.
Ctrl. + HBOT
Skupina GUK (mmol/l) Te転ina (g) Sustav na kojem se radilo Opaske Oznake prstenova
A - Kontrola Citrat (okot
10.08.2009., TH: 09.09.2009, m 90. g)
A1a 9,7 310 I. Aorta bila skvrena i kontrahirana A1a 1-4
A1b 9,7 320 II. A1b 1-4
A1c 9,7 305 I. Aorta bila skvrena i kontrahirana A1c 1-4
A2a 11,3 310 I. A2a 1-4
A2b 10 290 II.
Problemi tijekom pokusa - 転ila bila du転e na suhom jer
sust. nije bio spreman
A2b 1-4
A2c Falilo trakica 300 II. A2c 1-4
B - Kontrola netretirana (okot
12.08.2009.)
B1a 9,3 360 I. B1a 1-4
B1b 8,6 320 II. B1b 1-4
B1c 10,9 305 I. B1c 1-4
B2a 9,5 350 I.
Serum odmrzavan zajedno s A2a, A2b i B2b - da
Danijeli ostavim 0,5 ml za Oksi.kapac.
B2a 1-4
B2b 10,7 285 II. Serum mogue razrijeen kod odmrzavanja B2b 1-4
B2c 10,3 280 I. B2c 1-4
C - Dijabetiari + HBTh (okot
25.07.2009., TH: 09.09.2009, m 90. g)
C1a > 33 250 I. C1a 1-4
C1b > 33 285 II. C1b 1-4
C1c 8 290 II. C1c 1-4
C2a > 33 225 I. C2a 1-4
C2b > 33 250 II. C2b 1-4
C2c > 33 225 II. C2c 1-4
D - Dijabetiari netretirani (okot
01.08.2009., TH: 09.09.2009, m 90. g)
D1a > 33 250 I. D1a 1-4
D1b 7,8 320 II. D1b 1-4
D1c > 33 210 II. D1c 1-4
D2a > 33 200 I. D2a 1-4
D2b > 33 170 II. D2b 1-4
D2c 10,2 300 I. Kod odvajanja serum bijel + bijeli ugru邸ak D2c 1-4
Nisu razvili dijabetes
Inicijalni prekontrakcijski test
400亮L 3M KCl
(60 mM)
Ispiranje
Ispiranje
Ispiranje
4 min
1 min
1 min
1 min
3 x
A: kontr.
D: diabet.
A: kontr.
C: diabet. + HBTh
10 min
A: kontr.
C: diabet. + HBTh
Vazodilatacija posredovana s Ach
Ach 10 min. nakon L-NAME
Ach 10 min. nakon klotrimazola

More Related Content

Pokusi na izoliranim vaskularnim prstenovima