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BACT 16S – 25-05-2013 Mara Ceccon – BMR Genomics

Bact 16S

Tecnica di tipizzazione batterica

Si basa sul sequenziamento del gene che codifica per il 16S
rRNA

La tecnica consiste nell'amplificazione di 500 o 1500 basi
circa a partire dal microlisato o DNA genomico, e successivo
sequenziamento, utilizzando primer universali

È possibile risalire fino al genere di appartenenza del
batterio e talvolta alla specie

La metodica Bact 16S consiste in tre di fasi:
1. Amplificazione del gene 16S
2. Sequenziamento
3. Ricerca di omologia in database

BACT16S
Metodiche applicate:

PCR

Caricamento su gel di agarosio

Purificazione enzimatica

Sequenziamento

Analisi delle sequenze

Assemblaggio di sequenze

Analisi di blast in databse

CLASSIFICAZIONE BATTERICA
FENOTIPICA GENOTIPICA

Analisi genotipica

indagine sulle caratteristiche genetiche dei batteri che
permette di ottenere un fingerprinting molecolare e quindi
di identificare un microrganismo

Analisi della sequenza nucleotidica del gene che codifica per
l'RNA ribosomale 16S:

gene lungo circa 1500nt

la sua sequenza è caratterizzata da regioni conservate,
semiconservate e variabili

la sua struttura tridimensionale è determinante per la
sua funzionalità

16S rRNA
STRUTTURA SECONDARIA
STRUTTURA TRIDIMENSIONALE

Scelta del gene 16S rRNA

è una molecola ubiquitaria presente in tutti i procarioti

è un gene con un elevato grado di conservazione

mutazioni nelle regioni conservate del gene determinano la
distanza filogenetica dei microrganismi

le regioni variabili permettono di distinguere tra loro
batteri che appartengono a specie diverse

confrontandola con le sequenze note presenti nelle banche
dati, è possibile identificare un microrganismo

per l'identificazione di un microrganismo sono sufficienti le
prime 500 basi del gene

ottenere la sequenza del 16S rDNA è relativamente
semplice, grazie alla PCR e all'utilizzo dei sequenziatori
automatici

Tipo di servizio:

Bact 16S da 1500: sequenziamento dell'intero gene (6
sequenze)

Bact 16S da 500: sequenziamento delle prime 500 basi
del gene (2 sequenze)
Ceppi di Brevibacterium
Jill E. Clarridge. Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identiﬁcation of
Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases
CLINICAL MICROBIOLOGY REVIEWS, Oct. 2004, p. 840–862
1500 bp 500bp

Procedura

lisi delle cellule di una colonia batterica

amplificazione del gene 16S rDNA

verifica e quantificazione della PCR

purificazione

sequenziamento del gene

analisi e assemblaggio delle sequenze

confronto della sequenza nucleotidica ottenuta con quelle
presenti in banca dati appartenenti ad altri microrganismi
(BLAST; URL: http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi):

identificazione del microrganismo

Isolamento e lisi delle cellule
batteriche

prelevare con la punta di una micropipetta una
singola colonia

risospenderla in 50µl di H2O fino ad ottenere una
sospensione torbida

incubare a 100°C per 5 minuti

Amplificazione del gene 16S rDNA

PCR: tecnica che permette l'amplificazione di una specifica
regione di DNA (Mullis, 1986)

La reazione avviene grazie all'azione di una DNA polimerasi
termostabile, la Taq polimerasi

La reazione di PCR consiste nella ripetizione di cicli termici
ognuno dei quali è costituto da tre fasi:
1. Denaturazione (95°C)
2. Annealing (50-65°C)
3. Estensione (68-72°C)

Reagenti e ciclo

DNA stampo: doppio filamento

primer: corti oligonucleotidi complementari agli
estremi 5' e 3' del segmento da amplificare
(inneschi)

DNA polimerasi: Taq polimerasi proveniente dal
batterio termofilo Thermus aquaticus
 MgCl2
: cofattore per la DNA polimerasi

dNTPs: desossiribonucleosidi trifosfati da
polimerizzare
Struttura della doppia elica di DNA

PCR
REAGENTI Q.TA' FINALE
Buffer 1X
MgCl2 1.5mM
dNTPs 0.2mM
P.For 1μM
P.Rev 1μM
microlisato di batterio 2 μl
Taq pol 1U
H2O deionizzta
volume finale 20μl
portare a
volume
CICLO
95 °C 1'
95 °C 1'
55 °C 1' x30
72 °C 45''
72 °C 7'
25 °C 20'
EFFETTO PLATEAU:

Primer di PCR/sequenziamento
Caratteristiche di un buon primer di PCR/sequenziamento:

Lunghezza ottimale: 20 nucleotidi

Contenuto in C/G tra il 40-60%

Tm: tra 50°C e 60°C
Tm = [4(G + C) + 2(A + T)] °C

Specifità con DNA stampo

Non devono contenere sequenze ripetute

Nella costruzione dei primer di sequenziamento considerare il
fatto che in genere le prime 20-25 basi non sono risolte
correttamente.

Non devono contenere regioni complementari al loro interno
(formazione di forcine)

Evitare la formazione di dimeri di primer

Primer di PCR/sequenziamento

STRUTTURA A FORCINA:
interazione intramolecolare tra
nucleotidi del singolo primer

SELF DIMER: interazione
intermolecolare tra due
molecole del primer dello
stesso tipo

CROSS DIMER: interazione tra
due molecole di primer di tipo
diverso

Programmi di progettazione di primer

PRIMER3 (URL: http://frodo.wi.mit.edu/primer3/): maschera
principale dell'interfaccia web del software

PRIMER3: maschera di selezione delle opzioni per la ricerca
di primer dell'interfaccia web del software

Programmi di analisi di primer

OLIGO ANALYZER
http://eu.idtdna.com/analyzer/applications/oligoanalyzer/de
fault.aspx

Primer Bact 16S
BACT16S da 500 bp

8FLP-534REV

63F-534REV

8FLP-806REV

63F-806REV
BACT16S da 1500 bp

8FLP-1571REV

63F-1571REV

8FLP-1492REV

63F-1492REV
Primer universali disegnati sulle regioni conservate del gene:

Verifica e quantificazione della PCR
Elettroforesi su gel d'agarosio:

agarosio 1%

colorante gel

loading dye

marcatore di peso molecolare

Purificazione enzimatica (Exosap)

Esonucleasi I: degradazione primer

Fosfatasi alcalina: degradazione dNTPs
Protocollo:
Ciclo:
prodotto di PCR
esonucleasi I 5U
fosfatasi alcalina 1U
5µl
37°C 15'
80°C 15'

Purificazione enzimatica (Exosap)

semplice, veloce, economico

non c'è alcuna perdita di DNA
Vantaggi:
Svantaggi:

non vengono eliminati i sali che possono interferire con il
sequenziamento

alcune taq possono lasciare residui che interferiscono con il
sequenziamento

gli enzimi sono estremamente sensibili al calore e si
degradano facilmente

un eccesso di primer residui può saturare la capacità di
lavoro degli enzimi

Allestimento campioni per
sequenziamento

Quantità di DNA necessarie:

Quantità di primer necessarie per una reazione: 3,2 pmoli

Preparare per ogni campione un tubo da sequenziare con il
primer for, e uno da sequenziare con il primer rev

Seccare a 65°C (non più di 15 µl di materiale) o a temperatura
ambiente
500 bp 1500bp
1X 5-10ng 15-30ng
2X 10-20ng 30-60ng

Risultati
L'utente riceverà come risultati:

i cromatogrammi delle singole sequenze

file con la sequenza consenso in formato testo
>nome campione_consenso_
ATTAAGAGAGCTTGCTCTTTTAATACTTAGTGGCGCACGGGTGAGTAATG
TATAGTTAATCTGCCCTACACTGGAGGACAACAGTTAGAAATGACTGCTA
ATACTCCATACTCCTTCTTAACATAAGTTAAGTCGGGAAAGTTTTTCGGT
GTAGGATGAGACTATATTGTATCAGCTAGTTGGTAAGGTAATGGCTTACC
AAGGCTTTGACGCATAACTGGTCTGAGAGGATGATCAGTCACACTGGAAC
TGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATATTGCTC
AATGGGGGAAACCCTGAAGCAGCAACGCCGCGTGGAGGATGACACTTTTC
GGAGCGTAAACTCCTTTTGTTAGGGAAGAACCATGACGGTACCTAACGAA
TAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGACC


file con i risultati della ricerca di omologia (blast)

Limiti e possibili fallimenti
Le cause di fallimento possono essere diverse:

presenza nel microlisato di sostanze che inibiscono
la PCR

presenza di batteri non appartenenti alla stessa
colonia

i primer universali potrebbero non riconoscere tutte
le specie

non tutte le specie di batteri si lisano con il calore

Vantaggi
Analisi della sequenza del gene che codifica per il 16S:

metodo di tipizzazione batterica molto più accurato
e riproducibile rispetto ai test fenotipici

specificità, sensibilità, riproducibilità, rapidità

estrema varietà di campi di applicazione
(identificazione di batteri, caratterizzazione di
popolazioni microbiche isolate da ambienti naturali,
scoperta di nuovi patogeni)

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