Presentazione tesi magistrale
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Presentazione della mia tesi magistrale in Biotecnologie per l'Alimentazione incentrata sullo studio del potenziale alterante su prodotti lattiero caserari del batterio Pseudomonas fluorescens.
Presentazione tesi magistrale
- 1. Valutazione del potenziale alterante di ceppi di Pseudomonas fluorescens Relatore: Dott.ssa Barbara Cardazzo Correlatore: Dott.ssa Nadia Andrea Andreani Laureando: Andrea Di Giuseppe Matricola n. 1062678
- 2. Il genere Pseudomonas Phylum: Proteobacteria Classe: 粒-Proteobacteria Ordine: Pseudomonadales Famiglia: Pseudomonadaceae Gram negativo Dimensioni (0.5-1.01.5-5.0 亮m) Uno o pi湛 flagelli polari Aerobio Asporigeno Mesofilo e psicrotollerante Catalasi e Ossidasi positivo Ubiquitario Specie patogene per luomo: Ex. Pseudomonas aeruginosa Specie fitopatogene: Ex. Pseudomonas syringae Specie alteranti per gli alimenti: Ex. Pseudomonas fluorescens
- 3. Pseudomonas spp. 1) Produzione di enzimi: proteasi, lipasi, lecitinasi 2) Produzione di pigmenti: Piorubina Piomelanina Pioverdina Piocianina
- 4. Scopo della tesi Caratterizzazione fenotipica e genotipica mediante MLST di ceppi Pseudomonas fluorescens. Su sette nuovi ceppi isolati da matrici alimentari Saggio TNBS e dellazocaseina per la valutazione del potenziale proteolitico rispettivamente in latte e ricotta di P. fluorescens. Analisi del trascritto del gene aprX . Su ceppi Type Strains Screening sulla presenza/assenza del gene aprX su ceppi di campo
- 5. Campionamento dei ceppi 18 Type Strains (ceppoteca tedesca DSMZ, ceppoteca spagnola CECT) 86 ceppi di campo isolati da matrici alimentari
- 6. Caratterizzazione fenotipica Pseudomonas Agar Base CFC Supplement Potato Dextrose Agar Ceppo Crescita in CFC PAB Produzione pigmento in PDA SAL1 + + BU3 + + PCA3 + + EL1 + + ML1 + + 811/2 + + 811/1 + -
- 7. Caratterizzazione genotipica Primers Genes glnS glutamyl-tRNA synthetase gyrB DNA gyrase subunit B ileS isoleucyl-tRNA synthetase nuoD NADH dehydrogenase I chain D recA recombinase A rpoD RNA polymerase -subunit rpoB RNA polymerase 硫-subunit Identificazione dei Sequence Type (ST) tramite il software DataMonkey Costruzione di un albero filogenetico di tipo Maximum Likelihood (PhyML)
- 9. Proteasi AprX P. fluorescens Trattamento termico Alterazione del prodotto 1. Valutazione della capacit proteolitica mediante il saggio 2,4,6- Trinitrobenzenesulfonic acid (TNBS) 2. Studio del trascritto del gene aprX 3. Valutazione della capacit proteolitica mediante il test dellazocaseina
- 10. 1. Valutazione del potenziale proteolitico (saggio TNBS) Sospensione batterica 108 UFC/ml 100亮l 10 ml latte UHT 10 ml latte UHT 103 UCF/ml 10 ml latte UHT 100亮l 24 h a 22属C 24 h a 22属C 5 giorni a 5属C diluizioni seriali Trattamento termico 2 settimane a 37属C Lettura spettrofotometrica alla di 420 nm
- 11. -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 -0.4 -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 1) 24 ore a 22 属C 2) 5 giorni a 5 属C 3) 15 giorni a 37 属C Ceppi analizzati Specie batterica DSM1 Pseudomonas gessardii DSM2 Pseudomonas brenneri DSM3 Pseudomonas mandelii DSM4 Pseudomonas jessenii DSM5 Pseudomonas koreensis DSM6 Pseudomonas orientalis DSM7 Pseudomonas synxantha DSM8 Pseudomonas azotoformans DSM9 Pseudomonas ludensis DSM10 Pseudomonas rhodesiae DSM11 Pseudomonas veronii DSM12 Pseudomonas libanensis DSM13 Pseudomonas lemonnieri CECT1 Pseudomonas corrugata CECT2 Pseudomonas marginalis CECT3 Pseudomonas fluorescens CECT4 Pseudomonas fragi CECT5 Pseudomonas chlororaphis -0.3 -0.2 -0.1 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5
- 12. 2. Analisi del trascritto del gene aprX Ceppi analizzati Specie batterica Espressione aprX a 22 属C Espressione aprX a 5 属C DSM6 Pseudomonas orientalis + + DSM9 Pseudomonas ludensis - - DSM10 Pseudomonas rhodesiae + - DSM12 Pseudomonas libanensis + - CECT2 Pseudomonas marginalis - - CECT3 Pseudomonas fluorescens + - CECT4 Pseudomonas fragi + - mRNA aprX cDNA PCR-end point TNBS a 22 属C TNBS a 5 属C - - - - - - - - - - - - - - TNBS a 37 属C + + + - - + -
- 13. Ceppi analizzati Specie batterica Estrazione RNA a 22 属C Estrazione RNA a 5 属C TNBS a 22 属C TNBS a 5 属C TNBS a 37 属C Azocaseina DSM6 Pseudomonas orientalis + + - - + + DSM9 Pseudomonas ludensis - - - - + + DSM10 Pseudomonas rhodesiae + - - - + + DSM12 Pseudomonas libanensis + - - - - + CECT2 Pseudomonas marginalis - - - - - - CECT3 Pseudomonas fluorescens + - - - + + CECT4 Pseudomonas fragi + - - - - + 3. Test dellazocaseina 0.0000 0.1000 0.2000 0.3000 0.4000 0.5000 0.6000 0.7000 0.8000 0.9000 1.0000 cect2 cect3 cect4 dsm6 dsm9 dsm10 dsm12 bianco 1 ml di sospensione batterica 108 UFC/ml 5 属C per una settimana 125 袖l di azocaseina 37 属C overnight Lettura spettrofotometrica alla di 450 nm
- 14. Screening sulla presenza/assenza del gene aprX 92.64% 7.36% positivo negativo PCR-end point sul gene aprX su 68 ceppi di campo Molte specie nonostante posseggano il gene aprx non hanno attivit proteolitica
- 15. Conclusioni Dei sette ceppi analizzati sei sono produttori di blu riscontrabile sia da analisi fenotipiche che genotipiche. La tecnica MLST 竪 un buon metodo per clusterizzare i ceppi produttori di blu. Lattivit dallAprX 竪 specie specifica e temperatura specifica. Pseudomonas ludensis 竪 in grado di produrre probabilmente proteasi alternative allAprX.