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Tesi di Laurea*Facolt¨¤ di Scienze Matematiche Fisiche e Naturali*Corso di Laurea Scienze Biologiche

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Marco Zaccaria
Marco Zaccaria

Studio dell"espressione proteica in cervelletto di topo wild type e knock out per Ras-GRF1, uno scambiatore neuronale di Ras

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UNIVERSITA¡¯ degli STUDI di MILANO Facolt¨¤ di Scienze Matematiche, Fisiche e Naturali Corso di Laurea in Scienze Biologiche DIPARTIMENTO DI SCIENZE BIOMOLECOLARI E BIOTECNOLOGIE Studio dell¡¯ espressione proteica in cervelletto di topo wild type e knock out per Ras-GRF1, uno scambiatore neuronale di Ras
CICLO delle PROTEINE Ras
Topi knock out sono vitali e fertili e non mostrano difetti morfologici Mostrano per¨° alcune peculiarit¨¤: Difetti nei fenomeni di plasticit¨¤ sinaptica e nei meccanismi di formazione della memoria a lungo termine 2. Cellule ippocampali di topi knock out mostrano un¡¯aumentata eccitabilit¨¤ neuronale intrinseca 3. Topi knock out sono maggiormente suscettibili a trattamenti con agenti convulsivanti Topi knock out sottoposti a trattamento cronico con cannabinoidi non sviluppano tolleranza nei fenomeni analgesici e locomotori TOPI KNOCK OUT PER Ras-GRF1
Confronto del pattern proteico da estratti di cervelletto di topi wt verso topi ko per Ras GRF1 Frazionamento cellulare attraverso centrifugazioni differenziali in tre estratti: - citosol ? S1 - mitocondri ? P1 - Microsomi/membrane ? P2 Mediante frazionamento ¨¨ possibile arricchire l¡¯estratto in proteine specifiche per una determinata frazione Prima dimensione: IsoElettroFocalizzazione (IEF) pH 3-10 NL Seconda dimensione : Elettroforesi su Gel di PoliAcrilammide (SDS-PAGE) Colorazione con nitrato d¡¯argento (Silver Staining) Acquisizione immagini (Image Master 2D Platinum) Analisi dei dati. Scopo: Gli esperimenti sono stati eseguiti su tre topi per ogni singola condizione.
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WT
KO
PROTEINE CITOSOLICHE ANALIZZATE MEDIANTE MALDI-TOF
Conclusioni : Analisi qualitativa mostra un numero molto ridotto di proteine presenti in un caso ed assenti nell¡¯altro. Una delle proteine identificate mediante MALDI-TOF risulta essere l¡¯ enzima amminoacilasi 1 Per gli altri spot siamo ancora in attesa dell¡¯analisi di spettrometria di massa Prospettive future: Analisi quantitativa: cambiamento del livello di espressione proteico Analisi funzionale delle proteine identificate Studiare le differenze di espressione proteica fra topi trattati cronicamente con THC

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  • 2. CICLO delle PROTEINE Ras
  • 3. Topi knock out sono vitali e fertili e non mostrano difetti morfologici Mostrano per¨° alcune peculiarit¨¤: Difetti nei fenomeni di plasticit¨¤ sinaptica e nei meccanismi di formazione della memoria a lungo termine 2. Cellule ippocampali di topi knock out mostrano un¡¯aumentata eccitabilit¨¤ neuronale intrinseca 3. Topi knock out sono maggiormente suscettibili a trattamenti con agenti convulsivanti Topi knock out sottoposti a trattamento cronico con cannabinoidi non sviluppano tolleranza nei fenomeni analgesici e locomotori TOPI KNOCK OUT PER Ras-GRF1
  • 4. Confronto del pattern proteico da estratti di cervelletto di topi wt verso topi ko per Ras GRF1 Frazionamento cellulare attraverso centrifugazioni differenziali in tre estratti: - citosol ? S1 - mitocondri ? P1 - Microsomi/membrane ? P2 Mediante frazionamento ¨¨ possibile arricchire l¡¯estratto in proteine specifiche per una determinata frazione Prima dimensione: IsoElettroFocalizzazione (IEF) pH 3-10 NL Seconda dimensione : Elettroforesi su Gel di PoliAcrilammide (SDS-PAGE) Colorazione con nitrato d¡¯argento (Silver Staining) Acquisizione immagini (Image Master 2D Platinum) Analisi dei dati. Scopo: Gli esperimenti sono stati eseguiti su tre topi per ogni singola condizione.
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  • 6. ?
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  • 8. KO
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  • 10. Conclusioni : Analisi qualitativa mostra un numero molto ridotto di proteine presenti in un caso ed assenti nell¡¯altro. Una delle proteine identificate mediante MALDI-TOF risulta essere l¡¯ enzima amminoacilasi 1 Per gli altri spot siamo ancora in attesa dell¡¯analisi di spettrometria di massa Prospettive future: Analisi quantitativa: cambiamento del livello di espressione proteico Analisi funzionale delle proteine identificate Studiare le differenze di espressione proteica fra topi trattati cronicamente con THC