CLONING AND EXPRESSION OF BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR (FGF-2) IN ESCHERCHIA COLI
1 like1,146 views
CLONING AND EXPRESSION OF BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR (FGF-2) IN ESCHERCHIA COLI
- 1. TR働畛NG 畉I H畛C CNG NGHI畛P TP. HCM VI畛N CNG NGH畛 SINH H畛C V TH畛C PH畉M CN B畛 H働畛NG D畉N : Tp. H畛 Ch鱈 Minh, th叩ng 07, nm 2012
- 2. N畛I DUNG BO CO 1 T畛ng quan v畛 FGF-2 2 Ph動董ng ph叩p th畛c hi畛n 3 K畉t qu畉 v bi畛n lu畉n 4 K畉t lu畉n v 畛 ngh畛
- 3. NHN T畛 TNG TR働畛NG FGF-2 Nghi棚n c畛u FGF-2 Y h畛c M畛 ph畉m Tng sinh, bi畛t h坦a t畉 bo Lnh v畉t th動董ng H狸nh thnh m畉ch
- 4. 畛NG D畛NG FGF-2 Thnh ph畉n trong nu担i c畉y t畉 bo g畛c ph担i ng動畛i Nghi棚n c畛u i畛u tr畛 b畛nh thi畉u m叩u c畛c b畛 i畛u tr畛 b畛ng Ngn ng畛a s畉o l畛i Y h畛c Ngn ng畛a s畛 l達o h坦a c畛a da Lm en t坦c M畛 ph畉m
- 5. C畉U TRC FGF-2 FGF-2 D畉ng h狸nh c畉u. Ch畛a 12 phi畉n 硫 畛i song song. FGF-2 ch畛a b畛n cysteine nh動ng l畉i kh担ng c坦 c畉u n畛i disulfide n畛i ph但n t畛.
- 6. FGF-2 NGU畛N 畛NG V畉T T畉 bo 畛ng v畉t Chi ph鱈 cao Hi畛u qu畉 kinh t畉 th畉p Gi畛ng v畛i t畛 nhi棚n
- 7. 働u i畛m D畛 thao t叩c di truy畛n M畉t 畛 nu担i c畉y cao M担i tr動畛ng nu担i c畉y 董n gi畉n, r畉 ti畛n Hi畛u qu畉 s畉n xu畉t protein t叩i t畛 h畛p cao H畛 TH畛NG BI畛U HI畛N Escherichia coli H畛 th畛ng E. coli hon ton th鱈ch h畛p 畛 bi畛u hi畛n FGF-2 (FGF-2 kh担ng bi畉n 畛i sau d畛ch m達, kh担ng c坦 c畉u n畛i disulfide)
- 8. S畉N PH畉M TH働NG M畉I FGF-2 1260USD/mg 1250USD/mg
- 9. M畛C TIU 畛 TI T畉O DNG V BI畛U HI畛N PROTEIN FGF-2 (BASIC FIBROBLAST GROWTH FACTOR) TI T畛 H畛P TRONG Echerichia coli
- 10. N畛I DUNG TH畛C HI畛N C畉u tr炭c ch畛ng E. coli DH5留/pET-fgf2 C畉u tr炭c ch畛ng E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2 Ki畛m tra s畛 bi畛u hi畛n c畛a protein FGF-2 1 2 3
- 11. S 畛 T畉O DNG BamHI, NdeI PCR/BamHI, NdeI Gen fgf2 Bi畉n n畉p pET-His 4636bp T7 Promoter MCS T7 Terminator AmpR pBR322 Origin pET-His pIDTSmart-il2 2362bp Text Origin M13 Forward M13 Reverse il2 KanR pIDT- fgf2 pET-His/ BamHI, NdeI N畛i Sng l畛c pET-fgf2
- 12. K畉T QU畉 THU NH畉N pET-His/BamHI, NdeI 1, Thang DNA 1kb; 2, Plasmid pET-His; 3, pET-His/BamHI,NdeI. NdeI/ BamHI
- 13. K畉T QU畉 THU NH畉N GEN fgf2 1, Thang DNA 1kb plus 2, PCR o畉n gene fgf2 v畛i c畉p m畛i FGF2-F v FGF2-R
- 14. Sng l畛c PCR Khu畉n l畉c E. coli DH5留 K畉T QU畉 BI畉N N畉P VO CH畛NG E. coli DH5留 1, 挑a 畛i ch畛ng 2, E. coli DH5留 / pET-fgf2
- 15. SNG L畛C TH畉 BI畉N N畉P B畉NG PCR KHU畉N L畉C 1, Thang DNA 1kb; 2, PCR pET-His/FGF2-F v FGF2-R; 3, Gen fgf2; 4, PCR khu畉n l畉c/FGF2-F v FGF2-R; 5, PCR pET-His/T7promoter v T7terminator; 6, 7, PCR khu畉n l畉c/T7promoter v T7terminator. 450bp fgf2 650bp T7terminatorT7 promoter
- 16. KI畛M TRA PLASMID TI T畛 H畛P 1, Thang DNA 1kb; 2, PCR pET-His; 3, PCR pET-fgf2 m畛i 畉c hi畛u FGF2-F v FGF2-R; 4, PCR pET-His T7promoter v T7terminator; 5, PCR pET-fgf2 T7promoter v T7terminator; 8, pET-fgf2/BamHI, NdeI. 450bp fgf2 650bp T7terminatorT7 promoter PCR RE
- 17. GI畉I TRNH T畛 Tr狸nh t畛 gen NG so v畛i tr狸nh t畛 l箪 thuy畉t 100% v 畛ng khung d畛ch m達
- 18. C畉u tr炭c ch畛ng thnh c担ng E. coli DH5留/pET-fgf2
- 19. N畛I DUNG TH畛C HI畛N 1 2 3
- 20. E. coli BL21(DE3) pET-fgf 1, 挑a 畛i ch畛ng 2, T畉 bo E. coli BL21(DE3)/ pET-fgf 1, Thang chu畉n 1kb; 2, PCR plasmid pET-His; 3, PCR plasmid pIDT-fgf2; 4, PCR khu畉n l畉c E. coli BL21(DE3). KI畛M TRA B畉NG PCR KHU畉N L畉C
- 21. C畉u tr炭c ch畛ng thnh c担ng E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2
- 22. N畛I DUNG TH畛C HI畛N C畉u tr炭c ch畛ng E. coli DH5留/pET-fgf2 C畉u tr炭c ch畛ng E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2 Ki畛m tra s畛 bi畛u hi畛n c畛a protein FGF-2 1 2 3
- 23. E. coli BL21(DE3)/ pET-fgf OD600 =0,8 - 1 B畛 sung IPTG 0,5mM Ho畉t h坦a Thu m畉u KI畛M TRA S畛 BI畛U HI畛N C畛A FGF-2 SDS-PAGE WESTERN BLOT + n畛i + t畛aLWM IPTG + t畛ng + n畛i + t畛aLWM + t畛ng
- 24. Bi畛u hi畛n thnh protein FGF-2 trong t畉 bo E. coli BL21 (DE3)
- 25. C畉u tr炭c thnh c担ng ch畛ng E. coli DH5留/pET-fgf2 C畉u tr炭c thnh c担ng ch畛ng E. coli BL21(DE3)/pET-fgf2 Bi畛u hi畛n thnh c担ng protein FGF-2 trong t畉 bo E. coli BL21 (DE3) 1 2 3 K畉T LU畉N
- 26. KI畉N NGH畛 1 T畛i 動u c叩c i畛u ki畛n bi畛u hi畛n FGF-2 2 L棚n men thu nh畉n FGF-2 qui m担 ph嘆ng th鱈 nghi畛m 3 Kh畉o s叩t quy tr狸nh tinh ch畉 FGF-2
Editor's Notes
- #2: K鱈nh th動a qu箪 h畛i 畛ng, 動畛c s畛 cho ph辿p c畛a h畛i 畛ng, h担m nay em xin tr狸nh by b叩o c叩o 畛 ti do th畉c s挑 v ti畉n s挑 h動畛ng d畉n.
- #4: Nh但n t畛 tng tr動畛ng nguy棚n bo s畛i FGF-2 l m畛t protein a ch畛c nng, tham gia i畛u h嘆a s畛 tng sinh v bi畛t h坦a t畉 bo, k鱈ch th鱈ch s畛 h狸nh thnh m畉ch m叩u m畛i t畛 m畉ch m叩u s畉n c坦, ch畛a lnh v畉t th動董ng v s畛a ch畛a m担V畛i c叩c ch畛c nng sinh h畛c tr棚n, FGF-2 ang 動畛c quan t但m nghi棚n c畛u 畛 畛ng d畛ng trong y h畛c, nghi棚n c畛u v m畛 ph畉m. S畛a: sau slide ny th棚m 1 slide i s但u vo 畛ng d畛ng. K畛 ra trong nghi棚n c畛u lm g狸, y h畛c lm g狸, m畛 ph畉m lm g狸 (ch畛 li畛t k棚 箪 ch鱈nh)
- #7: Tr動畛c 但y, c叩c s畉n ph畉m FGF-2 th動畛ng 動畛c thu nh畉n b畉ng t叩ch chi畉t t畛 c叩c d嘆ng t畉 bo 畛ng v畉t 働u i畛m 畉m b畉o ho畉t t鱈nh s畉n ph畉m Nh動畛c i畛m quy tr狸nh tinh ch畉, thu nh畉n g畉p nhi畛u kh坦 khn, gi叩 thnh v hi畛u qu畉 kh担ng cao. 際際滷 k畉 ti畉p)
- #8: Nh畉m kh畉c ph畛c nh畛ng nh動畛c i畛m tr棚n, 畛ng d畛ng CN DNA t叩i t畛 h畛p t畉o ra ch畛ng E.coli 畛 s畉n xu畉t FGF-2. V m畛t l箪 do kh叩c n畛a l(
- #9: V畛i c叩c 動u i畛m tr棚n, nhi畛u n動畛c tr棚n th畉 gi畛i 達 ti畉n hnh nghi棚n c畛u v s畉n xu畉t FGF-2 t叩i t畛 h畛p trong E.coli 畛 quy m担 c担ng nghi畛p nh畉m t畉o ra l動畛ng l畛n FGF-2 v畛i gi叩 thnh th畉p. Tuy nhi棚n, 畛 Vi畛t Nam gi叩 thnh FGF-2 v畉n c嘆n kh叩 cao do ph畉i nh畉p kh畉u hon ton t畛 n動畛c ngoi G但y kh坦 khn cho vi畛c nghi棚n c畛u v 畛ng d畛ng FGF-2 畛 Vi畛t Nam. Xu畉t ph叩t t畛 ti畛m nng 畛ng d畛ng v nhu c畉u th畛c ti畛n 畛i v畛i FGF-2 畛 Vi畛t Nam M畛c ti棚u 畛 ti
- #11: V 畛 畉t 動畛c m畛c ti棚u 坦, em 達 ti畉n hnh th畛c hi畛n c叩c n畛i dung sau. Em xin i c畛 th畛 vo n畛i dung th畛 nh畉t... C坦 hi畛u 畛ng ho畉c slide k畉 ti畉p lm m畛 i 2 n畛i dung c嘆n l畉i, 畛 n畛i l棚n n畛i dung ch鱈nh
- #12: Gen fgf2 v plasmid pET-His 動畛c x畛 l箪 b畉ng BamHI v NdeI, sau 坦 動畛c n畛i b畉ng T4 ligase 畛 t畉o vector TTH pET-fgf2..., bi畉n n畉p plasmid vo tb E.coli va sng l畛c b動畛c 畉u tr棚n m担i tr動畛ng LB Amp. Nh畛ng t畉 bo d畛 tuy畛n s畉 動畛c ki畛m tra b畉ng PCR v gi畉i tr狸nh t畛. H狸nh kh担ng r探, vi畉t r探 l棚n c叩c b動畛c ch鱈nh nh動 c畉t b畉ng NdeI v BamHI, n畛i , bi畉n n畉p 畛 d畛 nh狸n, nh畛ng ph畉n ki畛m tra (PCR, gi畉i tr狸nh t畛 th狸 thu nh畛 l畉i)
- #13: Plasmid b畛 m辿o, ph坦ng to h狸nh i畛n di, ch炭 th鱈ch nh畛 l畉i 畛 chu畉n b畛 m畛t l動畛ng l畛n vector cho ph畉n 畛ng n畛i, ch炭ng t担i ti畉n hnh c畉y E.coli DH5留 mang plasmid pET-His vo 畛ng nghi畛m ch畛a m担i tr動畛ng LB l畛ng, nu担i c畉y l畉c qua 棚m 畛 37oC, t叩ch chi畉t v x畛 l箪 plasmid thu nh畉n 動畛c b畉ng hai enzyme c畉t h畉n ch畉 BamHI v NdeI. K畉t qu畉 thu nh畉n plasmid 動畛c tr狸nh by trong h狸nh: 畛 gi畉ng s畛 2 plasmid t叩ch chi畉t ban 畉u t畛n t畉i tr畉ng th叩i t畛 nhi棚n, t動董ng 畛ng v畛i c叩c v畉ch tr棚n gel. Sau khi 動畛c x畛 l箪 v畛i hai enzyme c畉t BamHI v NdeI, plasmid tr畛 v畛 d畉ng th畉ng c坦 k鱈ch th動畛c kho畉ng 4600bp (gi畉ng 3) n畉m gi畛a hai v畉ch 4000bp v 5000bp c畛a thang 1kb. Nh動 v畉y, ch炭ng t担i 達 t叩ch chi畉t 動畛c plasmid pET-His v c畉t m畛 v嘆ng thnh c担ng plasmid ny.
- #14: K畉t qu畉 動畛c tr狸nh by trong h狸nh cho th畉y 畛 gi畉ng s畛 2 xu畉t hi畛n m畛t v畉ch DNA c坦 k鱈ch th動畛c kho畉ng 450bp khi so s叩nh v畛i thang chu畉n 1kb plus (gi畉ng 1), b畉ng v畛i k鱈ch th動畛c d畛 o叩n c畛a gen fgf2. Nh動 v畉y, ch炭ng t担i 達 khu畉ch 畉i v x畛 l箪 動畛c o畉n gene m畛c ti棚u.
- #15: gen fgf2 v plasmid pET-His sau 達 動畛c x畛 l箪 b畉ng BamHI v NdeI, sau 坦 動畛c n畛i b畉ng T4 ligase 畛 t畉o vector TTH pET-fgf2..., bi畉n n畉p plasmid vo tb E.coli DH5 v sng l畛c b動畛c 畉u tr棚n m担i tr動畛ng LB Amp. Nh畛ng t畉 bo d畛 tuy畛n s畉 動畛c ki畛m tra bng PCR.. gi畉i tr狸nh t畛
- #16: Ph坦ng to h狸nh, thu nh畛 gi畉i th鱈ch 畛 kh畉ng 畛nh c叩c th畛 bi畉n n畉p thu 動畛c ch畛a plasmid t叩i t畛 h畛p pET-fgf2, ch炭ng t担i 達 ti畉n hnh PCR khu畉n l畉c c叩c th畛 bi畉n n畉p b畉ng c畉p m畛i 畉c hi畛u FGF2-F v FGF2-R v c畉p m畛i n畉m ngoi v湛ng MCS T7promoter v n畉m ngoi v湛ng MCS. K畉t qu畉 i畛n di cho th畉y: 畛 gi畉ng 4 xu畉t hi畛n m畛t v畉ch PCR c坦 k鱈ch th動畛c n畉m gi畛a 2 v畉ch thang 250bp v 500bp, ngang v畛i v畉ch PCR c畛a m畉u ch畛ng d動董ng (gi畉ng 3). Trong khi 坦, 畛 gi畉ng 2 l 畛i ch畛ng 但m l plasmid pET-His kh担ng mang gen fgf-2 n棚n kh担ng c坦 s畉n ph畉m PCR. Nh動 v畉y, khu畉n l畉c 動畛c ki畛m tra b畉ng PCR c坦 mang gen fgf2. B棚n c畉nh 坦, 畛 gi畉ng 6, s畉n ph畉m PCR khu畉n l畉c b畉ng m畛i n畉m ngoi v湛ng MCS T7promoter v T7terminator cho th畉y m畛t v畉ch n畉m 畛 kho畉ng gi畛a v畉ch 500bp v 750bp c畛a thang chu畉n, ph湛 h畛p v畛i k鱈ch th動畛c o畉n mang gen gi畛a hai m畛i theo d畛 o叩n l kho畉ng 650bp. 但y l k鱈ch th動畛c c畛a gen fgf2 (450bp) v m畛t ph畉n tr狸nh t畛 gi畛a hai m畛i tr棚n vector. Trong khi 坦, 畛 gi畉ng s畛 5 l s畉n ph畉m PCR s畛 d畛ng plasmid pET-His lm khu担n ch畛 cho m畛t v畉ch c坦 k鱈ch th動畛c kho畉ng 200bp. Nh動 v畉y, nh畛ng khu畉n l畉c ny c坦 th畛 ch畛a plasmid t叩i t畛 h畛p pET-fgf2
- #17: C叩c th畛 bi畉n n畉p cho k畉t qu畉 PCR khu畉n l畉c d動董ng t鱈nh 動畛c ti畉p t畛c t叩ch chi畉t thu nh畉n plasmid t叩i t畛 h畛p. Sau 坦, c叩c plasmid t叩i t畛 h畛p pET-fgf2 動畛c ph但n t鱈ch b畉ng ph動董ng ph叩p PCR v畛i c畉p m畛i 畉c hi畛u FGF2-F v FGF2-R; c畉p m畛i n畉m ngoi v湛ng MCS T7promoter v T7terminator v b畉ng enzyme c畉t h畉n ch畉. K畉t qu畉 i畛n di cho th畉y: 畛 gi畉ng th畛 3, cho th畉y xu畉t hi畛n m畛t v畉ch c坦 k鱈ch th動畛c n畉m gi畛a hai v畉ch thang 500bp v 750bp, t動董ng 畛ng v畛i k鱈ch th動畛c gen fgf-2 動畛c khu畉ch 畉i b畉ng m畛i 畉c hi畛u (450bp). B棚n c畉nh 坦, 畛 gi畉ng s畛 5 l s畉n ph畉m PCR plasmid t叩i t畛 h畛p b畉ng c畉p m畛i n畉m ngoi v湛ng MCS cho m畛t v畉ch c坦 k鱈ch th動畛c n畉m gi畛a kho畉ng 500-700bp t動董ng 畛ng v畛i t畛ng k鱈ch th動畛c c畛a gen fgf-2 v m畛t ph畉n tr狸nh t畛 gi畛a hai m畛i tr棚n plasmid. 畛ng th畛i, 畛 gi畉ng s畛 8 plasmid t叩i t畛 h畛p pET-fgf2 khi 動畛c c畉t b畉ng BamHI v NdeI cho hai v畉ch t動董ng 畛ng v畛i k鱈ch th動畛c plasmid pET-His (4600bp) v o畉n gen fgf2 (450bp) 動畛c n畛i vo. C叩c k畉t qu畉 ph但n t鱈ch b畉ng ph動董ng ph叩p PCR v enzyme c畉t gi畛i h畉n cho ph辿p k畉t lu畉n ch炭ng t担i 達 n畛i thnh c担ng gen fgf2 vo plasmid pET-His.
- #18: Nh畉m kh畉ng 畛nh 畛 ch鱈nh x叩c v畛 tr狸nh t畛 so v畛i thi畉t k畉 ban 畉u c滴ng nh動 s畛 畛ng khung d畛ch m達, c叩c plasmid t叩i t畛 h畛p sau khi 達 ki畛m tra s畛 hi畛n di畛n c畛a gen fgf2 動畛c t叩ch chi畉t v g畛i i gi畉i tr狸nh t畛. K畉t qu畉 gi畉i tr狸nh t畛 gen fgf2 tr棚n plasmid pET-fgf2 動畛c so s叩nh v畛i tr狸nh t畛 l箪 thuy畉t cho th畉y gen 達 動畛c t畉o d嘆ng c坦 畛 t動董ng 畛ng 100% so v畛i tr狸nh t畛 l箪 thuy畉t.
- #20: N畛i dung ti畉p theo l
- #21: Bi畉n n畉p plasmid t叩i t畛 h畛p pET-fgf2 vo tb E.coli BL21(DE3) va sng l畛c b動畛c 畉u tr棚n m担i tr動畛ng LB Amp 100. Nh畛ng t畉 bo d畛 tuy畛n s畉 動畛c ki畛m tra bng PCR khu畉n l畉c. K畉t qu畉 i畛n di cho th畉y 畛 gi畉ng 4 xu畉t hi畛n m畛t v畉ch DNA c坦 k鱈ch th動畛c b畉ng v畛i k鱈ch th動畛c c畛a m畉u ch畛ng d動董ng kho畉ng 450bp (gi畉ng 3)
- #22: Nh動 v畉y, ch炭ng t担i 達 c畉u tr炭c thnh c担ng ch畛ng E. coli BL21 (DE3) mang plasmid tth pET-fgf2
- #23: N畛i dung ti畉p theo l
- #24: Khu畉n l畉c Ecoli BL21/pET-fgf2 動畛c nu担i c畉y l畉c v c畉m 畛ng bng IPTG n畛ng 畛 0.5mM, sau 坦 ly t但m thu sinh kh畛i v bi畉n tinh m畉u. K畉t q畉u 動畛c ki畛m tra SDS-PAGE v WESTERN BLOT. 畛 gi畉ng 3 cho v畉ch protein v動畛t m畛c n畉m gi畛a v畉ch .... c畛a thang chu畉n, t動董ng 畛ng v畛i k鱈ch th動畛c 17kDa c畛a protein m畛c ti棚u. 畛ng th畛i ch炭ng t担i c滴ng kh畉o s叩t kh畉 nng tan cua protein m畛c ti棚u, gi畉ng 5 cho v畉ch protein v動畛t m畛c 炭ng k鱈ch th動畛c l箪 thuy畉t, ch畛ng t畛 protein m畛c ti棚u ch畛 y畉u n畉m trong pha tan. 畛 kh畉ng 畛nh k畉t qu畉 SDS-PAGE, ch炭ng t担i ti畉n hnh lai WESTERN v k畉t qu畉 tr棚n phim c坦 t鱈n hi畛u t動董ng 畛ng v畉ch m畛c ti棚u tr棚n gel.
- #26: Th担ng qua c叩c k畉t qu畉 th鱈 nghi畛m 達 動畛c tr狸nh by trong khu担n kh畛 畛 叩n ny, ch炭ng t担i c坦 th畛 動a ra c叩c k畉t lu畉n sau:
- #27: V畛i c叩c k畉t qu畉 b動畛c 畉u thu 動畛c, ch炭ng t担i c坦 m畛t s畛 畛 ngh畛 nh動 sau:
- #28: C畉m 董n th畉y, c担 v c叩c b畉n 達 l畉ng nghe