江欣宜
- 1. 摘要 誌謝 To identify whether Myosin V is involved in autophagy 江欣宜 長榮大學生物科技系 實習單位：中央研究院 生物化學研究所 指導老師：陳光超 博士 Autophagy（細胞自噬）是個體細胞遇到生存壓力時的一種體內自我保護機制，會產生雙層膜的構造，把細胞質裡面的物 質包裹起來，PE（phosphatidylethanolamine）接到LC3（Microtubule-associated protein 1 light chain 3）/Atg8 上，在LC3 接 上PE 同時會進行轉換成為更小分子的LC3-II-PE；利用和溶酶體的結合形成Autophagosomes（細胞自噬體），來分解一些 老舊胞器或蛋白質，最後提供我們胺基酸和能量所需。之前實驗室以果蠅和人類細胞為模式生物發現一個全新的Myosin light chain kinase；MLCK（類肌凝蛋白輕鏈激酶）為「Atg1蛋白質激酶」受質，Atg1會經由磷酸化MLCK去調控Myosin-II （肌凝蛋白-II）的活性；當在果蠅或人類細胞中降低MLCK或Myosin-II的表現量時，都會抑制細胞自噬體的形成。另外實 驗室也更進一步發現Atg1對Myosin-II活化的調控會影響到Atg9 membrane protien（Atg9膜蛋白）在高基氏體和細胞自噬體 間的來回循環移動，而Atg9被證明是細胞自噬體時提供脂質模形成所有。經由這些結論我想知道其他Myosin對Autophagy 的影響為何，因此我的主要是想探討Myosin-V（肌凝蛋白-V）對Autophagy的影響，以及是否參與形成autophagosomes。 經過兩個多月在中央研究院生物化學研究所陳光超博士實驗室學習，使我受益良多，更留下了許多難得的回憶和經驗。首先要感謝黃昭菱老師願意推薦我到中央研究院生物化 學研究所實習，很感激陳光超老師在我實習期間對於我實驗進行的方向與目標能給我適當的指導方針，也感謝在我實習期間負責帶我的彭文欣學姐，讓我學會很多實驗技巧與 方法之外，也讓我學會自己規劃實驗進度，更感謝實驗室其他學長姐們的照顧和幫助，讓我的實驗能進行得更順利，感謝宋瑩珠老師、黃惠蘭老師，和許宏猶老師擔任暑期專 題實習這門必修課的老師們對我們的關心和督促，最後我要感謝系上有這門課讓我們有另一個學習的機會。 The EMBO Journal (2011) Adi Kimchi Myosin-V 我所選用的Myosin是結構和Myosin-II很像的Myosin- V，它和Myosin-II一樣都有兩個Heavy chains，而比 較不同的地方在於Light chains的數目不同。 實驗中所使用細胞自噬的偵測 一、利用Western Blot偵測Myosin-V有無knock down的表現。 二、利用Western Blot偵測LC3-I蛋白轉換為較小蛋白LC3-II的表現。 三、利用Western Blot偵測p62 的蛋白質表現情形。 四、利用Immunofluorescence 的螢光表現觀察Myosin-V的表現情形。 五、利用Immunofluorescence 的螢光表現觀察LC3的表現與變化。 實驗設計 一、利用transfect shRNA到細胞中確認Myosin-V是否有被knock down的表現。 二、確認Myosin-V是否參與autophagy。 三、To construct Myosin V RNAi stable cell lines。 實驗結果 Figure 1 Western Blot to check myosin V knock down. 利用Western Blot來確定Myosin-V是否被 knock down了，才可以接下去確認是否參與autophagy，發現transfection 24 hr之後的蛋白表現不 是很明顯，而且兩種細胞表現強弱都不太一樣，所以之後也把時間拉長到48、72hr看其Myosin V的knock down表現。 細胞自噬過程中，細胞會產生雙層膜的構造，把細胞質裡面的物質包裹起 來，形成autophagosomes細胞自噬體，作用是可吞噬胞器和一些蛋白質，進 而和lysosomes結合，分解之，以確保其他細胞正常，和提供能量和胺基酸。 Nixon RA 2006 Trends Neurosci Figure 2 Western Blot to test MCF7-GFP LC3 cell in fed/starvation condition. MCF7-GFP LC3 cell處 理24hr在fed/starvation情況下LC3-I蛋白轉換為較 小蛋白LC3-II的表現，和GFP-LC3以及p62 的蛋白 質表現情形，可能因為處理時間不夠長，因此 沒有看到MyosinV的knock down表現。 Figure 3 Western Blot to check myosin V knock down. 將transfection時間拉長到48 、 72 hr之後，之前transfection 24 hr之後的蛋白 表現不是很明顯，把時間拉長到48、72hr就看 得到Myosin V的knock down表現。 GFP-LC3DAPIMergeMyosinVa shCTL -fed shCTL -starvation shmyo5 9489 -fed shmyo5 9489 - starvation shmyo5 9490 -fed shmyo5 9490 - starvation Figure 4 利用Immunofluorescence來看細胞autophagy表現. 藍色螢光的DAPI用來染核的部分， 由GFP-LC3的部分可以看到細胞在fed/starvation情況下的變化，細胞在fed下的GFP-LC3比較平 均 的 散 布 在 整 個 細 胞 中 ， 而 starvation 情 況 下 的 GFP-LC3 容 易 aggregate ， 表 示 確 實 走 向 Autophagy，紅色螢光用來看而Myosin V的表現，不管是fed/starvation情況下Myosin V都有看到， 表示Myosin V是沒有knock down的。 Figure 5 Lentiviral packing and infection之後利用 Western Blot to check myosin V knock down. 利用 Lentiviral packing and infection方法做Stable cell lines同 時，收細胞去做Western Blot確認Myosin V的knock down，發現都有knock down的表現。 MCF7-GFPLC3 sh myo5 1304 MCF7-GFPLC3 sh myo5 1587 MCF7-GFPLC3 sh myo5 9488 MCF7-GFPLC3 sh myo5 9489 MCF7-GFPLC3 sh myo5 9490 Figure 6 Stable cell lines. 利用2mg/ml G418、3.5μg/ml Puromycin抗生素培養液挑選MCF7 / GFP-LC3 knock down Myo5a的穩定細胞株。 結論 利用Lentiviral packing and infection運送shRNA 到細胞中對於目標基因作 known down比直接transfect shRNA plasmid 效率較好， 利用此方法幫實驗 室建立五個MCF7 / GFP-LC3 knock down Myo5a Stable cell lines， 而 Myosin-V對autophagy的影響之初步結果需要再確認之。 Autophagy