李欣频
- 1. 蝴蝶蘭花部發育基因PeSEP1, PeSEP2之功能分析 Functional Analysis of Floral Organ Identity Genes, PeSEP1 and PeSEP2 in Phalaenopsis 李欣频 長榮大學生物科技學系 實習單位：成功大學生命科學系 指導老師：陳虹樺 教授 背景介紹 實驗結果 阿拉伯芥中ABC model最初被提出來解釋調控花部基因發育， 製備insert，經由PCR反應放大PeSEP1與PeSEP2 基因，由洋 不同群的花器基因會去共同調控不同花器的發育，後來研究發 菜膠電泳分離 (圖四)。利用限制酶酵素(NotⅠ)辨識特殊切 現除了ABC群基因外尚D和E群基因參與調控花部發育。蝴蝶蘭 的特性，將insert DNA與pGEM-T Easy-vector切開。insert 中有相對應於阿拉伯芥的基因來調控蝴蝶蘭花部之發育，在 被成功切下其band大小約700bp。較上方的band大小約為 BCDE群基因中都有被發現。而我們是將E群基因中的有 3 Kb是被切下的pGEM-T Easy-vector (圖五) 。使用限制酶 PeSEP1,2來研究。 酵素將insert切下。 pBI121使用BamH Ι切下的PeSEP2大小約 花形介紹 是735 bp，且pBI121條帶約是14 Kb(圖六)。 1 2 1 2 3 4 5 1 2 3 Kb — 3 Kb — 2 Kb — 1.5 Kb — 800 bp — 1 Kb — 1 Kb — 700 bp — 0.7 Kb — 700 bp — 500 bp — 500 bp — 圖 四、PCR反應PeSEP1與 圖 五、以限制酶酵素切質體 圖 六、SAP反應回收後 PeSEP2 電泳圖。 DNA電泳圖。 pBI121電泳圖。 Lane1為PeSEP1為735 bp ， Lane1-8是以限制酶NotⅠ作用 Lane 1為回收後insert DNA, 圖 一 圖 二 Lane2為PeSEP2為744 bp ，兩 後之PeSEP1 及pGEM-T Easy- PeSEP1大小約在 744 bp， 條band明顯且專一。 vector Lane 2是SAP後pBI121 大小 蘭科植物花朵基本構造由(圖一、二)：花瓣(Petal)、花萼(Sepal)各 約在13 Kb。 3瓣，3片花瓣中上方2片成對，下側1片形狀與上方2片迥異，此花瓣 稱為〝唇瓣(Lip)〞。花中央有一個由雄蕊(Stamen)和雌蕊(Carpel) 以PCR方式確認insert正反方向，透過primer的組合，我們 結合而成的〝蕊柱(Column)〞，花粉塊(Pollinia)著生於蕊柱的先端， 可以知道insert的方向，並透過PCR放大後跑電泳檢測(圖 蕊柱是蘭科植物的特有特徵。 四)。 實驗目的 35S Forword primer GUS Reverse primer 1 2 3 4 5 探討蝴蝶蘭花部發育基因SEP基因之功能，但是由於蝴蝶蘭 的轉殖系統不發達且生長期太長，因此，用蝴蝶蘭轉殖系 PeSEP 2 Kb — 35S promoter ATG GUS 統來進行功能研究極度困難。所以我們將表現於花部發育 1 Kb — 裡的E群基因轉殖到生長期短、轉殖系統較穩定的阿拉伯芥 250bp 130bp 圖 七 上，觀察阿拉伯芥是否會有形態上的改變而去了解蝴蝶蘭 圖 八 SEP基因之功能。 圖 七和八、以PCR方式確認insert正反方向電泳圖及引子位置示意圖。 Lane 1-2是pBI121裡PeSEP1，使用35S(F) + SmaΙ(R) = 正接 實驗流程 Lane 3-5是pBI121裡PeSEP2，使用BamH Ι (F) + GUS(R) = 正接 S1和S2的大小約是700 bp 再加上Primer到基因的距離大約是900 bp 首先(圖三)使用特定Primer經由PCR放大後PeSEP基因(使基 因上有限制酶酵素切位)，然後接上T-vector再使用SmaI將 種植阿拉伯芥 PeSEP基因切下來，再接到pBI121上，接下來把帶有PeSEP基 因的pBI121 Transformation至E.coli DH 5α中使質體DNA 放大，然後再將放大後的plasmid DVA Transformation到 Agrobacterium Gv3101 中，再以農桿菌感染阿拉伯芥的方 式將基因轉殖到阿拉伯芥上面的前置作業。 圖 九、將阿拉伯芥種子種植 圖 十、長出3對子葉 圖 十一、開始抽梗 在plate上 製備轉殖阿拉伯芥所需之載體，在未來會將此載體轉型到農 桿菌中，同時種植阿拉伯芥植株以供農桿菌感染，最後觀察 阿拉伯芥植株的表現型態。 致謝 感謝成功大學生命科學系陳虹樺教授、潘昭君學姊 及全體學長姐的用心教導。 圖 三