ݺߣ

ݺߣShare a Scribd company logo

Козаков Д.С. Основи молекулярних методів

•
•
A
AlinaPokhilko

Лекція навчального курсу "Молекулярна онкологія, патологія та генетика: від фундаментальних знань до патогістологічної діагностики" Організатори: Медична лабораторія CSD спільно з Center for research and education of translational biology and medicine (www.tbm.center ) Денис Сергійович Козаков – молекулярний біолог лабораторії молекулярної патології і генетики CSD

1 of 17
Основи молекулярних методів КОЗАКОВ ДЕНИС
ДНК • A=T; G≡C • Negative charge • Double-stranded • Зберігання інформації • Deoxyribose – flexibility (double helix)
РНК • A=U; G≡C • Negative charge • Single*-stranded • Експресія генів • Ribose – unstable/degrading • Визначається послідовністю ДНК
Білок • Визначається послідовністю РНК • 20 амінокислот • Просторово неоднорідні • Первинна (2-,3-,4-) структура • Безпосередня участь в клітинних просцесах
Універсальні молекулярні методи • Гель-Електрофорез • Спектрометрія (-photo – quantification; mass- – identification of compounds/composition) • Спектроскопія (IR – structural analysis; Fluorometry – Quantification) • Хроматографія (separation by physicochemical properties) • Методи гібридизації (Western-, Southern-, Northern blot, other)
ДНК. Молекулярні методи • ПЛР • ПЛР в реальному часі • Методи гібридизації: • FISH • Hybridisation capture methods • Southern blot • Секвенування: • Sanger sequencing • NGS • Фрагментаційний аналіз (рестрикція/ампліфікація – електрофорез)
РНК. Молекулярні методи • Зворотня транскрипція (комплементарна ДНК) • RT-qPCR • Molecular cloning • Секвенування (Sanger, NGS) • Методи гібридизації: • Northern blot
Білки. Молекулярні методи • Методи гібридизації: • ELISA • Western-blot • Immunoprecipitation/Pull-down assays • CHIP • IHC
Гель-Електрофорез • Розділення за масою, зарядом • Виділення специфічних фрагментів • Аналітичний етап багатьох методів
Спектрофотометрія • Визначення концентрації нуклеїнових кислот/білків в суміші за поглинанням світла • Низькоспецифічний аналіз DNA vs. RNA • Наявність домішок сильно впливає на результат
Масс-спектрометрія • Визначення молекулярного складу простих/складних молекул за розподілом фрагментів • Базований на принципі вимірювання співвідношення маси до заряду
Спектроскопія • Аналіз функціональних груп за відповіддю молекул на промені (infra-red) або наявність сильного мангітного поля (NMR) • Визначення структури/функціонального складу молекул
Хроматографія • Методика адаптована для очистки та виділення біомолекул • Розподіл молекул при проходженні через субстрат на колонці за фізикохімічними властивостями: • Заряд • Маса (розмір) • Специфічність до субстрату (афінність)
ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція • Ампліфікація ДНК • Денатурація • Приєднання праймерів (анілінг) • Елонгація (синтез) • В реакції беруть участь: • Оригінальна суміш ДНК • Праймери (15-25b) • ДНК Полімераза • Середовище (+нуклеотиди)
ПЛР в режимі реального часу (qPCR) • Визначення кількості копій/довжину/кількість ампліконів за флуорисцентними маркерами • Використовуються інтеркалюючі фарбники та флуорисцентні мітки
Зворотня транскрипція • Ферментативне перетворення мРНК на комплементарну ДНК для подальших аплікацій: • Аналіз експресії генів (qPCR) • Аналіз наявності транскриптів певних генів • Аналіз сплайсингу • Секвенування
Дякую за увагу!

More Related Content

Козаков Д.С. Основи молекулярних методів

  • 2. ДНК • A=T; G≡C • Negative charge • Double-stranded • Зберігання інформації • Deoxyribose – flexibility (double helix)
  • 3. РНК • A=U; G≡C • Negative charge • Single*-stranded • Експресія генів • Ribose – unstable/degrading • Визначається послідовністю ДНК
  • 4. Білок • Визначається послідовністю РНК • 20 амінокислот • Просторово неоднорідні • Первинна (2-,3-,4-) структура • Безпосередня участь в клітинних просцесах
  • 5. Універсальні молекулярні методи • Гель-Електрофорез • Спектрометрія (-photo – quantification; mass- – identification of compounds/composition) • Спектроскопія (IR – structural analysis; Fluorometry – Quantification) • Хроматографія (separation by physicochemical properties) • Методи гібридизації (Western-, Southern-, Northern blot, other)
  • 6. ДНК. Молекулярні методи • ПЛР • ПЛР в реальному часі • Методи гібридизації: • FISH • Hybridisation capture methods • Southern blot • Секвенування: • Sanger sequencing • NGS • Фрагментаційний аналіз (рестрикція/ампліфікація – електрофорез)
  • 7. РНК. Молекулярні методи • Зворотня транскрипція (комплементарна ДНК) • RT-qPCR • Molecular cloning • Секвенування (Sanger, NGS) • Методи гібридизації: • Northern blot
  • 8. Білки. Молекулярні методи • Методи гібридизації: • ELISA • Western-blot • Immunoprecipitation/Pull-down assays • CHIP • IHC
  • 9. Гель-Електрофорез • Розділення за масою, зарядом • Виділення специфічних фрагментів • Аналітичний етап багатьох методів
  • 10. Спектрофотометрія • Визначення концентрації нуклеїнових кислот/білків в суміші за поглинанням світла • Низькоспецифічний аналіз DNA vs. RNA • Наявність домішок сильно впливає на результат
  • 11. Масс-спектрометрія • Визначення молекулярного складу простих/складних молекул за розподілом фрагментів • Базований на принципі вимірювання співвідношення маси до заряду
  • 12. Спектроскопія • Аналіз функціональних груп за відповіддю молекул на промені (infra-red) або наявність сильного мангітного поля (NMR) • Визначення структури/функціонального складу молекул
  • 13. Хроматографія • Методика адаптована для очистки та виділення біомолекул • Розподіл молекул при проходженні через субстрат на колонці за фізикохімічними властивостями: • Заряд • Маса (розмір) • Специфічність до субстрату (афінність)
  • 14. ПЛР – полімеразна ланцюгова реакція • Ампліфікація ДНК • Денатурація • Приєднання праймерів (анілінг) • Елонгація (синтез) • В реакції беруть участь: • Оригінальна суміш ДНК • Праймери (15-25b) • ДНК Полімераза • Середовище (+нуклеотиди)
  • 15. ПЛР в режимі реального часу (qPCR) • Визначення кількості копій/довжину/кількість ампліконів за флуорисцентними маркерами • Використовуються інтеркалюючі фарбники та флуорисцентні мітки
  • 16. Зворотня транскрипція • Ферментативне перетворення мРНК на комплементарну ДНК для подальших аплікацій: • Аналіз експресії генів (qPCR) • Аналіз наявності транскриптів певних генів • Аналіз сплайсингу • Секвенування