กล้องจุลทรรศȨ
- 2. วัตถุประสงค์ ทราบชนิดของกล้องจุลทรรศȨ ทราบส่วนประกอบและหน้าที่การทางานของกล้องจุลทรรศȨธรรมดาและ กล้องสเตอริโอ สามารถเปรียบเทียบความแตกต่างระหว่างกล้องจุลทรรศȨธรรมดาและ กล้องสเตอริโอ ทราบวิธีการใช้ การดูแล และเก็บรักษากล้องจุลทรรศȨ สามารถหาขนาดของวัตถุจากกล้องจุลทรรศȨ สามารถเตรียมสไลด์สด และย้อมสีตัวอย่างเพื่อดูด้วยกล้องจุลทรรศȨ
- 3. Microscopes Simple microscope Compound microscope ประกอบด้วยเลนส์เดียว เช่น แว่นขยาย (กาลังขยาย 2-30 เท่า) ใช้ศึกษาลักษณะภายนอก ของสิ่งมีชีวตที่มีขนาดใหญ่ เช่น ใบไม้ แมลง กล้องจุลทรรศȨเชิงประกอบ ประกอบด้วยเลนส์ตั้งแต่ 2 อันขึ้นไป
- 4. Compound microscopes 1. Light microscope (bright-field microscope) ◦ เป็นกล้องจุลทรรศȨธรรมดาหรือใช้แสงส่องผ่านวัตถุที่ต้องการดู ◦ กาลังขยาย 1000-2000 เท่า ◦ ภาพที่ได้จะเป็นภาพเสมือนหัวกลับกับวัตถุ และเป็น 2 มิติ
- 5. Compound microscopes 2. Stereomicroscope (dissecting microscope) ◦ แสงส่องกระทบวัตถุสะท้อนเข้าตา ◦ ใช้ส่องดูสิ่งมีชีวิตขนาดเล็กที่ทึบแสง ไม่เห็นรายละเอียดภายในเซลล์ ◦ กาลังขยาย 80-200 เท่า ◦ ภาพที่ได้จะเป็นภาพเสมือนหัวตั้ง และเป็น 3 มิติ
- 6. Compound microscopes 3. Phase contrast microscope ◦ มีอุปกรณ์พิเศษทาให้วัตถุและพื้นหลังมีความแตกต่างกัน ◦ ใช้ดูเซลล์หรือสิ่งมีชีวิตที่มีลักษณะใสโดยไม่ย้อมสี
- 7. Compound microscopes 4. Polarizing microscope ◦ ใช้ศึกษาผลึกและเส้นใย เซลล์กล้ามเนื้อลาย ◦ โครงสร้างที่เห็นจะสว่างตัดกับพื้นที่มืด
- 8. Compound microscopes 5. Dark field microscope ◦ ใช้ศึกษาสิ่งมีชีวิตขนาดเล็ก ที่อยู่ในของเหลว จะเห็นเป็นจุดสว่างบนพื้น หลังที่มืด (dark field condenser)
- 9. Compound microscopes 6. Fluorescence microscope ◦ ใช้หาสารเรืองแสง ที่เรืองแสงได้เองเช่น วิตามิน A ไรโบเฟลวิน คลอโรฟิลล์ หรือเป็นสารเรื่องแสงจากการย้อมด้วยสีเรืองแสง
- 10. Compound microscopes 7. Ultraviolet microscope ◦ ใช้ตรวจหากรดนิวคลีอิก โดยเฉพาะ พิวรีน (purine) และ ไพริมิดีน (pyrimidine) ของนิวคลีโอไทด์ รวมทั้ง กรดอะมิโนและโปรตีนบางตัว เช่น tyrosine, phenylalanine protein crystal UV image of cell
- 11. Compound microscopes 8. Electron microscope (EM) ◦ Transmission EM (TEM) (กล้องจุลทรรศȨอิเล็กตรอนแบบ ส่องผ่าน) ใช้ศึกษารายละเอียดส่วนประกอบโครงสร้างเซลล์ที่ไม่สามารถเห็นได้ ด้วยกล้องจุลทรรศȨธรรมดา โดยจะเห็นเป็นภาพ 2 มิติ กาลังขยาย 1,000,000 เท่า ◦ Scanning EM (SEM) (กล้องจุลทรรศȨอิเล็กตรอนแบบส่อง กราด) ใช้ศึกษาพื้นผิวของเซลล์ โดยจะเห็นเป็นภาพ 3 มิติ กาลังขยาย 800,000 เท่า
- 12. Electron microscopes TEM v. SEM gills of a fish Myelinated axon
- 14. ส่วนประกอบของกล้องจุลทรรศȨ 1. ส่วนที่เป็นตัวกล้อง 2. ส่วนที่ทาหน้าที่รับแสง 3. ส่วนที่ทาหน้าที่ปรับภาพ 4. ส่วนที่ทาหน้าที่ขยายภาพ
- 15. ส่วนประกอบของกล้องจุลทรรศȨ 1. ส่วนที่เป็นตัวกล้อง 1) Body tube บังคับแสงจากเลนส์ใกล้วัตถุ เข้าสูเลนส์ใกล้ตา 2) Stage แท่นวางวัตถุ วางสไลด์ที่ต้องการ ศึกษา 3) Spring clip ที่หนีบสไลด์ ปัจจุบันมี mechanical stage ซึ่งมี scale ใน แนวตั้งและนอน ช่วยให้หาตาแหน่งของวัตถุที่ ต้องการดูได้ง่าย 4) Arm แขน ใช้จับเวลายกกล้อง 5) Base ฐาน เป็นส่วนที่รองรับน้าหนักกล้อง 1 2 3 4 5
- 16. 2. ส่วนที่ทาหน้าที่รับแสง 1) กระจกเงา ทาหน้าที่สะท้อนแสงผ่านวัตถุ ปัจจุบันเป็นแหล่งกาเนิดแสง เช่นหลอดไฟฟ้ า 2) Condenser เลนส์รวมแสง รวมแสงเข้า สู่วัตถุ 3) Iris diaphragm อยู่ใต้เลนส์รวมแสง ใช้ปรับแสงให้ผ่านเข้าเลนส์รวมแสงได้มาก หรือน้อยตามต้องการ ส่วนประกอบของกล้องจุลทรรศȨ 2 3 1
- 17. 3. ส่วนที่ทาหน้าที่ปรับภาพ 1) Coarse adjustment knob ปุ่ม ปรับภาพหยาบ ใช้หาระยะโฟกัสโดยการปรับ แท่นวางวัตถุขึ้นลง 2) Fine adjustment knob ปุ่มปรับ ภาพละเอียด ใช้ปรับให้ภาพคมชัดยิ่งขึ้น 3) Coaxial stage control ปุ่มเลื่อน ตาแหน่งของสไลด์ โดยภาพที่เห็นจากเลนส์ ใกล้ตาจะสลับกัน เช่น เลื่อนสไลด์ไปทางซ้าย ภาพที่เห็นจะไปทางขวา ส่วนประกอบของกล้องจุลทรรศȨ 1 2 3
- 18. 4. ส่วนที่ทาหน้าที่ขยายภาพ 1) Objective lens เลนส์ใกล้วัตถุ มี 3 -4 อัน โดยจะติดอยู่กับแป้ นสวมเลนส์ใกล้วัตถุ revolving nosepiece เลนส์ใกล้วัตถุกาลังขยายต่า มีกาลังขยาย 4 เท่า เลนส์ใกล้วัตถุกาลังขยายปานกลาง มีกาลังขยาย 10 เท่า เลนส์ใกล้วัตถุกาลังขยายสูง มีกาลังขยาย 40 เท่า เลนส์ใกล้วัตถุหัวน้ามัน มีกาลังขยาย 100 เท่า เวลาให้ ต้องหยดน้ามันลงบนกระจกปิดสไลด์เพื่อให้แสงหักเห ดีขึ้น 2) Ocular or eyepiece เลนส์ใกล้ตา ขยาย ภาพจากเลนส์ใกล้วัตถุ มีกาลังขยาย 10 เท่า ทา ให้เห็นเป็นภาพเสมือนหัวกลับ Eye lens ด้านใกล้ตา Field lens ด้านตรงข้าม ส่วนประกอบของกล้องจุลทรรศȨ 2 1
- 19. ความสามารภในการขยายภาพของกล้องจุลทรรศȨ ขึ้นอยู่กับสิ่งสาคัญ 2 สิ่งคือ resolution & numerical aperture (NA) ◦ Resolution (R) คือ ความสามารถของเลนส์ใกล้วัตถุของ กล้องในการแยกจุดสองจุดที่อยู่ใกล้กันที่สุดให้เห็นแยกออกเป็น สองจุด
- 20. ความสามารภในการขยายภาพของกล้องจุลทรรศȨ ขึ้นอยู่กับสิ่งสาคัญ 2 สิ่งคือ resolution & numerical aperture ◦ Numerical aperture (NA) คือค่าความสามารถของ เลนส์ใกล้วัตถุในการรวมแสงที่หักเหจากวัตถุ R = 0.6 x λ NA λ คือ ความยาวคลื่นแสง (0.55 µm)
- 21. ความสามารภในการขยายภาพของกล้องจุลทรรศȨ เลนส์ใกล้วัตถุกาลังขยายเท่ากัน ◦ ตัวที่มีค่า R ต่ากว่าจะมีประสิทธิภาพดีกว่า ◦ ตัวที่มีค่า NA สูงกว่าจะมีประสิทธิภาพดีกว่า กาลังขยาย NA ความหนาของกระจกปิดสไลด์ ความยาวของ mechanical tube
- 22. Working distance ระยะการทางานของเลนส์ใกล้วัตถุ(ทีทาให้เห็นภาพชัด) หรือ ระยะทางจากลนส์ใกล้วัตถุจȨึงกระจกปิดสไลด์
- 23. การหากาลังขยายของภาพที่ได้จากกล้องจุลทรรศȨ กาลังขยายของภาพ = กาลังขยายของเลนส์ใกล้ตา x กาลังขยายของ เลนส์ใกล้วัตถุ Objective lens Magnification Ocular lens Total magnification Low power 4x 10x 40x Medium power 10x 10x 100x High power 40x 10x 400x ขอบเขตการมองเห็นภาพ field view •กาลังขยายต่า •ภาพขนาดเล็ก •ขอบเขตการมองเห็นกว้าง •กาลังขยายสูง •ภาพขนาดใหญ่ •ขอบเขตการมองเห็นแคบลง
- 24. การหาขนาดจริงของวัตถุจากกล้องจุลทรรศȨ Micrometer ◦ Stage micrometer ◦ Ocular micrometer
- 25. การหาขนาดจริงของวัตถุจากกล้องจุลทรรศȨ Stage micrometer มี 10 ช่องใหญ่ แต่ละช่องห่างกัน 0.1 มิลลิเมตร หรือ 100 ช่องเล็ก แต่ละช่องห่างกัน 0.01 มิลลิเมตร
- 26. การหาขนาดจริงของวัตถุจากกล้องจุลทรรศȨ Ocular micrometer แบ่งออกเป็น 100 ช่อง แต่ละช่องมีระยะห่างเท่าๆกัน แต่จะมีขนาด เท่าใดนั้นขึ้นอยู่กับกาลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุที่ใช้
- 27. การเทียบ scale micrometer ก่อนนาไปใช้ 4X stage ocular 2 ช่อง ocular = 1 ช่อง stage 1 ช่อง ocular = ½ ช่อง stage = 0.01/2 = 0.005 mm =0.005 x 1000 µm =5 µm
- 28. การเทียบ scale micrometer ก่อนนาไปใช้ 4 ช่อง ocular = 1 ช่อง stage 1 ช่อง ocular = 1/4 ช่อง stage = 0.01/4 = 0.0025 mm =0.0025 x 1000 µm =2.5 µm 10X stage ocular
- 29. การเทียบ scale micrometer ก่อนนาไปใช้ เลนส์ใกล้วัตถุกาลังขยาย 10 เท่า โดย 4 ocular = 1 stage สิ่งมีชีวิตที่เห็นจะมีขนาดเท่าใด 4 ช่อง ocular = 1 ช่อง stage 1 ช่อง ocular = 1/4 ช่อง stage = 0.01/4 = 0.0025 mm =2.5 µm 2.5 x ?
- 30. การประมาณขนาดของวัตถุเมื่อไม่มี micrometer ขีดเส้นบนกระดาษยาว 1 เซนติเมตร แล้วแบ่งช่องละ 1 มิลลิเมตร นาไปส่องเทียบหาความยาวเส้นผ่านศูนย์กลางของอาณาเขตที่เห็น ในแต่ละกาลังขยายของเลนส์ใกล้วัตถุ 4x มี 8 ช่อง = 8000 µm 10x มี 4.5 ช่อง = 4500 µm 4x Euglena มีขนาด ประมาณเท่าใด
- 32. การเตรียมสไลด์สาหรับดูด้วยกล้องจุลทรรศȨธรรมดา สไลด์ถาวร (permanent slide) สไลด์สด (wet mount)
- 33. การเตรียมสไลด์สดและการย้อมสี วางตัวอย่างลงบนสไลด์ หยดน้า(หรือสีย้อม)ลงไปบนตัวอย่าง ปิดด้วยกระจกปิดสไลด์ อาจใช้ปลาย เข็มหมุดค่อยๆวางกระจกปิดสไลด์ ซับน้าที่อยู่นอกกระจกปิดสไลด์และใต้ สไลด์แล้วนาไปส่องดูด้วยกล้อง จุลทรรศน์ การย้อมสี หลังจากดู ตัวอย่างที่ยังไม่ได้ ย้อมไปแล้ว
- 37. งานที่ต้องปฏิบัติ ศึกษาส่วนประกอบต่างๆของกล้องจุลทรรศȨ และหน้าที่การทางานของ ส่วนประกอบต่างๆ ฝึกหัดการใช้กล้องจุลทรรศȨธรรมดาโดยใช้สไลด์ถาวร และกล้องสเตอริโอ โดยใช้ตัวอย่างสิ่งมีชีวิต เปรียบเทียบความแตกต่างของภาพที่มองเห็นจากกล้องจุลทรรศȨธรรมดา และกล้องสเตอริโอ เขียนตัวอักษร “ก” หรือ “ง” บนกระดาษแล้วนาไปส่องดูด้วยกล้อง จุลทรรศน์ธรรมดาและกล้องสเตอริโอ วัดเส้นผ่านศูนย์กลางของอาณาเขตที่เห็นในกล้องจุลทรรศȨธรรมดา เมื่อ ใช้เลนส์ใกล้วัตถุกาลังขยายต่า ปานกลาง และสูง ฝึกหัดหาขนาดจริงของวัตถุจากกล้องจุลทรรศȨธรรมดา ฝึกหัดเตรียมสไลด์สดและการย้อมสี เพื่อศึกษาด้วยกล้องจุลทรรศȨ ฝึกหัดวิธีการเก็บกล้องจุลทรรศȨธรรมดา และกล้องสเตอริโอ