ݺߣ

ݺߣShare a Scribd company logo

необратимые клеточные повреждения и их роль в патологии

•Download as PPT, PDF•
•
Oleg Arzt
Oleg Arzt

irreversible cell injury

1 of 36
Download to read offline
Необратимые клеточные повреждения и их роль в патологии Up-to-date integrated approach
Nomenclature Committee on Cell Death 2009-2015 (NCCD) • Следует различать гибель клетки как состояние и процесс. • Основные критерии процесса: o Генерализованная активация каспаз; o Нарушение ΔΨm – митохондриального транмембранного потенциала; o Экспрессия фосфатидилсерина на наружной поверхности клеточного липидного бислоя (сигнал «eat me» для окружения).
Критерии гибели клетки как состояния (NCCD) • 1. Нарушение целостности клеточной мембраны – морфологически проявляется накоплением витальных красителей в цитоплазме in vitro; • 2. Клетка и ее ядро подвергаются на отдельные фрагменты – тельца (напр., апоптотические тельца); • 3. И/или разрушенная клетка (и ее фрагменты) может быть поглощена соседними клетками in vivo.
«Dead» cell vs «dying» cell • Клетки, останавливающиеся в клеточном цикле в фазе G0 (что можно наблюдать в результате процесса, получившего название – senescence, т.е. старение), должны рассматриваться как живые. При это понятие «replicative cell death», применяемое в радиобиологической практике, лишь отражает потерю клоногенного потенциала, но не гибель.
Принципы классификации • NCCD рекомендует классифицировать гибель клеток как процесс по следующим параметрам: • 1. Наиболее консервативные и максимально изученные – морфологические критерии. По ним выделяют: - апоптотическую, некротическую, аутофагическую и гибель клетки, ассоциированную с митозом.
Принципы классификации • 2. Энзимологические критерии: определяют роль и участие различных ферментов в каскадных путях реализации программ клеточной гибели: - нуклеазы; - различные классы протеаз: каспазы, кальпаины, катепсины, трансглутаминазы.
Принципы классификации • 3. Функциональные аспекты: - случайные или программируемые типы; - физиологические (т.е., не сопровождающие возникновение какого-либо заболевания) или патологические. • 4. Вовлечение иммунологических механизмов: иммуногенные и неиммуногенные.
Programmed cell death (PCD) – типовой патологический процесс • Тип 1 – апоптоз – активное программируемое событие, ведущее к клеточному суициду (часто индивидуальному) за счет реализации специальных внутриклеточных сигнальных путей, и направленное на сохранение гомеостаза в целостном организме. • Тип 2 – аутофагия – активный сигнальный путь гибели клетки, ассоциированный с внешним стрессорным воздействием, направленный на элиминацию возможных макромолекулярных негативных факторов для целостного организма, и служащий, в ряде случаев, адаптивным способом выживания клеток. • Тип 3 – некроз – стохастическое пассивное событие, при котором гибель клеток в живом организме обусловлена неблагоприятным воздействием внешних факторов и/или микроокружения, к чему эти клетки не смогли адаптироваться (зачастую, это реализация программы, центральное звено которой представлено Cа2+ -индуцированной перегрузкой цитоплазмы с активацией эндогенных фосфолипаз, нуклеаз (кальпаинов и лизосомальных катепсинов), образованием АФК и разрушением клеточной мембраны с выходом содержимого во внеклеточное пространство). • Тип 4 – анойкиз – гибель клетки, потерявшей связь с внеклеточным матриксом
Другие типы PCD, имеющие самостоятельное или перекрестное значение • Каспаза-независимая запрограммированная клеточная гибель (некроптоз) • Анойкиз • Энтоз • Этоз или NETоз • Эриптоз • Пироптоз • Митотическая катастрофа • Эксайтотоксическая гибель нейронов • Валлеровская дегенерация нейронов • Корнификация (кератинизация) • Вакуолярная дегенерация • Терминальная дифференцировка
Апоптоз - от греч. απόπτωσις — опадание листьев — программируемая клеточная смерть, регулируемый процесс самоликвидации на клеточном уровне, в результате которого клетка фрагментируется на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной.
Тельце Каунсильмена
Основные пути реализации апоптоза 1. Внешний путь – взаимодействие рецепторов мембраны клетки со специфическими лигандами (TNFα, TRAIL, FasL). 2. Внутренний путь (митохондрии – ключевое звено). 3. Перфорин-гранзимовый путь (опосредован CTL, которые встраивают в клетку перфорин для трансфера гранзима В внутрь цитоплазмы и киллинга). 4. р53-активируемый апоптоз (повреждения ДНК). 5. Кальциевая сигнализация при ER-stress induced apoptosis
ФАЗЫ АПОПТОЗА 1. Сигнальная фаза А) рецептор- зависимый сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки; Б) митохондриальный путь. 2. Эффекторная фаза 3. Деградационная фаза
Рецептор-зависимый сигнальный путь Основные рецепторы: - CD95 (также известный как Fas или APO-1), - TNFR1 (также называемый p55 или CD120a), - TRAIL (Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10; TNF-related apoptosis-inducing ligand) Дополнительные: CARI, DR3 (англ. death receptor 3 — «рецептор смерти 3»), DR4 и DR5. начинается со взаимодействия специфических внеклеточных лигандов с рецепторами суперсемейства TNF клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны.
Рецепторы и лиганды в апоптозе 1. Рецепторы - трансмембранные белки, характеризующиеся наличием общей последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене смерти (англ. death domain или кратко DD). Виды доменов: DD, DED, CARD. 2. Внеклеточные участки рецепторов смерти взаимодействуют с тримерами лигандов (CD95L, TNF, Apo3L, Apo2L и т. п.). 3. Активированный таким образом рецептор взаимодействует с соответствующим внутриклеточным адаптером (или адаптерами): - для рецептора CD95 (Fas/APO-1) адаптером является FADD (от англ. Fas- associated DD-protein — «белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора»); - для рецепторов TNFR1 и DR3 адаптером является TRADD (от англ. TNFR1-associated DD-protein — «белок, взаимодействующий с доменом смерти TNFR1-рецептора»).
Взаимодействие адаптеров, эффекторов и доменов смерти при апоптозе • Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с эффекторами — с прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация прокаспаз. Данные агрегаты именуются апоптосомами. Примером апоптосомы может служить комплекс FasL-Fas-FADD- прокаспаза-8, в котором активируется каспаза-8. • DD (от англ. death domain — «домен смерти») участвует во взаимодействии рецептора Fas с адаптером FADD и во взаимодействии рецепторов TNFR1 или DR3 с адаптером TRADD. Посредством домена DED (от англ. death-effector domain — «домен эффектора смерти») осуществляется взаимодействие адаптера FADD с прокаспазами −8 и −10. Домен CARD (от англ. caspase activation and recruitment domain — «домен активации и рекрутирования каспазы») участвует во взаимодействии адаптера RAIDD с прокаспазой-2
Митохондриальный путь активации апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки за счет: - разрыва митохондриальной мембраны, - открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий.
Митохондриальный путь апоптоза А. Взаимодействие специфических лигандов – сигналов выживания клеток с их рецепторами – индуцирует активность антиапоптотических факторв (bcl2), что играет ключевую роль в поддержании структурной целостности митохондрий и воспрепятствованию выхода содержимого в цитоплазму. В. Отсутствие необходимых сигналов выживания – активация проапоптотических факторов – выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму – активация каспаз и гибель клетки.
Митохондриальный путь апоптоза 1. В норме Cyt c, Smac/diablo and apoptosis inducing factor (AIF) расположены на внутренней мембране митохондрий или в межмембранном пространстве. Олигомерный комплекс Bak/Bax с антиапоптотическим фактором Bcl-2- на наружной мембране. 2. В ходе активации (фосфорилирования) BH3-компонентов Bcl-2, происходит их встраивание между Bak/Bax, что совобождает Bak/Bax белки, и приводит к формированию поры – MAC – в наружной митохондриальной мембране. 3. Проапоптотические белки Cyt c, Smac/diablo, AIF и другие покидают клетку через MAC-пору. 4. Оказавшись в цитоплазме, эти белки активируют прокаспазы, запуская каскадный механизм апоптоза.
Особенности митохондриального пути • В цитоплазму высвобождаются: цитохром c; прокаспазы −2, −3 и −9; AIF (от англ. apoptosis inducing factor — «фактор индуцирующий апоптоз»). • Цитохром c в цитоплазме клетки участвует в формировании апоптосомы вместе с белком Apaf-1 (от англ. apoptosis protease activating factor-1 — «фактор активации протеаз апоптоза»). Предварительно, Apaf-1 претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии АТФ. Так открывается доступ CARD- домена Apaf-1 для прокаспазы-9. • Происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка Apaf-1 с участием цитохрома c и прокаспазы-9. Так образуется апоптосома, активирующая каспазу-9. Зрелая каспаза-9 связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз.
Другие пути активации апоптоза • Активация прокаспазы-12, локализованной в эндоплазматическом ретикулуме (ER-stress-induced apoptosis). • Атака инфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые, помимо активации Fas-рецептора, способны секретировать перфорин вблизи мембраны заражённой клетки. Перфорин, полимеризуясь, образует трансмембранные каналы, через которые внутрь клетки поступают лимфотоксин-альфа и смесь сериновых протеаз (гранзимов). Далее гранзим B активирует каспазу-3 и запускается каспазный каскад. • Высвобождение лизосомальных протеаз — катепсинов. К примеру, каспаза-8 вызывает выход из лизосом активного катепсина B, который затем расщепляет регуляторный белок Bid. В результате образуется активный белок t-Bid, активирующий в свою очередь проапоптозный белок Bax.
CTL-индуцированный апоптоз 1. Гранзимы и перфорин синтезируются преимущественно CTLs и натуральными киллерами (NK). После связывания ЦТЛ с клеткой- мишенью, перфорин встраивается в ее мембрану с образованием межклеточного канала, через который переносится гранзим в клетку-мишень. 2. Гранзимы осуществляют протеолиз Bid с образованием его активной формы, tBid, которая транслоцируется в митохондрию и активирует внутренний сингнальный каскад апоптоза. Также происходит активация прокаспазы 3. 3. Гранзимы также разрушают комплекс CAD и его ингибитора, ICAD. Это стимулирует выход ДНКазы (CAD) и обусловливает каспаза-независимый путь апоптоза. CAD–ICAD комплекс разрушается посредством caspase-3. !CAD = caspase-activated DNase; CTL = cytotoxic T lymphocyte; ICAD = inhibitor of CAD, BID – BH3-interacting death activator
Эффекторная фаза апоптоза • Каспазы представляют собой цистеиновые протеазы, которые расщепляют аминокислотные последовательности после остатка аспарагиновой кислоты (аспартата). • Каспазы образуются за счёт активации прокаспаз (молекулярная масса 32—56 кДа), в составе которых выделяют 3 домена: регуляторный N- концевой домен (продомен), большую (17—21 кДа) и малую (10—13 кДа) субъединицы. • Активация происходит путём протеолитического процессинга: все три домена расщепляются, отделяется продомен, а оставшиеся большая и малая субъединицы ассоциируются, образуя гетеродимер. Два гетеродимера в дальнейшем формируют тетрамер — полноценную каспазу с двумя каталитическими участками.
Значение апоптоза в биологических системах 1. Элиминация клеточных клонов в ходе эмбрионального развития, морфо- и органогенеза. 2. Гибель клеток, выполнивших свою функцию при иммунном ответе. 3. Дегенерация нейронов (напр., дефект Zn2+2+/Сu2+- зависимой СОД при БАС). 4. Ликвидация аутореактивных клонов Т-лимфоцитов. 5. Гормонозависимые инволютивные процессы (фаза десквамации в менструальном цикле). 6. Трансфекции (вирусные). 7. Опухолевый рост.
Принципы морфологической диагностики апоптоза 1) рутинное свето- микроскопическое исследование с использованием обычных методов фиксации и окрашивания или способов, селективно выявляющих пикнотизированный хроматин; 2) флюоресцентно- микроскопическое исследование с использованием флюорохромов, включая и проточную цитофотометрию; 3) электронно-микроскопические методы; 4) выявление олигонуклеосомной деградации ДНК in situ; 5) иммуногистохимическое выявление белков-маркеров, участвующих в запуске АСК.
Критерии структурных изменений при апоптозе • Наиболее надежным критерием наличия апоптоза является обнаружение каспаза- зависимой олигонуклеосомной деградации хроматина при сохранении целостности мембранных структур клеток • Абсолютно специфических признаков апоптоза нет, для повышения достоверности получаемых данных прибегают к использованию нескольких методических приемов, основанных на различных подходах 1. Световая микроскопия: маргинация хроматина, неровность контуров ядра, пикноз (конденсация) хроматина, изменение окрашивания цитоплазмы (базофилия на ранних стадиях, эозинофилия – апоптозные тельца); вакуолизация цитоплазмы (дилатация ГЭР); изменение контуров и фрагментация клеток с распадом. 2. Флюоресцентная микроскопия: неспецифическое окрашивание конденсированного хроматина с использованием флюорохромов к ДНК, аннексина V. 3. Электронная микроскопия: утрата микроворсинок и десмосом; блеббинг; отсутствие набухания митохондрий; концентрация рибосом в кристаллы; субмембранные скопления параллельно ориентированных филаментов; ядерные осмиофильные комплексы из факторов транскрипции; дилация ЭР; поры ядерной мембраны. 4. TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling). 5. ИГХ: каспаза 3, p53, bcl2, bax.
Аутофагия • это процесс, при котором внутренние компоненты клетки доставляются внутрь её лизосом и подвергаются в них деградации • Основными стимулами к усилению процессов аутофагии в клетках могут служить: нехватка питательных веществ; наличие в цитоплазме повреждённых органелл; наличие в цитоплазме частично денатурировавших белков и их агрегатов. • Три типа аутофагии: - микроаутофагия (макромолекулы и обломки клеточных мембран просто захватываются лизосомой), - макроаутофагия (участок цитоплазмы (часто содержащий какие-либо органоиды) окружается мембранным компартментом, похожим на цистерну эндоплазматической сети. В результате этот участок отделяется от остальной цитоплазмы двумя мембранами. Такие двухмембранные органеллы, окружающие удаляемые органеллы и цитоплазму, называются аутофагосомы. Аутофагосомы соединяются с лизосомами, образуя аутофаголизосомы, в которых органеллы и остальное содержимое аутофагосом перевариваются), - шаперон-индуцированная (направленный транспорт частично денатурировавших белков из цитоплазмы сквозь мембрану лизосомы в ее полость, где они перевариваются)
Аутофагия – способ выживания клетки • Цитокины, активирующие фагоцитоз (TNFb), также способны вызывать аутофагию • Морфологически ви-зуализируется с помощью электронной микроскопии (образование многочисленных везикул и вакуолей, содержащих лизируемые компоненты клетки). Ядро при этом процессе не содержит конденсированного хроматина и разрывов в ДНК, определяемых TUNEL-методом • Может выступать не только как вариант реализации танатогенного сигнала, но и, наоборот, как программа выживания клетки. Показано, что если вслед за активацией апоптоза в клетке будет запущен процесс аутофагии, то происходит отмена программируемой гибели
Аутофагия: общие механизмы В присутствии питательных веществ и факторов роста MTOR активируется, что приводит к торможению аутофагии. Депривация факторов роста и других сигналов или воздействие рапамицина, приводит к ингибированию MTOR и активации комплекса, который индуцирует образование аутофагосом. Образующаяся везикула (аутофагосома) является местом сборки PI3KC3 комплекса. Образование PI3P приводит к модификации microtubule- associated protein light chain 3 (LC3- II). Bcl-2, способен ингибировать аутофагию через прямое связывание Beclin-1.
Анойкиз, или гибель в отсутствии сигналов микроокружения форма запрограммированной гибели клеток, индуцированная отсоединением мембраносвязанных клеток от окружающего внеклеточного матрикса (ECM) Механизм: аналогия с апоптозом; белок TrkB – рецептор; лиганд - нейротрофический фактор головного мозга (BDNF). TrkB может сделать опухолевые клетки устойчивыми к anoikis путем активации фосфатидилинозитол-3- киназного (PI3K) сигнального каскада. В плоскоклеточном раке устойчивость к анойкизу может быть вызвана активацией фактором роста гепатоцитов (HGF) внеклеточных рецепторов сигнальных киназ (ERK) и PI3K. Реализация: эндотелий в условиях формирования атеросклеротических бляшек; метастазирование опухолевых клеток
Энтоз, или «клеточный каннибализм» проявляется проникновением одной живой клетки в цитоплазму другой Механизм: энтотические структуры, также называемые «клетки-в-клетках», образуются за счет потери межклеточных соединений, и сводится к Rho-зависимому процессу, включающему полимеризацию актина и миозина II в проникающей клетке. Межклеточные соединения связывают клетки вместе за счет белка кадгерина трансмембранных белковых комплексов, входящих в цитоскелет соседствующих клеток Особенности: Entos отличается от апоптоза тем, что энтотическая гибель отдельных клеток является следствием внутриклеточного проникновения с сохранением жизнеспособности вторгшейся клетки и возможностью дальнейшей миграции, а не фагоцитоза. Реализация: шигеллезы; анеуплоидная трансформация опухолевых клеток.
Митотическая катастрофа • форма запрограммированной гибели клеток, является событием, при котором клетка разрушается во время митоза. • Механизм: происходит в результате аберрантных сегрегаций хромосом в начале митоза, или в результате повреждения ДНК позже. Термин «митотическая катастрофа» используется для объяснения механизма гибели клеток в фазе митотического деления, т.е. последовательность событий, которые ведут к преждевременному или неуместному вступлению клеток в митоз, что может быть вызвано химическими или физическими факторами. Это может быть вызвано с агентами, влияющими на стабильность микротрубочек, различными противоопухолевыми препаратами, а также нарушениями митоза, вызванными дефектами контрольно-пропускных пунктов клеточного цикла. • Реализация: основная форма клеточной гибели, индуцированной ионизирующим излучением.
Эриптоз – специализированный путь элиминации стареющих эритроцитов • форма запрограммированной гибели клеток, специфически реализующаяся в эритроцитах • Механизм: вызван повышенным цитозольным содержанием Ca2 + и/или повышением активности церамидов и характеризуется уплощением клетки и фосфатидилсериновой инверсией на поверхности клеточной мембраны (в норме фосфатидилсерин, фосфатидилхолин ассоциированы с внутренней частью липидного бислоя мембран клеток, а фосфатидилэтаноламин – с наружной). Оксид азота NO участвует в регуляции эриптоза, эффект частично имитирует роль цГМФ, параллельно с изменениями нитрозилирования белков и деятельности тиоредоксина (Тиоредоксин и глутаредоксин, наряду с глутатионзависимым превращением рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды способны восстанавливать дисульфидные связи в белках, способствуя формированию у них правильной третичной структуры). • Реализация: эритроциты.
Этозис (NETоз) и «хроматиновые ловушки» 1. Нейтрофилы распознают патогены (PAMP), после чего - 2. Активируется NADP-оксидаза, последняя способствует образованию АФК. 3. В результате разрушаются мембраны внутриклеточных гранул и происходит дисперсия внутриклеточного хроматина. 4. Нетотическая активность приводит к выходу хроматиновых ловушек из цитоплазмы, которые содержат антимикробные клеточные продукты. 5. Эти ловушки захватывают и уничтожают патогены.
Пироптоз: участие факторов врожденного иммунитета является одной из форм запрограммированной клеточной смерти, связанной с антимикробным ответом во время воспаления. Особенности: в отличие от апоптоза, pyroptosis требует участия каспазы-1, и впервые был отмечен при изучении сальмонелла- инфицированных макрофагов. В отличие от апоптоза, инициируется PAMPs и цитокинами, которые активируют синтез и секрецию провоспалительных медиаторов иммуннокомпетентными клетками. Механизм: инициирование pyroptosis было связано со связыванием белковых компонентов жгутиков (флагеллина) сальмонелл и шигелл (и аналогичных PAMPs в других патогенных микроорганизмах) с NOD-подобными рецепторами (NLRS). Эти рецепторы - TLR, но реагируют на интрацитоплазматические антигены, а не внеклеточные антигены. Каспаза-1 активируется во время pyroptosis большим супрамолекулярным комплексом, который называется pyroptosome (также известный как инфламмосома). Только одна большая pyroptosoma формируется в каждом макрофаге в течение нескольких минут после инфицирования. Реализация: микробоассоциированный иммунный ответ в макрофагальных и дендритных клетках
Сравнительная характеристика некоторых типов клеточной гибели Морфология Апоптоз Пироптоз Некроз 1. Лизис клетки - + + 2. Набухание клетки - + + 3. Образование пор - + + 4.Блеббинг клеточной мембраны + - - 5. ДНК-фрагментация + + + Механизмы 1. Каспаза 1 - + - 2. Каспаза 3 + - - 3. Цитохром с - высвобождение + - - Исходы 1. Воспаление - + + 2. Программированная гибель клетки + + +/-

More Related Content

необратимые клеточные повреждения и их роль в патологии

  • 1. Необратимые клеточные повреждения и их роль в патологии Up-to-date integrated approach
  • 2. Nomenclature Committee on Cell Death 2009-2015 (NCCD) • Следует различать гибель клетки как состояние и процесс. • Основные критерии процесса: o Генерализованная активация каспаз; o Нарушение ΔΨm – митохондриального транмембранного потенциала; o Экспрессия фосфатидилсерина на наружной поверхности клеточного липидного бислоя (сигнал «eat me» для окружения).
  • 3. Критерии гибели клетки как состояния (NCCD) • 1. Нарушение целостности клеточной мембраны – морфологически проявляется накоплением витальных красителей в цитоплазме in vitro; • 2. Клетка и ее ядро подвергаются на отдельные фрагменты – тельца (напр., апоптотические тельца); • 3. И/или разрушенная клетка (и ее фрагменты) может быть поглощена соседними клетками in vivo.
  • 4. «Dead» cell vs «dying» cell • Клетки, останавливающиеся в клеточном цикле в фазе G0 (что можно наблюдать в результате процесса, получившего название – senescence, т.е. старение), должны рассматриваться как живые. При это понятие «replicative cell death», применяемое в радиобиологической практике, лишь отражает потерю клоногенного потенциала, но не гибель.
  • 5. Принципы классификации • NCCD рекомендует классифицировать гибель клеток как процесс по следующим параметрам: • 1. Наиболее консервативные и максимально изученные – морфологические критерии. По ним выделяют: - апоптотическую, некротическую, аутофагическую и гибель клетки, ассоциированную с митозом.
  • 6. Принципы классификации • 2. Энзимологические критерии: определяют роль и участие различных ферментов в каскадных путях реализации программ клеточной гибели: - нуклеазы; - различные классы протеаз: каспазы, кальпаины, катепсины, трансглутаминазы.
  • 7. Принципы классификации • 3. Функциональные аспекты: - случайные или программируемые типы; - физиологические (т.е., не сопровождающие возникновение какого-либо заболевания) или патологические. • 4. Вовлечение иммунологических механизмов: иммуногенные и неиммуногенные.
  • 8. Programmed cell death (PCD) – типовой патологический процесс • Тип 1 – апоптоз – активное программируемое событие, ведущее к клеточному суициду (часто индивидуальному) за счет реализации специальных внутриклеточных сигнальных путей, и направленное на сохранение гомеостаза в целостном организме. • Тип 2 – аутофагия – активный сигнальный путь гибели клетки, ассоциированный с внешним стрессорным воздействием, направленный на элиминацию возможных макромолекулярных негативных факторов для целостного организма, и служащий, в ряде случаев, адаптивным способом выживания клеток. • Тип 3 – некроз – стохастическое пассивное событие, при котором гибель клеток в живом организме обусловлена неблагоприятным воздействием внешних факторов и/или микроокружения, к чему эти клетки не смогли адаптироваться (зачастую, это реализация программы, центральное звено которой представлено Cа2+ -индуцированной перегрузкой цитоплазмы с активацией эндогенных фосфолипаз, нуклеаз (кальпаинов и лизосомальных катепсинов), образованием АФК и разрушением клеточной мембраны с выходом содержимого во внеклеточное пространство). • Тип 4 – анойкиз – гибель клетки, потерявшей связь с внеклеточным матриксом
  • 9. Другие типы PCD, имеющие самостоятельное или перекрестное значение • Каспаза-независимая запрограммированная клеточная гибель (некроптоз) • Анойкиз • Энтоз • Этоз или NETоз • Эриптоз • Пироптоз • Митотическая катастрофа • Эксайтотоксическая гибель нейронов • Валлеровская дегенерация нейронов • Корнификация (кератинизация) • Вакуолярная дегенерация • Терминальная дифференцировка
  • 10. Апоптоз - от греч. απόπτωσις — опадание листьев — программируемая клеточная смерть, регулируемый процесс самоликвидации на клеточном уровне, в результате которого клетка фрагментируется на отдельные апоптотические тельца, ограниченные плазматической мембраной.
  • 12. Основные пути реализации апоптоза 1. Внешний путь – взаимодействие рецепторов мембраны клетки со специфическими лигандами (TNFα, TRAIL, FasL). 2. Внутренний путь (митохондрии – ключевое звено). 3. Перфорин-гранзимовый путь (опосредован CTL, которые встраивают в клетку перфорин для трансфера гранзима В внутрь цитоплазмы и киллинга). 4. р53-активируемый апоптоз (повреждения ДНК). 5. Кальциевая сигнализация при ER-stress induced apoptosis
  • 13. ФАЗЫ АПОПТОЗА 1. Сигнальная фаза А) рецептор- зависимый сигнальный путь с участием рецепторов гибели клетки; Б) митохондриальный путь. 2. Эффекторная фаза 3. Деградационная фаза
  • 14. Рецептор-зависимый сигнальный путь Основные рецепторы: - CD95 (также известный как Fas или APO-1), - TNFR1 (также называемый p55 или CD120a), - TRAIL (Tumor necrosis factor ligand superfamily member 10; TNF-related apoptosis-inducing ligand) Дополнительные: CARI, DR3 (англ. death receptor 3 — «рецептор смерти 3»), DR4 и DR5. начинается со взаимодействия специфических внеклеточных лигандов с рецепторами суперсемейства TNF клеточной гибели, экспрессированными на поверхности клеточной мембраны.
  • 15. Рецепторы и лиганды в апоптозе 1. Рецепторы - трансмембранные белки, характеризующиеся наличием общей последовательности из 80 аминокислот в цитоплазматическом домене смерти (англ. death domain или кратко DD). Виды доменов: DD, DED, CARD. 2. Внеклеточные участки рецепторов смерти взаимодействуют с тримерами лигандов (CD95L, TNF, Apo3L, Apo2L и т. п.). 3. Активированный таким образом рецептор взаимодействует с соответствующим внутриклеточным адаптером (или адаптерами): - для рецептора CD95 (Fas/APO-1) адаптером является FADD (от англ. Fas- associated DD-protein — «белок, взаимодействующий с доменом смерти Fas-рецептора»); - для рецепторов TNFR1 и DR3 адаптером является TRADD (от англ. TNFR1-associated DD-protein — «белок, взаимодействующий с доменом смерти TNFR1-рецептора»).
  • 16. Взаимодействие адаптеров, эффекторов и доменов смерти при апоптозе • Адаптер, ассоциированный с рецептором смерти, вступает во взаимодействие с эффекторами — с прокаспазами. В результате цепочки взаимодействия «лиганд-рецептор-адаптер-эффектор» формируются агрегаты, в которых происходит активация прокаспаз. Данные агрегаты именуются апоптосомами. Примером апоптосомы может служить комплекс FasL-Fas-FADD- прокаспаза-8, в котором активируется каспаза-8. • DD (от англ. death domain — «домен смерти») участвует во взаимодействии рецептора Fas с адаптером FADD и во взаимодействии рецепторов TNFR1 или DR3 с адаптером TRADD. Посредством домена DED (от англ. death-effector domain — «домен эффектора смерти») осуществляется взаимодействие адаптера FADD с прокаспазами −8 и −10. Домен CARD (от англ. caspase activation and recruitment domain — «домен активации и рекрутирования каспазы») участвует во взаимодействии адаптера RAIDD с прокаспазой-2
  • 17. Митохондриальный путь активации апоптоза реализуется в результате выхода апоптогенных белков из межмембранного пространства митохондрий в цитоплазму клетки за счет: - разрыва митохондриальной мембраны, - открытия высокопроницаемых каналов на внешней мембране митохондрий.
  • 18. Митохондриальный путь апоптоза А. Взаимодействие специфических лигандов – сигналов выживания клеток с их рецепторами – индуцирует активность антиапоптотических факторв (bcl2), что играет ключевую роль в поддержании структурной целостности митохондрий и воспрепятствованию выхода содержимого в цитоплазму. В. Отсутствие необходимых сигналов выживания – активация проапоптотических факторов – выход цитохрома с из митохондрий в цитоплазму – активация каспаз и гибель клетки.
  • 19. Митохондриальный путь апоптоза 1. В норме Cyt c, Smac/diablo and apoptosis inducing factor (AIF) расположены на внутренней мембране митохондрий или в межмембранном пространстве. Олигомерный комплекс Bak/Bax с антиапоптотическим фактором Bcl-2- на наружной мембране. 2. В ходе активации (фосфорилирования) BH3-компонентов Bcl-2, происходит их встраивание между Bak/Bax, что совобождает Bak/Bax белки, и приводит к формированию поры – MAC – в наружной митохондриальной мембране. 3. Проапоптотические белки Cyt c, Smac/diablo, AIF и другие покидают клетку через MAC-пору. 4. Оказавшись в цитоплазме, эти белки активируют прокаспазы, запуская каскадный механизм апоптоза.
  • 20. Особенности митохондриального пути • В цитоплазму высвобождаются: цитохром c; прокаспазы −2, −3 и −9; AIF (от англ. apoptosis inducing factor — «фактор индуцирующий апоптоз»). • Цитохром c в цитоплазме клетки участвует в формировании апоптосомы вместе с белком Apaf-1 (от англ. apoptosis protease activating factor-1 — «фактор активации протеаз апоптоза»). Предварительно, Apaf-1 претерпевает конформационные изменения в результате реакции, протекающей с затратой энергии АТФ. Так открывается доступ CARD- домена Apaf-1 для прокаспазы-9. • Происходит олигомеризация 7 субъединиц трансформированного белка Apaf-1 с участием цитохрома c и прокаспазы-9. Так образуется апоптосома, активирующая каспазу-9. Зрелая каспаза-9 связывает и активирует прокаспазу-3 с образованием эффекторной каспазы-3. Высвобождающийся из межмембранного пространства митохондрий флавопротеин AIF является эффектором апоптоза, действующим независимо от каспаз.
  • 21. Другие пути активации апоптоза • Активация прокаспазы-12, локализованной в эндоплазматическом ретикулуме (ER-stress-induced apoptosis). • Атака инфицированных клеток цитотоксическими Т-лимфоцитами, которые, помимо активации Fas-рецептора, способны секретировать перфорин вблизи мембраны заражённой клетки. Перфорин, полимеризуясь, образует трансмембранные каналы, через которые внутрь клетки поступают лимфотоксин-альфа и смесь сериновых протеаз (гранзимов). Далее гранзим B активирует каспазу-3 и запускается каспазный каскад. • Высвобождение лизосомальных протеаз — катепсинов. К примеру, каспаза-8 вызывает выход из лизосом активного катепсина B, который затем расщепляет регуляторный белок Bid. В результате образуется активный белок t-Bid, активирующий в свою очередь проапоптозный белок Bax.
  • 22. CTL-индуцированный апоптоз 1. Гранзимы и перфорин синтезируются преимущественно CTLs и натуральными киллерами (NK). После связывания ЦТЛ с клеткой- мишенью, перфорин встраивается в ее мембрану с образованием межклеточного канала, через который переносится гранзим в клетку-мишень. 2. Гранзимы осуществляют протеолиз Bid с образованием его активной формы, tBid, которая транслоцируется в митохондрию и активирует внутренний сингнальный каскад апоптоза. Также происходит активация прокаспазы 3. 3. Гранзимы также разрушают комплекс CAD и его ингибитора, ICAD. Это стимулирует выход ДНКазы (CAD) и обусловливает каспаза-независимый путь апоптоза. CAD–ICAD комплекс разрушается посредством caspase-3. !CAD = caspase-activated DNase; CTL = cytotoxic T lymphocyte; ICAD = inhibitor of CAD, BID – BH3-interacting death activator
  • 23. Эффекторная фаза апоптоза • Каспазы представляют собой цистеиновые протеазы, которые расщепляют аминокислотные последовательности после остатка аспарагиновой кислоты (аспартата). • Каспазы образуются за счёт активации прокаспаз (молекулярная масса 32—56 кДа), в составе которых выделяют 3 домена: регуляторный N- концевой домен (продомен), большую (17—21 кДа) и малую (10—13 кДа) субъединицы. • Активация происходит путём протеолитического процессинга: все три домена расщепляются, отделяется продомен, а оставшиеся большая и малая субъединицы ассоциируются, образуя гетеродимер. Два гетеродимера в дальнейшем формируют тетрамер — полноценную каспазу с двумя каталитическими участками.
  • 24. Значение апоптоза в биологических системах 1. Элиминация клеточных клонов в ходе эмбрионального развития, морфо- и органогенеза. 2. Гибель клеток, выполнивших свою функцию при иммунном ответе. 3. Дегенерация нейронов (напр., дефект Zn2+2+/Сu2+- зависимой СОД при БАС). 4. Ликвидация аутореактивных клонов Т-лимфоцитов. 5. Гормонозависимые инволютивные процессы (фаза десквамации в менструальном цикле). 6. Трансфекции (вирусные). 7. Опухолевый рост.
  • 25. Принципы морфологической диагностики апоптоза 1) рутинное свето- микроскопическое исследование с использованием обычных методов фиксации и окрашивания или способов, селективно выявляющих пикнотизированный хроматин; 2) флюоресцентно- микроскопическое исследование с использованием флюорохромов, включая и проточную цитофотометрию; 3) электронно-микроскопические методы; 4) выявление олигонуклеосомной деградации ДНК in situ; 5) иммуногистохимическое выявление белков-маркеров, участвующих в запуске АСК.
  • 26. Критерии структурных изменений при апоптозе • Наиболее надежным критерием наличия апоптоза является обнаружение каспаза- зависимой олигонуклеосомной деградации хроматина при сохранении целостности мембранных структур клеток • Абсолютно специфических признаков апоптоза нет, для повышения достоверности получаемых данных прибегают к использованию нескольких методических приемов, основанных на различных подходах 1. Световая микроскопия: маргинация хроматина, неровность контуров ядра, пикноз (конденсация) хроматина, изменение окрашивания цитоплазмы (базофилия на ранних стадиях, эозинофилия – апоптозные тельца); вакуолизация цитоплазмы (дилатация ГЭР); изменение контуров и фрагментация клеток с распадом. 2. Флюоресцентная микроскопия: неспецифическое окрашивание конденсированного хроматина с использованием флюорохромов к ДНК, аннексина V. 3. Электронная микроскопия: утрата микроворсинок и десмосом; блеббинг; отсутствие набухания митохондрий; концентрация рибосом в кристаллы; субмембранные скопления параллельно ориентированных филаментов; ядерные осмиофильные комплексы из факторов транскрипции; дилация ЭР; поры ядерной мембраны. 4. TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling). 5. ИГХ: каспаза 3, p53, bcl2, bax.
  • 27. Аутофагия • это процесс, при котором внутренние компоненты клетки доставляются внутрь её лизосом и подвергаются в них деградации • Основными стимулами к усилению процессов аутофагии в клетках могут служить: нехватка питательных веществ; наличие в цитоплазме повреждённых органелл; наличие в цитоплазме частично денатурировавших белков и их агрегатов. • Три типа аутофагии: - микроаутофагия (макромолекулы и обломки клеточных мембран просто захватываются лизосомой), - макроаутофагия (участок цитоплазмы (часто содержащий какие-либо органоиды) окружается мембранным компартментом, похожим на цистерну эндоплазматической сети. В результате этот участок отделяется от остальной цитоплазмы двумя мембранами. Такие двухмембранные органеллы, окружающие удаляемые органеллы и цитоплазму, называются аутофагосомы. Аутофагосомы соединяются с лизосомами, образуя аутофаголизосомы, в которых органеллы и остальное содержимое аутофагосом перевариваются), - шаперон-индуцированная (направленный транспорт частично денатурировавших белков из цитоплазмы сквозь мембрану лизосомы в ее полость, где они перевариваются)
  • 28. Аутофагия – способ выживания клетки • Цитокины, активирующие фагоцитоз (TNFb), также способны вызывать аутофагию • Морфологически ви-зуализируется с помощью электронной микроскопии (образование многочисленных везикул и вакуолей, содержащих лизируемые компоненты клетки). Ядро при этом процессе не содержит конденсированного хроматина и разрывов в ДНК, определяемых TUNEL-методом • Может выступать не только как вариант реализации танатогенного сигнала, но и, наоборот, как программа выживания клетки. Показано, что если вслед за активацией апоптоза в клетке будет запущен процесс аутофагии, то происходит отмена программируемой гибели
  • 29. Аутофагия: общие механизмы В присутствии питательных веществ и факторов роста MTOR активируется, что приводит к торможению аутофагии. Депривация факторов роста и других сигналов или воздействие рапамицина, приводит к ингибированию MTOR и активации комплекса, который индуцирует образование аутофагосом. Образующаяся везикула (аутофагосома) является местом сборки PI3KC3 комплекса. Образование PI3P приводит к модификации microtubule- associated protein light chain 3 (LC3- II). Bcl-2, способен ингибировать аутофагию через прямое связывание Beclin-1.
  • 30. Анойкиз, или гибель в отсутствии сигналов микроокружения форма запрограммированной гибели клеток, индуцированная отсоединением мембраносвязанных клеток от окружающего внеклеточного матрикса (ECM) Механизм: аналогия с апоптозом; белок TrkB – рецептор; лиганд - нейротрофический фактор головного мозга (BDNF). TrkB может сделать опухолевые клетки устойчивыми к anoikis путем активации фосфатидилинозитол-3- киназного (PI3K) сигнального каскада. В плоскоклеточном раке устойчивость к анойкизу может быть вызвана активацией фактором роста гепатоцитов (HGF) внеклеточных рецепторов сигнальных киназ (ERK) и PI3K. Реализация: эндотелий в условиях формирования атеросклеротических бляшек; метастазирование опухолевых клеток
  • 31. Энтоз, или «клеточный каннибализм» проявляется проникновением одной живой клетки в цитоплазму другой Механизм: энтотические структуры, также называемые «клетки-в-клетках», образуются за счет потери межклеточных соединений, и сводится к Rho-зависимому процессу, включающему полимеризацию актина и миозина II в проникающей клетке. Межклеточные соединения связывают клетки вместе за счет белка кадгерина трансмембранных белковых комплексов, входящих в цитоскелет соседствующих клеток Особенности: Entos отличается от апоптоза тем, что энтотическая гибель отдельных клеток является следствием внутриклеточного проникновения с сохранением жизнеспособности вторгшейся клетки и возможностью дальнейшей миграции, а не фагоцитоза. Реализация: шигеллезы; анеуплоидная трансформация опухолевых клеток.
  • 32. Митотическая катастрофа • форма запрограммированной гибели клеток, является событием, при котором клетка разрушается во время митоза. • Механизм: происходит в результате аберрантных сегрегаций хромосом в начале митоза, или в результате повреждения ДНК позже. Термин «митотическая катастрофа» используется для объяснения механизма гибели клеток в фазе митотического деления, т.е. последовательность событий, которые ведут к преждевременному или неуместному вступлению клеток в митоз, что может быть вызвано химическими или физическими факторами. Это может быть вызвано с агентами, влияющими на стабильность микротрубочек, различными противоопухолевыми препаратами, а также нарушениями митоза, вызванными дефектами контрольно-пропускных пунктов клеточного цикла. • Реализация: основная форма клеточной гибели, индуцированной ионизирующим излучением.
  • 33. Эриптоз – специализированный путь элиминации стареющих эритроцитов • форма запрограммированной гибели клеток, специфически реализующаяся в эритроцитах • Механизм: вызван повышенным цитозольным содержанием Ca2 + и/или повышением активности церамидов и характеризуется уплощением клетки и фосфатидилсериновой инверсией на поверхности клеточной мембраны (в норме фосфатидилсерин, фосфатидилхолин ассоциированы с внутренней частью липидного бислоя мембран клеток, а фосфатидилэтаноламин – с наружной). Оксид азота NO участвует в регуляции эриптоза, эффект частично имитирует роль цГМФ, параллельно с изменениями нитрозилирования белков и деятельности тиоредоксина (Тиоредоксин и глутаредоксин, наряду с глутатионзависимым превращением рибонуклеотидов в дезоксирибонуклеотиды способны восстанавливать дисульфидные связи в белках, способствуя формированию у них правильной третичной структуры). • Реализация: эритроциты.
  • 34. Этозис (NETоз) и «хроматиновые ловушки» 1. Нейтрофилы распознают патогены (PAMP), после чего - 2. Активируется NADP-оксидаза, последняя способствует образованию АФК. 3. В результате разрушаются мембраны внутриклеточных гранул и происходит дисперсия внутриклеточного хроматина. 4. Нетотическая активность приводит к выходу хроматиновых ловушек из цитоплазмы, которые содержат антимикробные клеточные продукты. 5. Эти ловушки захватывают и уничтожают патогены.
  • 35. Пироптоз: участие факторов врожденного иммунитета является одной из форм запрограммированной клеточной смерти, связанной с антимикробным ответом во время воспаления. Особенности: в отличие от апоптоза, pyroptosis требует участия каспазы-1, и впервые был отмечен при изучении сальмонелла- инфицированных макрофагов. В отличие от апоптоза, инициируется PAMPs и цитокинами, которые активируют синтез и секрецию провоспалительных медиаторов иммуннокомпетентными клетками. Механизм: инициирование pyroptosis было связано со связыванием белковых компонентов жгутиков (флагеллина) сальмонелл и шигелл (и аналогичных PAMPs в других патогенных микроорганизмах) с NOD-подобными рецепторами (NLRS). Эти рецепторы - TLR, но реагируют на интрацитоплазматические антигены, а не внеклеточные антигены. Каспаза-1 активируется во время pyroptosis большим супрамолекулярным комплексом, который называется pyroptosome (также известный как инфламмосома). Только одна большая pyroptosoma формируется в каждом макрофаге в течение нескольких минут после инфицирования. Реализация: микробоассоциированный иммунный ответ в макрофагальных и дендритных клетках
  • 36. Сравнительная характеристика некоторых типов клеточной гибели Морфология Апоптоз Пироптоз Некроз 1. Лизис клетки - + + 2. Набухание клетки - + + 3. Образование пор - + + 4.Блеббинг клеточной мембраны + - - 5. ДНК-фрагментация + + + Механизмы 1. Каспаза 1 - + - 2. Каспаза 3 + - - 3. Цитохром с - высвобождение + - - Исходы 1. Воспаление - + + 2. Программированная гибель клетки + + +/-