ݺߣ

ݺߣShare a Scribd company logo

Suvremene dijagnostičke metode u kliničkoj mikrobiologiji

•Download as PPTX, PDF•
•
I
improvemed

Suvremene dijagnostičke metode u kliničkoj mikrobiologiji

1 of 29
Download to read offline
Improved Medical Education in Basic Sciences for Better Medical Practicing ImproveMEd Molecular methods in clinical microbiology Domagoj Drenjancevic
Thymine Adenine Cytosine Guanine Adenine Guanine Thymine Cytosine
Primjena molekularnih dijagnostičkih metoda u mikrobiologiji • direktna detekcija mikroorganizama • identifikacija mikroorganizama • detekcija gena koji određuju virulenciju • detekcija gena koji određuju rezistenciju prema antimikrobnim sredstvima • tipizacija bakterijskih izolata u epidemiološkim istraživanjima
4 Molekularna dijagnostika 1. točna identifikacija organizma izoliranog u čistoj kulturi 2. brza detekcija direktno iz kliničkih uzoraka 3. detekcija organizama iz uzoraka iz kojih se tradicionalnom kultivacijom nije izolirao uzročnik (endokarditis) - Mala količina uzročnika - Nevijabilni mikroorganizmi 4. Karakterizacija uzročnika, tipizacija - geni za rezistenciju - epidemiološki markeri
5 Kada Molekularna detekcija i identifikacija? • Kod nutritivno zahtjevnih bakterija- HACEK endokarditisi • Kod spororastućih bakterija – mikobakterije • Kod bakterija koje za laboratorijski uzgoj trebaju posebne tehnike - stanične kulture • Nakon već primijenjene antibiotske terapije
…potreba za primjenom molekularne tehnologije…… Dijagnostika: - pandemijskih virusa tj. virusa humane imunodeficijencijetipa 1 (HIV-1), virusa hepatitisa B (HBV) i C (HCV); - uzročnika spolno prenosivih infekcija kao dio programa praćenja ženskog zdravlja (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorhoeae, humani papilomavirusi); - respiratornih infekcija; - obrade bolesnika liječenih transplantacijom; - neurotropnih virusa u cerebrospinalnom likvoru - Sepse
Molekularna dijagnostika Nedostaci 1. osjetljivost na inhibitore –lažno negativni rezultati 2. osjetljivost na kontaminaciju –lažno pozitivni rezultati 3. nemogućnost razlikovanja vijabilnih od nevijabilnih stanica 4. Nemogućnost daljnje karakterizacije soja (osjetljivosti na antibiotike?, tipizacija?)
Prednosti primjene molekularne metode u kliničkom mikrobiološkom laboratoriju • brzina metode (važna za uspjeh liječenja) • jedinstvenost metode (primjena u određenim grupama bolesnika zbog nemogućnosti primjene drugih metoda) • kvantitativno određivanje virusa (olakšano praćenje učinka terapije) • tipizacija sojeva u svrhu epidemioloških analiza
9 I. Hibridizacija nukleinskih kiselina • razvijena 1970-tih i još je u uporabi • temelji se na osobini da dvije jednolančane nuklelinske kiseline imaju komplemantarne sekvence i vežu se specifično jedna s drugom tvoreći dvolančanu nukleinsku kiselinu = dupleks ili hibrid. • Test treba: 1.PROBU/Sondu = jednu jednolančanu nukleinsku kiselinu (DNA, RNA) izoliranu iz organizma poznatog identiteta • obilježene enzimima ili kemiluminiscentnim molekulama 2. CILJNU jednolančanu nukleinsku kiselinu iz nepoznatog organizma koju treba detektirati ili identificirati. • PROBAMA se može identificirati organizam i na nivou vrste
Princip molekularne hibridizacije A B C citozin gvanin timin adenin ciljna DNA DNA proba Izolacija DNA Denaturacija DNA - Molekularna hibridizacija - iz uzorka razdvajanje DNA lanaca vezanje obilježene DNA probe na ciljnu DNA
Hibridizacija nukleinskih kiselina 1. “dot-blot” hibridizacija – izolirana DNA se nanaosi na membranu u obliku točke 2. Southern blot –DNA fragmenti izdvojeni elektroforetski na nitroceluloznoj membrani 3. Imunoblot ili Western blot hibridizacija – za detekciju specifičnih protutijela na elektroforteski izdvojene virusne antigene nanešene na nitorceluloznoj membrani prema molekularnoj težini • kompleks Ag i protutijelo – detekcija pomoću enzimom obilježenih protuljudskih protutijela • Očitavanje – obojena liniija na dijelu membrane gdje se vežu Ag i Ab • Često potvrdna metoda specifičnosti protutijela u virusologiji (nakon ELISA)
II. Metoda lančane reakcije polimeraze - PCR • od jedne kopije DNA dobije se u reakciji nekoliko bilijuna kopija (2n- ovisno o broju ciklusa umnožavanja) • Za provođenje reakcije umnožavanja treba poznavati slijed DNA, odnosno slijed nukleotida odsječka DNA koji se treba umnažati
13 PCR Princip - umnažanje određenog odsječka DNA u in vitro uvjetima, - umnažanje ovisi o nizu čimbenika, - uvjeti trebaju biti definirani, - ne postoji jedinstveni protokol, - mora se reakcija prethodno optimizirati,
PCR • Slijed nukleotida služi za odabir Početnice (Primer) (par kraćih nukleotida koji predstavljaju granice –lijevo i desno- odsječka DNA koji se umnaža) • Treba enzim - termostabilna DNA polimeraza • Uspješnost reakcije ovisi o: • Odabiru POČETNICE-duljina iznosi od 18-24 pb (preduge umanjuju djelotvornost sparivanja, prekratke- dovode do umnažanja nespecifičnog produkta) • Temperaturi sparivanja (annealing) 50-65 °C i uvijek je 5°C niža od temperature “taljenja”/odvajanja (melting point)
Amplifikacija
Suvremene dijagnostičke metode u kliničkoj mikrobiologiji
Detekcija - elektroforeza 1 2 3 4 5 6 7
Fotografija elektroforetskog gela
TMB COBAS AMPLICOR Analyzer 1. Amplifikacija 2. Denaturacija 4.Konjugacija 5.Kataliza supstrata 6.Fotometar 3.Hibridizacija Magnetske mikročestice
RT-PCR
21 III. Real-time PCR • za precizniju kvantifikaciju– lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu • produkti reakcije su obilježeni fluorescentnim bojama i analiziraju se za vrijeme nastajanja • Fluorescentne boje za obilježavanje produkta real- time PCR: 1.SYBER Green 1 -vežu se za novonastalu dvolančanu DNA i emitira se fluorescencija koja se mjeri
22 Real-time PCR 2. Fluorescencijski oligonukleotidi -sonda TaqMan = specifična POČETNICA je neobilježena, a specifično je obilježena sonda • Real-time PCR apsolutnom kvantifikacijom - precizno se određuje broj kopija RNA u nekom uzorku usporedbom sa standardnom krivuljom
23 Real Time PCR aparat mjeri razinu fluorescencije za vrijeme reakcije
24 Real- time PCR
25 IV Multiplex PCR • Metoda u kojoj su u jednoj epruveti uključeni dva ili više parova početnica i 2 ili više DNA kalupa su istovremeno cilj- tako se relativno jednostavno može detektirati nekoliko različitih bakterija u jednoj PCR reakciji. • Parovi početnica moraju biti specifičani za ciljni gen, a produkti moraju biti različitih veličina
26 SeptiFast (Roche) • na temelju ITS (Internal transcribed spacer) regije bakterijskog ili gljivičnog genoma-identifikacija na bazi analize točke taljenja (melting point) • Istovremeno dentifikacija 25 najčešćih bakterijskih i gljivičnih uzročnika • Obrada do 7 uzoraka krvi • Trajanje testa- do 6 sati • Instrument: LightCycler® 2.0
27 V. PCR širokog raspona (Broad ranged PCR) •koristi se za univerzalnu detekciju mikrobnih uzročnika •Početnice su odabrane iz KONZERVIRANE REGIJE određenog gena, koji dijele organizmi u taksonomskoj grupi- zato je važan odabir stvarno široko raspona početnice
28 VI. DNA-čipovi (DNA microarray) • Sastoje se od velikog broja kratkih odsječaka DNA od 25 nukleotida (PROBE) koji su kemijski sintetizirani na točno određenim položajima kvarcom pokrivene površine čipa
DNA-čipovi (GENECHIP, AFFYMETRIX) • Sastoje se od velikog broja kratkih odsječaka DNA od 25 nukleotida (PROBE) koji su kemijski sintetizirani na točno određenim položajima kvarcom pokrivene površine čipa • DNA microarray (DNAčip) omogućuje analizu svih transkripata koji su prisutni u uzorku u trenutku izdvajanja mRNA i tako se analiziraju aktivnosti svih gena u uzorku za koje postoje komplemantarne probe vezane na čip

More Related Content

Suvremene dijagnostičke metode u kliničkoj mikrobiologiji

  • 1. Improved Medical Education in Basic Sciences for Better Medical Practicing ImproveMEd Molecular methods in clinical microbiology Domagoj Drenjancevic
  • 3. Primjena molekularnih dijagnostičkih metoda u mikrobiologiji • direktna detekcija mikroorganizama • identifikacija mikroorganizama • detekcija gena koji određuju virulenciju • detekcija gena koji određuju rezistenciju prema antimikrobnim sredstvima • tipizacija bakterijskih izolata u epidemiološkim istraživanjima
  • 4. 4 Molekularna dijagnostika 1. točna identifikacija organizma izoliranog u čistoj kulturi 2. brza detekcija direktno iz kliničkih uzoraka 3. detekcija organizama iz uzoraka iz kojih se tradicionalnom kultivacijom nije izolirao uzročnik (endokarditis) - Mala količina uzročnika - Nevijabilni mikroorganizmi 4. Karakterizacija uzročnika, tipizacija - geni za rezistenciju - epidemiološki markeri
  • 5. 5 Kada Molekularna detekcija i identifikacija? • Kod nutritivno zahtjevnih bakterija- HACEK endokarditisi • Kod spororastućih bakterija – mikobakterije • Kod bakterija koje za laboratorijski uzgoj trebaju posebne tehnike - stanične kulture • Nakon već primijenjene antibiotske terapije
  • 6. …potreba za primjenom molekularne tehnologije…… Dijagnostika: - pandemijskih virusa tj. virusa humane imunodeficijencijetipa 1 (HIV-1), virusa hepatitisa B (HBV) i C (HCV); - uzročnika spolno prenosivih infekcija kao dio programa praćenja ženskog zdravlja (Chlamydia trachomatis, Neisseria gonorhoeae, humani papilomavirusi); - respiratornih infekcija; - obrade bolesnika liječenih transplantacijom; - neurotropnih virusa u cerebrospinalnom likvoru - Sepse
  • 7. Molekularna dijagnostika Nedostaci 1. osjetljivost na inhibitore –lažno negativni rezultati 2. osjetljivost na kontaminaciju –lažno pozitivni rezultati 3. nemogućnost razlikovanja vijabilnih od nevijabilnih stanica 4. Nemogućnost daljnje karakterizacije soja (osjetljivosti na antibiotike?, tipizacija?)
  • 8. Prednosti primjene molekularne metode u kliničkom mikrobiološkom laboratoriju • brzina metode (važna za uspjeh liječenja) • jedinstvenost metode (primjena u određenim grupama bolesnika zbog nemogućnosti primjene drugih metoda) • kvantitativno određivanje virusa (olakšano praćenje učinka terapije) • tipizacija sojeva u svrhu epidemioloških analiza
  • 9. 9 I. Hibridizacija nukleinskih kiselina • razvijena 1970-tih i još je u uporabi • temelji se na osobini da dvije jednolančane nuklelinske kiseline imaju komplemantarne sekvence i vežu se specifično jedna s drugom tvoreći dvolančanu nukleinsku kiselinu = dupleks ili hibrid. • Test treba: 1.PROBU/Sondu = jednu jednolančanu nukleinsku kiselinu (DNA, RNA) izoliranu iz organizma poznatog identiteta • obilježene enzimima ili kemiluminiscentnim molekulama 2. CILJNU jednolančanu nukleinsku kiselinu iz nepoznatog organizma koju treba detektirati ili identificirati. • PROBAMA se može identificirati organizam i na nivou vrste
  • 10. Princip molekularne hibridizacije A B C citozin gvanin timin adenin ciljna DNA DNA proba Izolacija DNA Denaturacija DNA - Molekularna hibridizacija - iz uzorka razdvajanje DNA lanaca vezanje obilježene DNA probe na ciljnu DNA
  • 11. Hibridizacija nukleinskih kiselina 1. “dot-blot” hibridizacija – izolirana DNA se nanaosi na membranu u obliku točke 2. Southern blot –DNA fragmenti izdvojeni elektroforetski na nitroceluloznoj membrani 3. Imunoblot ili Western blot hibridizacija – za detekciju specifičnih protutijela na elektroforteski izdvojene virusne antigene nanešene na nitorceluloznoj membrani prema molekularnoj težini • kompleks Ag i protutijelo – detekcija pomoću enzimom obilježenih protuljudskih protutijela • Očitavanje – obojena liniija na dijelu membrane gdje se vežu Ag i Ab • Često potvrdna metoda specifičnosti protutijela u virusologiji (nakon ELISA)
  • 12. II. Metoda lančane reakcije polimeraze - PCR • od jedne kopije DNA dobije se u reakciji nekoliko bilijuna kopija (2n- ovisno o broju ciklusa umnožavanja) • Za provođenje reakcije umnožavanja treba poznavati slijed DNA, odnosno slijed nukleotida odsječka DNA koji se treba umnažati
  • 13. 13 PCR Princip - umnažanje određenog odsječka DNA u in vitro uvjetima, - umnažanje ovisi o nizu čimbenika, - uvjeti trebaju biti definirani, - ne postoji jedinstveni protokol, - mora se reakcija prethodno optimizirati,
  • 14. PCR • Slijed nukleotida služi za odabir Početnice (Primer) (par kraćih nukleotida koji predstavljaju granice –lijevo i desno- odsječka DNA koji se umnaža) • Treba enzim - termostabilna DNA polimeraza • Uspješnost reakcije ovisi o: • Odabiru POČETNICE-duljina iznosi od 18-24 pb (preduge umanjuju djelotvornost sparivanja, prekratke- dovode do umnažanja nespecifičnog produkta) • Temperaturi sparivanja (annealing) 50-65 °C i uvijek je 5°C niža od temperature “taljenja”/odvajanja (melting point)
  • 19. TMB COBAS AMPLICOR Analyzer 1. Amplifikacija 2. Denaturacija 4.Konjugacija 5.Kataliza supstrata 6.Fotometar 3.Hibridizacija Magnetske mikročestice
  • 21. 21 III. Real-time PCR • za precizniju kvantifikaciju– lančana reakcija polimeraze u stvarnom vremenu • produkti reakcije su obilježeni fluorescentnim bojama i analiziraju se za vrijeme nastajanja • Fluorescentne boje za obilježavanje produkta real- time PCR: 1.SYBER Green 1 -vežu se za novonastalu dvolančanu DNA i emitira se fluorescencija koja se mjeri
  • 22. 22 Real-time PCR 2. Fluorescencijski oligonukleotidi -sonda TaqMan = specifična POČETNICA je neobilježena, a specifično je obilježena sonda • Real-time PCR apsolutnom kvantifikacijom - precizno se određuje broj kopija RNA u nekom uzorku usporedbom sa standardnom krivuljom
  • 23. 23 Real Time PCR aparat mjeri razinu fluorescencije za vrijeme reakcije
  • 25. 25 IV Multiplex PCR • Metoda u kojoj su u jednoj epruveti uključeni dva ili više parova početnica i 2 ili više DNA kalupa su istovremeno cilj- tako se relativno jednostavno može detektirati nekoliko različitih bakterija u jednoj PCR reakciji. • Parovi početnica moraju biti specifičani za ciljni gen, a produkti moraju biti različitih veličina
  • 26. 26 SeptiFast (Roche) • na temelju ITS (Internal transcribed spacer) regije bakterijskog ili gljivičnog genoma-identifikacija na bazi analize točke taljenja (melting point) • Istovremeno dentifikacija 25 najčešćih bakterijskih i gljivičnih uzročnika • Obrada do 7 uzoraka krvi • Trajanje testa- do 6 sati • Instrument: LightCycler® 2.0
  • 27. 27 V. PCR širokog raspona (Broad ranged PCR) •koristi se za univerzalnu detekciju mikrobnih uzročnika •Početnice su odabrane iz KONZERVIRANE REGIJE određenog gena, koji dijele organizmi u taksonomskoj grupi- zato je važan odabir stvarno široko raspona početnice
  • 28. 28 VI. DNA-čipovi (DNA microarray) • Sastoje se od velikog broja kratkih odsječaka DNA od 25 nukleotida (PROBE) koji su kemijski sintetizirani na točno određenim položajima kvarcom pokrivene površine čipa
  • 29. DNA-čipovi (GENECHIP, AFFYMETRIX) • Sastoje se od velikog broja kratkih odsječaka DNA od 25 nukleotida (PROBE) koji su kemijski sintetizirani na točno određenim položajima kvarcom pokrivene površine čipa • DNA microarray (DNAčip) omogućuje analizu svih transkripata koji su prisutni u uzorku u trenutku izdvajanja mRNA i tako se analiziraju aktivnosti svih gena u uzorku za koje postoje komplemantarne probe vezane na čip