Tabm prak
Download as pptx, pdf0 likes2,032 views
Dokumen ini membahas teknik Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) dan proses isolasi DNA yang menjadi langkah awal dalam analisis tersebut. RFLP digunakan sebagai marker molekular yang penting untuk berbagai aplikasi di bidang genomik dan kedokteran hewan. Dokumen juga mencakup tujuan, manfaat, dan tahapan praktikum RFLP serta tantangan yang dihadapi dalam proses tersebut.
Tabm prak
- 1. ISOLASI DNA & RFLP Kelompok 5
- 2. Khoirunnisa (0911310016) Lelyta Damayanti (0911310017) Yosia Arauna (0911310028) Yulinar Risky Karaman (0911310030) Putrika Suryandari (0911310057)
- 3. LATAR BELAKANG o RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphisms) adalah salah satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA o RFLP merupakan marker yang sangat dapat dipercaya dalam analisis linkage dan breeding dan dapat ditentukan dengan mudah jika karakter terdapat dalam bentuk homozigot atau heterozigot. o RFLP digunakan sebagai marker molekular karena spesifik untuk setiap tunggal atau kombinasi dari enzim restriksi. o Untuk dapat melakukan RFLP, maka perlu dilakukan proses isolasi DNA. o Isolasi DNA adalah perusakan atau pembuangan dinding sel yang dapat dilakukan baik dengan cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku-leleh maupun dengan cara enzimatis seperti pemberian lisozim.
- 4. LATAR BELAKANG o Aplikasi dari RFLP dapat digunakan untuk pemetaan genom, genome typing, tes paternitas, forensic dan diagnostik hereditas penyakit o Melihat banyaknya manfaat yang didapat dari RFLP untuk keperluan penelitian maupun diagnosa suatu penyakit, maka sangat perlu dilakukan praktikum Teknik Analisis Biomolekular tentang proses atau tahapan RFLP secara keseluruhan.
- 5. RUMUSAN MASALAH 1. Apakah yang dimaksud dengan teknik RFLP? 2. Bagaimana tahapan tahapan teknik RFLP? 3. Salah satu tahapan teknik RFLP adalah isolasi DNA. Apakah yang dimaksud isolasi DNA? 4. Bagaimana proses atau tahapan isolasi DNA? 5. Enzim restriksi apakah yang digunakan dalam teknik RFLP? 6. Bagaimana sisi pemotongan enzim restriksi yang dipakai dalam teknik RFLP? 7. Apakah manfaat teknik RFLP dalam bidang kedokteran hewan? 8. Apakah kerugian atau kelemahan dari teknik RFLP?
- 6. TUJUAN 1. Untuk mengetahui pengertian dari teknik RFLP 2. Untuk mengetahui tahapan tahapan teknik RFLP 3. Untuk mengetahui pengertian dari isolasi DNA 4. Untuk mengetahui proses atau tahapan isolasi DNA 5. Untuk mengetahui macam macam enzim restriksi yang digunakan dalam teknik RFLP 6. Untuk mengetahui sisi pemotongan enzim restriksi yang dipakai dalam teknik RFLP 7. Untuk mengetahui manfaat teknik RFLP dalam bidang kedokteran hewan 8. Untuk mengetahui kelemahan dari teknik RFLP
- 7. MANFAAT Pemetaan genetik penentuan mutasi Menduga hubungan kekerabatan dari beberapa individu yang dianalisis maupun kesamaan spesies Menduga ada tidaknya variasi genetik dari koleksi plama nutfah Dapat memonitor proses seleksi (melalui linkage) berbagai karakter Dapat memilah-milah komponen genetik dari karakter kuantitatif Dapat menganalisis gen yang berasal dari proses transformasi genetik Bersifat kodominan sehinggan dapat mendeteksi adanya heterozigositas Memiliki kemampuan memisahkan yang tinggi pada tingkat spesies, populasi
- 9. Isolasi DNA dr Organ Hewan 0,1 gr organ hewan Homogenat Supernatan Supernatan Pelet Pelet DNA
- 10. 0,1 gr organ Homogenat hewan Dihomogenasi dgn mortar pd kondisi dingin Menghomogenkan, menghancurkan Dingin agar DNA tidak rusak (menjaga) (+) 0,5 mL buffer lysis campur Menghomogenkan (+) buffer mejaga kondisi fisiologis
- 11. Homogenat Supernatan Dimasukkan tabung eppendorf steril (+) 300 袖L PCI divortex sebentar Memisahkan protein & DNA Menghomogenkan Disentrifus v=13000 rpm (10 mnt, 4属C) Memisahkan molekul berdasarkan berat jenis & gravitasi
- 12. Supernatan Supernatan Dimasukkan tabung eppendorf steril baru (+) 300 袖L CI divortex sebentar Memisahkan protein & DNA Menghomogenkan Disentrifus v=13000 rpm (10 mnt, 4属C) diulang 1x lagi Memisahkan molekul berdasarkan berat jenis & gravitasi
- 13. Supernatan Pelet Dimasukkan tabung eppendorf steril baru (+) amonium asetat (+) 1 mL ethanol absolut (bolak-balik) Presipitasi DNA Disentrifus v=8000 rpm (5 mnt, 4属C) Memisahkan materi berdasarkan berat jenis & gravitasi
- 14. Pelet Pelet Diambil, (+) ethanol 70% (bolak-balik) Resuspensi Disentrifus v=8000 rpm (5 mnt, 4属C) Memisahkan berdasarkan berat jenis & gravitasi
- 15. Pelet DNA Dikeringkan dlm inkubator (55属C, 5 mnt) Mengawetkan/mengambil DNA (+) 20-50 袖L TE buffer disimpan pd freezer (-20属C)
- 16. RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Thinwall 10 袖L DNA hasil PCR 2 袖L buffer enzim dimasukkan 2 袖L enzim restriksi 6 袖L ddH2O agar gel di mix gentle lurus/rata diinkubasi (37属C, semalam) diinkubasi (70属C, 10 mnt) u/ stop reaksi (agar enzim rusak) disimpan dlm freezer Hasil
- 18. Pembahasan Pada foto hasil praktikum terlihat bahwa band yang dihasilkan terlihat mengelompok karena konsentrasi DNA yang digunakan terlalu tinggi sehingga tidak menampilkan hasil yang baik saat ditampilkan dalam foto Semakin terang warnanya maka semakin banyak DNA nya yang terkandung Hal it dapat dilihat pada T1,T2,M7,M8
- 19. Prinsip Kerja Secara garis besar, prosedur AFLP dipilah menjadi tiga tahap pokok: Pemotongan (digesti) oleh enzim restriksi dan penempelan (ligasi) adapter Perbanyakan (amplifikasi) selektif atas potongan-potongan DNA Analisis hasil amplifikasi lewat elektroforesis gel
- 20. Troubleshooting Hasil yang didapatkan dari isolasi DNA tiap spesimen tdak sama, mungkin tersebut terjadi pada saat homogenisasi awal. Hasil dari RFLP menujukkan hasil yang berbeda pada uji kuantitas yaitu pengukuran dengan spektrofotometri.
- 21. Kelebihan dan Kekurangan Teknik RFLP memiliki beberapa kelebihan, tidak memerlukan pengetahuan atau data tentang sekuens DNA genom yang akan dianalisa, hanya memerlukan sampel DNA dalam jumlah yang sedikit, teknik ini dapat digunakan untuk berbagai jenis sampel DNA, penanda yang dihasilkan lebih dapat dipercaya dan hasil pengulangan lebih baik jika dibandingkan dengan RAPD. Kekurangan dari RFLP adalah penanda DNA yang dihasilkan hanya bersifat dominan.
- 22. Enzim Restriksi EcoRI (diucapkan "eko R satu") adalah enzim yang diisolasi dari endonuklease strain E. coli. Dalam biologi molekuler digunakan sebagai enzim restriksi. Ini menciptakan ujung lengket dengan overhang akhir 5 '. Urutan asam nukleat tempat pemotongan enzim GAATTC, yang, sebagai urutan komplementer adalah CTTAAG, memiliki simetri rotasi.
- 23. HindIII (diucapkan "Hin Dee Tiga") adalah tipe II spesifik situs enzim restriksi deoxyribonuclease terisolasi dari Haemophilus influenzae yang membelah urutan DNA pada AAGCTT Pembelahan urutan antara hasil AA dalam overhang 5 'pada DNA yang disebut sticky end: 5'-A | A G C T T-3 ' 3'-T T C G A | A-5 '
- 24. Exon 23 PARP 1 Mus musculus
- 25. Basa Hasil pemotongan EcoR1
- 26. Kesimpulan Analisis Restriction fragment length polymorphism (RFLP) adalah salah satu teknik pertama yang secara luas digunakan untuk mendeteksi variasi pada tingkat sekuen DNA. Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya.
- 27. saran Untuk melakukan RFLP perlu diberi kesempatan pada mahasiswa untuk melakukan praktikum secara lengkap