Tahapan sito
- 1. Oleh : Heru Susanto,S.Si Teknik Histologi adalah tahapan2 dalam melakukan teknik sito-histologi dimulai dari mendapatkan jaringan sampai dihasilkan preparat yang siap diperiksa secara mikroskopis Tahapan Teknik Sito-Histologi 1. Mendapatkan Jaringan 2. Fiksasi 3. Dehidrasi 4. Clearing 5. Embedding 6. Sectioning/Cutting 7. Mounting 8. Staining 9. Labeling Mendapatkan Jaringan  Jaringan harus diduga tumor atau kelainan  Jaringan harus sudah difikasasi sebelum 6 jam setelah kematian, bisa terjadi maserasi  Pemotongan menggunakan pisau tajam ukuran biasanya (1,5x1x0,5) cm3  Mendapatkan Jaringan  Harus segera dimasukkan ke dlm larutan fiksasi (Volume 40x) selama 1 malam - Tidak boleh dicuci dg air (terjadi perubahan tekanan osmotik - Tidak boleh disimpan dlm NaCl 0,9 % -maserasi - Tidak boleh dibekukan-pembentukan kristal es dlm sitoplasma -Jaringan berbentuk tulang harus didekalsifikasi agar lunak dg HCl 0,5 % Fiksasi Jaringan Fiksasi Jaringan adalah Proses mengawetkan jaringan agar awet dan kondisinya sama seperti hidup. Dilakukan dengan merendam jaringan ke lart fiksasi (volume min 20x besar jar) selama 24 jam Fiksasi Jaringan Manfaat Fiksasi : •Sel & jar keadaannya seperti hidup •Membunuh Bakteri •Mematikan sel secara serentak •Mengeraskan jaringan •Melindungi sel dari prosesselanjutnya •Mempermudah pengecatan •Melindungi sel/jar dari autolysis dan putrefaction
- 2. Fiksasi Jaringan Berdasar Cara Kerja : P Precipitant fixatives (mengkoagulasikan protein) ex : Mercuri klorida, alkohol P Non Precipitant fixatives (mendenaturasikan protein) ex : Potassium diphosphat Berdasar Tujuan Pemakaian : P Micro Anatomical Fixatives (melihat komponen jar scr keseluruhan) ex : susa, Bouin, Zenker P Cytological Fixatives : melihat komponen inti, ex : Fleming, Corney, Sanpelice. melihat komponen sitoplasma, ex : Formaldehida (5% Formal saline), Fleming dikurangi asam asetat galsial, BERDASARKAN KOMPOSISINYA ü Simple fixative (Zat fiksatif yang dipakai tunggal) ex : Mercuri Chlorida, Alkohol, Picric Acid, Chromic Acid ü Compound fixatives (Zat fiksatif yang digunakan secara gabungan) ex : NaCl Formalin, Suza, Zenker, dsb. Kecepatan penetrasi zat Fiksatif Berbeda-beda ü Paling cepat : asam acetat glacial ü Paling lambat : Osmium Tetraoksida (OsO4) SIFAT ZAT FIKSATIF Alkohol - Mengeraskan jaringan. - Daya penetrasi kuat. - Melarutkan kromatin Asam Asetat Glasial- Melunakan jaringan. - Daya penetrasi kuat. - Memfiksasi kromatin Dehidrasi Proses penarikan air secara aktif dari dalam jaringan Proses Dehidrasi Untuk memudahkan proses infiltrasi parafin ke dalam jaringan menggunakan alkohol dari konsentrasi rendah-tinggi Proses Dehidrasi } Contoh Proses Dehidrasi ü alkohol 70%.......... 1 hari ü alkohol 80%........... 1 hari ü alkohol 90%........... 1 hari ü alkohol 95% .......... 1 hari ü alkohol 95% .......... 1 hari ü alkohol 100% ........ 1 hari ü alkohol 100% ........ .1 hari Alkohol dapat dimurnikan kembali dengan cuprisulfat (CuSO4) Cuprisulfat-putih (tak mengandung air) akan berubah menjadi biru (mengandung air). Ganti cuprisulfat beberapa kali hingga warnanya tetap putih walaupun telah disimpan beberapa hari. Cuprisulfat yang telah bewarna biru karena mengandung air dapat di hilangkan airnya dengan cara memanaskan. Proses Dehidrasi Lamanya waktu tergantung pada :  Besar kecilnya jaringan  Konsentrasi jaringan  Macam zat fiksasi yang dipakai  Sifat clearing agent yang dipakai Proses Clearing Syarat clearing agent harus melarutkan alkohol dan parafin Clearing agent yang biasa dipakai :  Xylene.  Benzene  Toluen  Chloroform EMBEDDING Embedding adalah Proses memasukkan jaringan ke dlm parafin cair untuk dibuat blok yg padat Meliputi : q Impregnation q Blocking q Trimming Proses Embedding Impregnation.
- 3. proses penggantian larutan toluen dengan parafin cair Blocking. Memasukkan jaringan ke dalam parafin cair - dipadatkan (menurunkan suhu parafin)-dicetak Trimming. Meratakan/merapikan jaringan yg telah diblock parafin dengan menggunakan pisau atau langsung dengan mikrotome, sehingga pada saat pemotongan didapatkan potongan bentuk jaringan yang baik Proses SECTIONING / CUTTING Sectioning adalah proses pemotongan jar dengan mikrotom-ukuran sangat tipis 4-10 μ-tembus cahaya saat diperiksa dg mikroskop Diperhatikan : P Pisau harus tajam P Blok jaringan harus dingin P Ketebalan pemotongan harus disesuaikan dengan jenis jaringan Proses Sectioning Dinginkan pada lemari es / cold plate - akan terlepas dari cetakan bloknya dan tempatkan pada hold mikrotome untuk dipotong (ketebalan 3 – 5 μ) -membentuk lembaran pita MOUNTING Menempelkan potongan jaringan yg baik ke obyek glass Proses Mounting } Obyek glass diberi albumin agar Jar menempel dg baik } Dimasukkan ke dalam water bath suhu 30 0C - lembaran pita tidak melipat } Bila sudah menempel dikeringkan/ diriskan (Bisa dg Hot Plate) } Stretching tissue in warm water. Staining mewarnai preparat Staining Macam pewarnaan berdasarkan asal zat warna : Natural Dyes, Acid Carmine : ekstrak serangga betina yang hidup di pohon kaktus di daerah tropis. Hematoxyline : getah pohon Haematoxylinecampechianum Syntetic Dyes Benzene, Quinone, Anilline. Staining Prinsip Kerja Pewarnaan : ü Secara umum zat warna yang bersifat asam akan mewarnai bagian sel yang bersifat basa dan sebaliknya ü cat netral (gugus asam dan gugus basa keduanya berwarna) Misal : ü Romanowsky ,(Camp methylen Blue & Eosin) Staining Berdasarkan waktu :  Direct Staining, molekul zat warna langsung ditangkap oleh jaringan, misalnya Eosin  Indirect Staining, molekul zat warna baru bisa ditangkap oleh jaringan jika menggunakan zat perantara yang disebut Mordant, misalnya Haematoxyline menggunakan Potasium Alum sebagai mordantnya. Pewarnaan Hematoksilin-Eosin (HE) Menggunakan 2 macam zat warna yaitu q Hematoksilin -memulas inti sel dan memberikan warna biru (basofilik) q Eosin yang merupakan counterstaining hematoksilin, memulas sitoplasma sel dan jaringan penyambung dan memberikan warna merah muda dengan nuansa yang berbeda. Interpretasi hasil : P Inti sel bewarna biru P Sitoplasma bewarna kemerahan dengan adanya beberapa variasi warna pada komponen tertentu