ݺߣ

ݺߣShare a Scribd company logo

Tách dòng gene

•Download as PPTX, PDF•
•
Hạnh Hiền
Hạnh Hiền

Tách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen, một đoạn DNA cần thiết (DNA ensert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện tích hợp để các tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số các tế bào cùng mang một đoạn DNA insert giống nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng. DNA tái tổ hợp được chế tác với mục đích là để thực hiện một quá trình gọi là sự tách dòng. Tách dòng là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen hay của một mảnh đoạn DNA. Tách dòng có thể được đi kèm hoặc không được đi kèm với sự biểu hiện protein. Những áp dụng này của DNA tái tổ hợp dùng để thiết lập các ngân hàng bộ gen, cDNA hoặc tổng hợp protein, enzyme, hormone, ... B1: Các bước thực hiện chủ yếu: tách chiết DNA bộ gen, nhân gen bằng PCR, sửdụng enzym giới hạn cắt thành các đoạn DNA nhỏ, điện di trên gel agar (hoặc gel polyacrylamid) với thang DNA chuẩn. Từkết quả điện di, dựa vào kích thước của gen cần tách dòng để lựa chọn được đoạn DNA chứa gen cần tách dòng. Chọn vector tách dòng dựa vào mục đích và kích thước gen tách dòng. Tách dòng in silico hay tách dòng ảo (cloning in silico) là sự tổng hợp, phân tích các kết quả tách dòng gen in vitro, trên cơ sở thông tin từ các ngân hàng dữ liệu (STS, EST…) để lựa chọn một đoạn DNA hoặc một gen cần thiết nào đó. Kết quả tách dòng in silico cho phép lựa chọn phương án thiết kế vectơ tái tổ hợp có hiệu quả, dự toán trước kết quả tách dòng và hiệu quả biểu hiện gen cũng như mức độ thành công của thực nghiệm

1 of 20
Downloaded 91 times
GVHD :Th.s NGUYỄN PHƯƠNG HOA HVTH : Viện đại học Mở Hà Nội Khoa sau Đại học
ĐỊNH NGHĨA Tách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen, một đoạn DNA cần thiết (DNA ensert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện tích hợp để các tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số các tế bào cùng mang một đoạn DNA insert giống nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng. TÁCH DÒNG GENE Figure : Cloning a gene using a plasmid. (1) Chromosomal DNA of organism A. (2) PCR. (3) Multiple copies of a single gene from organism A. (4) Insertion of the gene into a plasmid. (5) Plasmid with gene from organism A. (6) Insertion of the plasmid in organism B. (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B.
ĐỊNH NGHĨA Vector tách dòng (vector cloning) là một phân tử DNA có kích thước nhỏ cho phép cài gắn một đoạn DNA ngoại lai vào nhằm mục đích nhân đoạn DNA ngoại lai lên với số lượng lớn. Các loại vectơ tách dòng thường dùng: Plasmid, Cosmid, Phage, Phagemid, BAC (Bacterium artificial chromosomes), YAC (yeast artificial chromosomes)… VECTO TÁCH DÒNG Hình 2: Plasmid pGEX-3x là một vector tách dòng phổ biến.
ĐẶC ĐIỂM  Có khả cài gắn các đoạn DNA ngoại lai  Phải có trình tự khởi đầu sao chép để có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ.  Có kích thước nhỏ để xâm nhập tế bào chủ  Có thể tái bản độc lập không phụ thuộc vào bộ gen của tế bào chủ.  Có chứa các gen chỉ thị, chọn lọc (gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu...) VECTO TÁCH DÒNG
A. Vector tách dòng là Plasmid  Kích thước 1 –5kb, sợi xoắn kép dạngvòng, trong tế bào chất của tế bàovi khuẩn hoặc tế bào nấm men  pBR332 do Bolivar và Rodiguez (1977) thiết kế, có 21 điểm cắt cho các enzym giới hạn, cho phép mang đoạn ADN cài đến 5 kb. VECTO TÁCH DÒNG
A. Vector tách dòng là Plasmid Nhiều loại Plasmid nhân tạo ( thế hệ 2 và 3) được tạo nên bằng cách tập hợp các đặc tính quý của plasmid tự nhiên, gắn thêm các gen chỉ thị và đoạn đa cắt nối tạo nên plasmid mạnh. VECTO TÁCH DÒNG Hình : Plasmid thế hệ 2 điển hình pUC18
A. Vector tách dòng là Plasmid Ưu điểm - Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ. - Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp. - Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh. Nhược điểm - Đôi khi, hiệu suất biến nạp vào tế bào chủ thấp. - Không hiệu quả khi biến nạp ở eukaryote. - Không tách dòng được các phân đoạn ADN kích thước lớn (> 10 kb VECTO TÁCH DÒNG
B. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ PHAGE Kích thước : 15- 25kb Phage bao gồm nhiều loại thức khuẩn có bộ gen DNA mạch đơn hoặc kép sử dụng làm vector tách dòng có nhiều loại: f1, M13, fd… các vector này được tạo nên từ sự cải biến bộ gen phage. VECTO TÁCH DÒNG
B. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ PHAGE Ưu điểm: -Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote. - Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 kb. -Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở to lạnh (vd. 4oC). Nhược điểm: - Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp hơn. - Số bản sao phage hình thành trong mỗi tế bào thấp hơn số bản sao của plasmid. VECTO TÁCH DÒNG
C. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ PHAGEMID Mang được đoạn AND cài 20-10kb Cấu tạo gồm 1 số gen của plasmid ( gen chỉ thị..) và một phần gen của phage ( đoạn ori, các gen cần thiết cho sự đóng gói) VD: Vector pEMBL8 cấu tạo từ 1 đoạn của phage M13 mang đoạn gen chỉ thị kháng sinh Amp và LacZ từ plasmid VECTO TÁCH DÒNG
D. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ COSMID - Là véctơ lai của plasmid và và đoạn cos của phage, mang các ưu điểm của hai véctơ này: (1) khả năng tự tái bản số lượng lớn của plasmid, (2) có khả năng đóng gói in-vitro như phage - Có khả năng mang các đoạn ADN cài có kích thước đến 30 – 50 kb. VECTO TÁCH DÒNG
VECTO TÁCH DÒNG D. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ COSMID
VECTO TÁCH DÒNG E. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ CÁC NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠO  NHIỄM SẮC THỂ NẤM MEN NHÂN TẠO (YAC) Để có thể tách dòng các phân đoạn gen kích thước lớn ở sinh vật nhân chuẩn có kích thước > 35-45 kb (vd. gen dystrophin ở người có kích thước đến 2000kb), các nhà nghiên cứu đã phát triển được véctơ nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo có thể mang các đoạn cài ADN dài từ 200 đến 500 kb. Véctơ này được tạo ra từ nhiễm sắc thể nhỏ của nấm men được cải tiến di truyền
E. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ CÁC NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠO  NHIỄM SẮC THỂ VI KHUẨN NHÂN TẠO (BAC) Vector BAC cho phép cài gắn đoạn DNA có kích thước 100- 300kb Được thiết kế từ một phân DNA của bộ gen vi khuẩn Cấu trúc Vector BAC gồm các đoạn Ori (origin reolication), các gen chỉ thị đặc hiệu, các đoạn đa cắt nối và promoter đặc hiệu VECTO TÁCH DÒNG
TÁCH DÒNG GENE TÁCH DÒNG IN VITRO TÁCH DÒNG IN SILLICO CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN TÁCH DÒNG GEN TỪ DNA TÁC DÒNG GEN TỪ mRNA
TÁCH DÒNG GENE CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN 1. Tách dòng gen in vitro Tách dòng in vitro hay tách dòng thực nghiệm là tách dòng gen được thực hiện các mẫu sinh học (mô tếvào, lông tóc, dịch sinh học…), mang các gen cần tách dòng hoặc tổng hợp nhân tạo đoạn gen cần tách dòng
CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN TÁCH DÒNG GENE TÁCH DÒNG GEN TỪ DNA Chuân bị gen cần tách dòng (gen cần thiết, gen đích - target gene) và chọn vectơtách dòng. Tạo vectơ tái tổ hợp. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ. Sàng lọc các dòng tái tổhợp Nuôi cấy dòng tái tổhợp thu sinh khối và protein tái tổhợp TÁCH DÒNG GEN TỪ mARN Tách chiết mRNA Tổng hợp cDNA mạch kép. Gắn cDNA mạch kép với các vectơ tách dòng thích hợp, hình thành các vectơ tái tổ hợp. Biến nạp vào tế bào chủ, sau đó sàng lọc các tế bào mang vectơ tái tổ hợp và cấy truyền vào các ống thạch nghiêng tạo nên các dòng khác nhau đuợc tách dòng từ mRNA
TÁCH DÒNG GENE CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN
TÁCH DÒNG GENE CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN 2. Tách dòng gen in sillico Tách dòng in silico hay tách dòng ảo (cloning in silico) là sự tổng hợp, phân tích các kết quả tách dòng gen in vitro, trên cơ sở thông tin từ các ngân hàng dữ liệu (STS, EST…) để lựa chọn một đoạn DNA hoặc một gen cần thiết nào đó. Kết quả tách dòng in silico cho phép lựa chọn phương án thiết kế vectơ tái tổ hợp có hiệu quả, dự toán trước kết quả tách dòng và hiệu quả biểu hiện gen cũng như mức độthành công của thực nghiệm.
 Cảm ơn quý thầy cô và các bạn đã lắng nghe !

More Related Content

Tách dòng gene

  • 1. GVHD :Th.s NGUYỄN PHƯƠNG HOA HVTH : Viện đại học Mở Hà Nội Khoa sau Đại học
  • 2. ĐỊNH NGHĨA Tách dòng gen là tập hợp các kỹ thuật nhằm đưa một gen, một đoạn DNA cần thiết (DNA ensert) vào tế bào chủ (host cell), tạo điều kiện tích hợp để các tế bào chủ phân chia, tạo nên vô số các tế bào cùng mang một đoạn DNA insert giống nhau, tạo nên một dòng tế bào tái tổ hợp mang gen cần tách dòng. TÁCH DÒNG GENE Figure : Cloning a gene using a plasmid. (1) Chromosomal DNA of organism A. (2) PCR. (3) Multiple copies of a single gene from organism A. (4) Insertion of the gene into a plasmid. (5) Plasmid with gene from organism A. (6) Insertion of the plasmid in organism B. (7) Multiplication or expression of the gene, originally from organism A, occurring in organism B.
  • 3. ĐỊNH NGHĨA Vector tách dòng (vector cloning) là một phân tử DNA có kích thước nhỏ cho phép cài gắn một đoạn DNA ngoại lai vào nhằm mục đích nhân đoạn DNA ngoại lai lên với số lượng lớn. Các loại vectơ tách dòng thường dùng: Plasmid, Cosmid, Phage, Phagemid, BAC (Bacterium artificial chromosomes), YAC (yeast artificial chromosomes)… VECTO TÁCH DÒNG Hình 2: Plasmid pGEX-3x là một vector tách dòng phổ biến.
  • 4. ĐẶC ĐIỂM  Có khả cài gắn các đoạn DNA ngoại lai  Phải có trình tự khởi đầu sao chép để có khả năng tự sao chép trong tế bào chủ.  Có kích thước nhỏ để xâm nhập tế bào chủ  Có thể tái bản độc lập không phụ thuộc vào bộ gen của tế bào chủ.  Có chứa các gen chỉ thị, chọn lọc (gen kháng kháng sinh, gen chỉ thị màu...) VECTO TÁCH DÒNG
  • 5. A. Vector tách dòng là Plasmid  Kích thước 1 –5kb, sợi xoắn kép dạngvòng, trong tế bào chất của tế bàovi khuẩn hoặc tế bào nấm men  pBR332 do Bolivar và Rodiguez (1977) thiết kế, có 21 điểm cắt cho các enzym giới hạn, cho phép mang đoạn ADN cài đến 5 kb. VECTO TÁCH DÒNG
  • 6. A. Vector tách dòng là Plasmid Nhiều loại Plasmid nhân tạo ( thế hệ 2 và 3) được tạo nên bằng cách tập hợp các đặc tính quý của plasmid tự nhiên, gắn thêm các gen chỉ thị và đoạn đa cắt nối tạo nên plasmid mạnh. VECTO TÁCH DÒNG Hình : Plasmid thế hệ 2 điển hình pUC18
  • 7. A. Vector tách dòng là Plasmid Ưu điểm - Cấu trúc đơn giản, kích thước nhỏ. - Dễ tinh sạch, dễ phân tích đoạn tái tổ hợp. - Có thể nhân lên với số lượng lớn, tốc độ nhanh. Nhược điểm - Đôi khi, hiệu suất biến nạp vào tế bào chủ thấp. - Không hiệu quả khi biến nạp ở eukaryote. - Không tách dòng được các phân đoạn ADN kích thước lớn (> 10 kb VECTO TÁCH DÒNG
  • 8. B. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ PHAGE Kích thước : 15- 25kb Phage bao gồm nhiều loại thức khuẩn có bộ gen DNA mạch đơn hoặc kép sử dụng làm vector tách dòng có nhiều loại: f1, M13, fd… các vector này được tạo nên từ sự cải biến bộ gen phage. VECTO TÁCH DÒNG
  • 9. B. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ PHAGE Ưu điểm: -Khả năng xâm nhập tế bào chủ nhanh. Có thể tách dòng ở cả prokaryote và eukaryote. - Có thể mang các đoạn cài đến ~ 20 kb. -Dễ bảo quản do các hạt virut bền ở to lạnh (vd. 4oC). Nhược điểm: - Kích thước lớn hơn plasmid, nên phân tích phức tạp hơn. - Số bản sao phage hình thành trong mỗi tế bào thấp hơn số bản sao của plasmid. VECTO TÁCH DÒNG
  • 10. C. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ PHAGEMID Mang được đoạn AND cài 20-10kb Cấu tạo gồm 1 số gen của plasmid ( gen chỉ thị..) và một phần gen của phage ( đoạn ori, các gen cần thiết cho sự đóng gói) VD: Vector pEMBL8 cấu tạo từ 1 đoạn của phage M13 mang đoạn gen chỉ thị kháng sinh Amp và LacZ từ plasmid VECTO TÁCH DÒNG
  • 11. D. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ COSMID - Là véctơ lai của plasmid và và đoạn cos của phage, mang các ưu điểm của hai véctơ này: (1) khả năng tự tái bản số lượng lớn của plasmid, (2) có khả năng đóng gói in-vitro như phage - Có khả năng mang các đoạn ADN cài có kích thước đến 30 – 50 kb. VECTO TÁCH DÒNG
  • 12. VECTO TÁCH DÒNG D. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ COSMID
  • 13. VECTO TÁCH DÒNG E. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ CÁC NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠO  NHIỄM SẮC THỂ NẤM MEN NHÂN TẠO (YAC) Để có thể tách dòng các phân đoạn gen kích thước lớn ở sinh vật nhân chuẩn có kích thước > 35-45 kb (vd. gen dystrophin ở người có kích thước đến 2000kb), các nhà nghiên cứu đã phát triển được véctơ nhiễm sắc thể nấm men nhân tạo có thể mang các đoạn cài ADN dài từ 200 đến 500 kb. Véctơ này được tạo ra từ nhiễm sắc thể nhỏ của nấm men được cải tiến di truyền
  • 14. E. VECTOR TÁCH DÒNG LÀ CÁC NHIỄM SẮC THỂ NHÂN TẠO  NHIỄM SẮC THỂ VI KHUẨN NHÂN TẠO (BAC) Vector BAC cho phép cài gắn đoạn DNA có kích thước 100- 300kb Được thiết kế từ một phân DNA của bộ gen vi khuẩn Cấu trúc Vector BAC gồm các đoạn Ori (origin reolication), các gen chỉ thị đặc hiệu, các đoạn đa cắt nối và promoter đặc hiệu VECTO TÁCH DÒNG
  • 15. TÁCH DÒNG GENE TÁCH DÒNG IN VITRO TÁCH DÒNG IN SILLICO CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN TÁCH DÒNG GEN TỪ DNA TÁC DÒNG GEN TỪ mRNA
  • 16. TÁCH DÒNG GENE CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN 1. Tách dòng gen in vitro Tách dòng in vitro hay tách dòng thực nghiệm là tách dòng gen được thực hiện các mẫu sinh học (mô tếvào, lông tóc, dịch sinh học…), mang các gen cần tách dòng hoặc tổng hợp nhân tạo đoạn gen cần tách dòng
  • 17. CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN TÁCH DÒNG GENE TÁCH DÒNG GEN TỪ DNA Chuân bị gen cần tách dòng (gen cần thiết, gen đích - target gene) và chọn vectơtách dòng. Tạo vectơ tái tổ hợp. Biến nạp vectơ tái tổ hợp vào tế bào chủ. Sàng lọc các dòng tái tổhợp Nuôi cấy dòng tái tổhợp thu sinh khối và protein tái tổhợp TÁCH DÒNG GEN TỪ mARN Tách chiết mRNA Tổng hợp cDNA mạch kép. Gắn cDNA mạch kép với các vectơ tách dòng thích hợp, hình thành các vectơ tái tổ hợp. Biến nạp vào tế bào chủ, sau đó sàng lọc các tế bào mang vectơ tái tổ hợp và cấy truyền vào các ống thạch nghiêng tạo nên các dòng khác nhau đuợc tách dòng từ mRNA
  • 18. TÁCH DÒNG GENE CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN
  • 19. TÁCH DÒNG GENE CÁC PHƯƠNG PHÁP TÁCH DÒNG GEN 2. Tách dòng gen in sillico Tách dòng in silico hay tách dòng ảo (cloning in silico) là sự tổng hợp, phân tích các kết quả tách dòng gen in vitro, trên cơ sở thông tin từ các ngân hàng dữ liệu (STS, EST…) để lựa chọn một đoạn DNA hoặc một gen cần thiết nào đó. Kết quả tách dòng in silico cho phép lựa chọn phương án thiết kế vectơ tái tổ hợp có hiệu quả, dự toán trước kết quả tách dòng và hiệu quả biểu hiện gen cũng như mức độthành công của thực nghiệm.
  • 20.  Cảm ơn quý thầy cô và các bạn đã lắng nghe !

Editor's Notes

  1. DNA tái tổ hợp được chế tác với mục đích là để thực hiện một quá trình gọi là sự tách dòng. Tách dòng là sự tách lập và thu nhận nhiều bản sao đồng nhất của một gen hay của một mảnh đoạn DNA. Tách dòng có thể được đi kèm hoặc không được đi kèm với sự biểu hiện protein. Những áp dụng này của DNA tái tổ hợp dùng để thiết lập các ngân hàng bộ gen, cDNA hoặc tổng hợp protein, enzyme, hormone, ...
  2. B1: Các bước thực hiện chủ yếu: tách chiết DNA bộ gen, nhân gen bằng PCR, sửdụng enzym giới hạn cắt thành các đoạn DNA nhỏ, điện di trên gel agar (hoặc gel polyacrylamid) với thang DNA chuẩn. Từkết quả điện di, dựa vào kích thước của gen cần tách dòng đểlựa chọn được đoạn DNA chứa gen cần tách dòng. Chọn vector tách dòng dựa vào mục đích và kích thước gen tách dòng. B2: