際際滷

際際滷Share a Scribd company logo

Teknologi Obat Injeksi Cair

Download as PPTX, PDF
Olivia Cesarah
Olivia Cesarah

Membuat rancangan pabrikasi untuk memproduksi Gen VEGF121 di Indonesia, sesuai dengan aturan yang berlaku di Indonesia, yang mana Gen VEGF121 berbentuk cairan injeksi dengan partikel pembawa yaitu adenovirus dan dengan eksipien yang telah ditentukan

1 of 38
Downloaded 57 times
OBAT JANTUNG DENGAN GEN VEGF121 GROUP 3 P E M I C U 2 Anggota: 1. Farha Kamila 2. Fildzah Khalisah A 3. Muslimah 4. Olivia Cesarah 5. Rahmalia Puspita
PENDAHULUAN LATAR BELAKANG Di Indonesia, pengobatan penyakit kelainan pembuluh darah jantung atau Iskemia Miokardium yaitu dengan operasi, intervensi gawat darurat, pengobatan berdasarkan penyebab utama dan juga terapi. Gen VEGF121 dinilai mampu digunakan dalam pengobatan penyakit Iskemia Miokardium. TUJUAN Membuat rancangan pabrikasi untuk memproduksi Gen VEGF121 di Indonesia, sesuai dengan aturan yang berlaku di Indonesia, yang mana Gen VEGF121 berbentuk cairan injeksi dengan partikel pembawa yaitu adenovirus dan dengan eksipien yang telah ditentukan University of Indonesia
LAYOUT PABRIK University of Indonesia
University of Indonesia PREPARASI GEN REKOMBINAN AD/PEG/VEGF121
Vektor Adenovirus Dapat digunakan vektor Adenovirus dengan ligan ataupun tanpa ligan. Penggunaan adenovirus dengan ligan akan mempermudah pengenalan pada permukaan sel target dan meningkatkan afinitas pengikatannya pada sel targer Gambar 1. Struktur Adenovirus a. Tanpa ligan, b. Dengan ligan (Sumber: Curtis A Machida (2003)) University of Indonesia
Preparasi Rekombinasi Gen VEGF121 dengan Vektor Adenovirus Larutan dan bahan-bahan yang digunakan: 1. 130 mM sodium phosphate, pH 7.0, steril. 2. 5% sukrosa steril. 3. Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.0, steril. 4. 0.5 M Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA), steril. 5. Galacto-Star 硫-galactosidase detection kid (Tropix/Applied Biosystems, Foster City, CA). 6. Dithiothreitol (DTT) (Boehringer- Mannheim Roche Diagnostics). 7. BCA assay reagents (Pierce, Rockford, IL). 8. Tresyl-MPEG-maleimide PEG, MW 5000 (Shearwater Polymers, Huntsville, AL). 9. VEGF121 10.Trauts reagent, 2-iminothiolane (Pierce): disimpan pada ruang gelap dengan suhu 40C. Stabil selama 4 minggu setelah dibuka. Larutan dan bahan-bahan yang digunakan: 11. OPD peroxidase substrate (Sigma, St. Louis, MO cat. no. P9187): dilarutkan dalam 20mL air. 12. PD-10 (Sephadex G-25 M) column (Pharmacia, Piscataway, NJ). 13. Thiol & Sulfide quantitation kit (Molecular Probes, Eugene, OR, cat. no. T-6060). 14. 際際滷-a-lyzer cassette, 10,000MW (Pierce). 15. Fractogel BioSec size exclusion resin (EM Sciences, Gibbstown, NJ) 150 mL (2.630 cm) in a XK 26/60 column (Pharmacia). 16. Fractogel DEAE resin, 4090袖m (EM Sciences). 17. Superdex 200 16/60 column (Pharmacia). 18. Ad2/CMV硫-gal 4 virus in PBS pH 7.0, 5% sucrose. Merupakan Adenovirus serotip 2 yaitu vektir adenovirus yang sudah dihilangkan area E1 nyadan digantikan dengan 硫-galactosidase trasgen, dan masih mengandung area E4. University of Indonesia
Sel dan Media yang digunakan: 1. Media F-12K Kaighn yang sudah dimodifikasi (Invitrogen, Carlsbad, CA). 2. Fetal bovine serum (FBS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS). 3. Penicillin G sodium (Invitrogen). 4. Streptomycin sulfate (Invitrogen). 5. 293 sel ginjal embrio manusia. Preparasi Rekombinasi Gen VEGF121 dengan Vektor Adenovirus Taqman Reagens: 1. Zirconia beads (Biospec Products, Bartlesville, OK): diautoklave di gelas vial ukuran kecil. 2. DNA lysis buffer: 100 mM pH 8.0 Tris HCl, 5 mM EDTA, 0.4% sodium dodecyl sulfate, 200 mMNaCl. 3. 2-mL sterile screw cap tubes (Axygen, Union City, CA). 4. DEPC water (water treated with diethylpyrocarbonate to eliminate RNase/DNase). 5. Primers and probe (IDT, Coralville, IA) University of Indonesia
Metode Rekombinasi gen VEGF121 dengan vektor Adenovirus Penentuan konsentrasi partikel virus (Maizel et al. 1968 (Ref.62)) Preparasi Ad/PEG Kompleks. Menghilangkan ikatan TMPEG dan purifikasi Ad/PEG dengan Size Exclution Chromatography Generation of an Ad/PEG/VEGF121Co njugate Purifikasi Ad/PEG/VEGF121 dengan Ion Exchange Chromatography Kultur rekombinan Ad/PEG/VEGF121 University of Indonesia
Penentuan konsentrasi partikel virus (Maizel et al. 1968 (Ref.62)) 1. Memasukkan 1亮L 10% SDS ke dalam 100亮L virus. Tahap ini akan membuat DNA virus keluar dari kapsidnya. 2. Menyiapkan sample dengan jumlah yang setara dalam PBS 5% sucrose sebagai blank. 3. Inkubasi dalam suhu ruang selama 30 menit. 4. Vortex. 5. Melakukan spektroskopi pada panjang gelombang absorbansi A260, gunakan koefisien kematian partikel 1 O.D. = 1,1 1012partikel/mL. 6. 1M larutan akan mengandung 6,02 1023 partikel/L. Preparasi Ad/PEG Kompleks. 1. Mencairkan Ad2/CMV硫-gal4 vektor murni (1x1012 partikel/mL dalam PBS yang mengandung 5% sukrosa), 1:1 (vol:vol) dengan 130 mM sodium phosphate pH 7,0, 5% sukrosa. 2. Memasukkan 1.0, 5.0, atau 10% (wt/vol) tambahan Tresyl-MPEG-maleimide (TMPEG- mal) dalam larutan virus. Untuk 10% reaksi TMPEG tambahkan 5% TMPEG kembali pada setiap selang waktu 30 menit. Langkah ini bertujuan untuk mempresipitasi virus. 3. Inkubasi campuran pada suhu ruang, untuk setiap 1% reaksi PEGylation inkubasi selama 45 menit, 5% PEGylation selama 30 menit dan 10% TMPEG, penambahan 2 x 5% TMPEG setiap 30 menit. 4. Letakkan campuran dalam bak es untuk menghentikan reaksi. Tresyl group pada TMPEG tidak akan bereaksi pada suhu dibawah 40C. University of Indonesia
Menghilangkan ikatan TMPEG dan purifikasi Ad/PEG dengan Size Exclution Chromatography 1. Menyeimbangkan 150mL BioSec resin (2.6 30 cm) dengan PBS, pH 7,0 pada laju alir 2,0 mL/min, sebelum sample dialirkan. 2. Injeksikan sample ke dalam kolom. Volume sample tidak lebih dari 4.0 mL untuk hasil separasi yang baik. 3. Pantau pada panjang gelombang A260/A280 4. Tambahkan sukrosa untuk mencampai konsentrasi akhir 5%. 1. Asumsikan 1000PEG/virion untuk 1% Ad/PEG, [PEG] = 1000 x[virus], dengan kalkulasi molekular. 2. Dialisis VEGF121 dengan 際際滷-A- Lyzer cassette secara berlawanan dengan menggunakan 0,1 M sodium phosphate, 0,1M sodium chlorida, 1mM EDTA, pada pH7,5. 3. Menambahkan 1000 molar berlebih VEGF121 kemudian diinkubasi selama 6 jam pada suhu 40C. Generation of an Ad/PEG/VEGF121Conjugate University of Indonesia
Purifikasi Ad/PEG/VEGF121 dengan Ion Exchange Chromatography 1. Menyiapkan 10 mL Fractogel DEAE dalam kolom XK16/60. 2. Menyiapkan DEAE Buffer A: 10mM potasium phosphate, pH 7,5 (1M = 15 gram dibasic, 2 gram monobasic per 1L) yang mengandung 0,15M NaCl, 0,01% Tween-80 (sterile fi ltered). 3. Menyiapkan DEAE Buffer B: 10mM potasium chloride, pH 7,5 yang mengandunga 1M KCl, 1M NaCl, 0,01% Tween-80 (sterile fi ltered). 4. Menyeimbangkan DEAE resin dengan buffer A 2mL/min. 5. Setelah mengalirkan sampel, cuci kolom dengan 1CV buffer A. 6. Gradien dinaikkan untuk 2CV adalah 12.5% buffer B dan 100% buffer B untuk diatas 4CV. 7. Ad/PEG/VEGF121 akan diilusi engan 25% buffer B, setara dengan 0,5M garam. 8. Monitor kolom pada panjang gelombang A260/A280. 9. Terakhir tambahakan 50% sukrosa untuk memperoleh konsentrasi akhir dari fraksi hasil pemisahan sebesar 5%. 1. Ad/PEG/VEGF121 dikultur dalam 293 sel (sel ginjal embrio manusia), dengan penambahan medium nutrisi. 2. Kemudian dimurnikan dengan CsCl berdasarkan prinsip gradien densitas. 3. Kemudian didialisis. 4. Lalu disimpan pada suhu -700C. 5. Tepat sebelum digunakan, vektor itu dicairkan atau diencerkan dalam larutan sukrosa 3%. Kultur rekombinan Ad/PEG/VEGF121 University of Indonesia
University of Indonesia TAHAP PENCAMPURAN
didefinisikan sebagai proses di mana dua atau lebih komponen dalam kondisi campuran terpisah atau kasar diperlakukan sedemikian rupa sehingga setiap partikel dari salah satu bahan terletak sedekat mungkin dengan partikel bahan atau komponen lain University of Indonesia
Tujuan pencampuran: Untuk memastikan bahwa ada keseragaman bentuk Untuk memulai atau meningkatkan reaksi fisika atau kimia seperti difusi, disolusi, dll untuk memperoleh jenis produk berikut. Ketika dua atau lebih cairan misibel dicampur bersama-sama, hasilnya dikenal sebagai larutan nyata. Ketika dua cairan imisibel dicampur dengan agen pengemulsi, hasilnya dikenal sebagai emulsi. Ketika padatan dilarutkan dalam suatu pembawa, hasilnya dikenal sebagai larutan. Ketika padat tidak larut dilarutkan dalam suatu pembawa, hasilnya dikenal sebagai suspensi. Ketika padatan atau cairan dicampur dengan basis semi padat, hasilnya dikenal sebagai salep atau supositoria. Ketika dua atau lebih bahan padat bersama, diperoleh serbuk yang bila diisi ke dalam kapsul dikenal sebagai kapsul dan ketika dikompresi di bawah tekanan tinggi disebut tablet University of Indonesia
Klasifikasi Campuran Positif dua atau lebih gas atau cairan misibel dicampur bersama-sama melalui proses difusi Jenis bahan ini tidak memberikan masalah dalam pencampuran Negatif ketika padatan tidak terlarut dicampur dengan pembawa untuk membentuk suspensi atau ketika dua cairan tidak saling larut yang dicampur untuk membentuk emulsi lebih sulit disiapkan dan memerlukan tingkat pencampuran yang lebih tinggi Netral Banyak produk farmasi seperti pasta, salep, dan serbuk tercampur Produk tersebut statis dan komponennya tidak memiliki kecenderungan bercampur secara spontan University of Indonesia
Mekanisme campuran Convective mixing Shear mixing Diffusive mixing perpindahan sekelompok partikel dalam jumlah besar terjadi dari satu bagian powder bed ke bagian yang lain gaya geser terbentuk dalam massa bahan dengan menggunakan agitator arm atau blast of air. bahan-bahan miring sehingga gaya gravitasi menyebabkan lapisan atas tergelincir dan difusi partikel individu berlangsung di atas permukaan yang baru dikembangkan University of Indonesia
Mixing Guidelines Gunakan waktu yang cukup dalam pencampuran untuk memastikan bahwa polimer benar-benar terhidrasi sebelum menambahkan komponen formulasi tambahan. Pencampuran yang berlebihan atau tidak tepat selama dispersi dapat menyebabkan udara terperangkap, variasi viskositas, dan/atau ketidakstabilan formulasi. Udara terperangkap dapat diminimalkan dengan menggunakan variable drive motor. Setelah polimer terdispersi, udara terperangkap dapat diminimalkan dengan reposisi impeller dan mengurangi kecepatan pencampuran. Biarkan dispersi asam untuk melepaskan gelembung udara terperangkap. Dianjurkan melakukan pengadukan sedang. University of Indonesia
Cont Setiap pencampuran intensitas tinggi yang diperlukan harus diselesaikan sebelum netralisasi. Hindari pencampuran high shear dengan Waring blender atau rotor-stator homogenizers. Pencampuran seperti itu dapat menggeser polimer dan menghasilkan kehilangan fungsionalitas permanen. Jika busa persisten dihasilkan, busa tersebut dapat hilang dengan merusak polimer secara parsial dengan penambahan asam dengan kadar yang sangat rendah sebelum menetralisir dispersi dengan basis yang cocok. Asam klorida atau fosfat memiliki efektivitas sebesar 0,5% dari berat polimer yang digunakan. University of Indonesia
Efektifitas penghomogenannya bisa berlainan tergantung dari jenis alat yang digunakan. Pengaduk (Mixer) Jenis pengaduk ini bermacam ragamnya tergantung dari banyak volume cairan, kekentalan dsb. Alat ini mempunyai sifat menghomogenkan dan sekaligus memperkecil ukuran partikel walaupun efek menghomogenkan cairan lebih dominan. Homogenizer Alat ini mempunyai karakteristik memperkecil ukuran partikel Pengecilan partikel terjadi karena cara kerja alat ini yaitu dengan menekan cairan, dipaksa melalui celah yang sempit kemudian dibenturkan ke suatu dinding atau ditumbukkan pada peniti-peniti metal yang ada dalam celah tersebut. Cara sangat sensititf sehingga bisa didapat diameter pertikel rata-rata kurang dari 1 mikron. University of Indonesia
University of Indonesia FILLING & SEALING
Filling dan Sealing dengan Filler/Stopper Machine for Vials Digunakan untuk pengisisan, pemasangan sumbat, dan crimp capping. Pengisian berlangsung otomatis sesuai volum yang sudah ditentukan. Setelah dilakukan pengisisan selanjutnya dilakukan pemasangan sumbat dan crimp capping. University of Indonesia
University of Indonesia STERILISASI
Sterilisasi Metode pembuatan sediaan injeksi terdapat dua cara, yaitu cara aseptik dan sterilisasi akhir. Proses aseptis dilakukan apabila bahan-bahan yang digunakan tidak tahan terhadap pemanasan. Teknik aseptik sediaan injeksi yang berbahan gen VEGF121 University of Indonesia
Sterilisasi vial Seluruh peralatan dan material tahan panas disterilisasi dengan pemanasan. Sterilisasi autoklaf suhu 230 0C selama satu jam mampu membunuh secara cepat semua bentuk vegetatif mikroorganisme dalam 1 atau 2 menit University of Indonesia
University of Indonesia QUALITY CONTROL
University of Indonesia INCOMING STOCK Routine Work Testing MANUFACTURING Conductivity Measurement Volume Filled Temperature of Sterility Environmental Control Test Visual Inspection FINISHED PRODUC T Leaker Test Pyrogen Test Particulate Test Sterility Test Uniformity of Content
LEAKER TEST Filled and Sealed Ampoules ditaruh dalam ruang vakum Dicelupkan pada larutan 1% Methylene Blue Diberikan negative pressure Jika terjadi kebocoran, warna biru akan masuk karena perbedaan tekanan University of Indonesia Leakage (kebocoran) adalah hal yang sering terjadi dalam proses manufaktur kemasan obat Dikarenakan perbedaan temperatur dan tekanan di tiap unit atau ruangan, maka kemasan mengekspansi Test dilakukan pada ampoules, karena bahannya dari kaca
PYROGEN TEST PYROGEN TEST LAL Test Rabbit Test University of Indonesia
LAL BACTERIAL TEST (Limulus Amebocyte Lysate Test) Test yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan dan konsentrasi endotoksin bakteri dalam obat-obatan dan produk yang berkonsep biologi. Endotoksin adalah sejenis pyrogen yang keberadaannya ada pada dinding sel dari bakteri negative. LAL Test yang dilakukan berbentuk gel formation test. reagen LAL yaitu Limulus Polyphemus pada inkubasi selama 60 menit pada 37 derajat celcius. tes ini adalah hanya dapat mendekteksi bakteri gram negative dan tidak dapat mengukur tingkat endotoksinnya (tes semi-kualitatif). University of Indonesia
RABBIT TEST Mempunyai objek percobaan kelinci Produk manufaktur obat dicobakan pada sekelompok kelinci (5-10 ekor) Prosedur tes sebagai berikut: 1. Pada sekelompok kelinci yang akan dicobakan, tidak boleh diberikan makanan pada hari percobaan 2. Kelinci-kelinci diukur temperature nya sebelum percobaan, dicatat. 3. Obat yang ingin diujikan disuntikkan pada pembuluh dekat telinga. 4. Melakukan pengamatan reaksi obat terhadap kelinci setiap 30 menit, 1 jam, 2 jam, dan 3 jam. 5. Jika ternyata memang ada kandungan bakteri di obat tersebut, dimana terjadi kenaikan temperature pada kelinci tersebut. 6. Jika kondisi dari kelinci 80% mengalami kenaikan temperature pada tubuhnya, dapat dipastikan ada kontaminasi bakteri dalam obat University of Indonesia
PARTICULATE TEST Tes ini dilakukan untuk mendeteksi adanya partikel lain dengan metode pencahayaan yang sangat terang dengan background hitam putih Jika adanya partikel lain, maka produk harus dibuang Dapat dilakukan oleh human resources maupun device University of Indonesia
STERILITY TEST Tujuan untuk mendeteksi adanya kontaminasi bakteri pada batch proses sebuah manufaktur Metode dibagi menjadi 2 cara: Membrane Filtration Method Menggunakan media yaitu fluid thioglycollate medium dan soya-bean casein digest medium. Direct Menoculation Method Karena mikroorganismenya tidak dapat tersaring, maka samoel langsung dideteksi melalui media atau device Dapat dilakukan secara product sampling atau keseluruhan manufaktur University of Indonesia
University of Indonesia PACKAGING & LABELING
PACKAGING DAN LABELING Packaging & Labeling Primer Sekunder Tersier Packaging primer injeksi cair yang dipiilih berbentuk VIALS Berbahan dasar kaca dan penggunaannya harus diambil menggunakan syringe yang akan disuntikkan University of Indonesia
PACKAGING DAN LABELING Primer Packaging primer berbentuk ampoules yang telah diisi pada proses filling Proses primer labeling dilakukan pada ampoules oleh unit operasi Shrink Labeler atau Ampoule Labeler Sekunder Pemprosesan packaging sekunder lebih dikenal dengan nama pengepakan. Digunakan packaging boks-boks karton Digunakan mesin blister atau cartoning machine (mesin pengepakan otomatis). Mesin jenis ini bisa sekalian melakukan proses labeling. Labeling yang dilakukan biasanya nama, tanggal dan kode produksi , dll University of Indonesia
PACKAGING DAN LABELING Tersier Digunakan unit operasi Cardboard Case Packager Penting untuk melindungi produk obat pada saat pengiriman jarak jauh. Pengemasan tersier ke dalam kardus dilakukan secara manual. University of Indonesia
KESIMPULAN Secara garis besar, tahapan tahapan pembuatan obat terapi gen VEGF121 ini adalah persiapan mixing sterilisasi filling/sealing inspeksi labeling dan packaging. Untuk sterilisasi bahan gen VEGF121 menggunakan proses aseptic. Untuk sterilisasi wadah menggunakan autoklaf. Kemasan yang digunakan adalah VIALS. University of Indonesia
THANK YOU ! F O R Y O U R AT T E N T I O N GROUP 3 P e m i c u 2

More Related Content

Teknologi Obat Injeksi Cair

  • 1. OBAT JANTUNG DENGAN GEN VEGF121 GROUP 3 P E M I C U 2 Anggota: 1. Farha Kamila 2. Fildzah Khalisah A 3. Muslimah 4. Olivia Cesarah 5. Rahmalia Puspita
  • 2. PENDAHULUAN LATAR BELAKANG Di Indonesia, pengobatan penyakit kelainan pembuluh darah jantung atau Iskemia Miokardium yaitu dengan operasi, intervensi gawat darurat, pengobatan berdasarkan penyebab utama dan juga terapi. Gen VEGF121 dinilai mampu digunakan dalam pengobatan penyakit Iskemia Miokardium. TUJUAN Membuat rancangan pabrikasi untuk memproduksi Gen VEGF121 di Indonesia, sesuai dengan aturan yang berlaku di Indonesia, yang mana Gen VEGF121 berbentuk cairan injeksi dengan partikel pembawa yaitu adenovirus dan dengan eksipien yang telah ditentukan University of Indonesia
  • 4. University of Indonesia PREPARASI GEN REKOMBINAN AD/PEG/VEGF121
  • 5. Vektor Adenovirus Dapat digunakan vektor Adenovirus dengan ligan ataupun tanpa ligan. Penggunaan adenovirus dengan ligan akan mempermudah pengenalan pada permukaan sel target dan meningkatkan afinitas pengikatannya pada sel targer Gambar 1. Struktur Adenovirus a. Tanpa ligan, b. Dengan ligan (Sumber: Curtis A Machida (2003)) University of Indonesia
  • 6. Preparasi Rekombinasi Gen VEGF121 dengan Vektor Adenovirus Larutan dan bahan-bahan yang digunakan: 1. 130 mM sodium phosphate, pH 7.0, steril. 2. 5% sukrosa steril. 3. Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.0, steril. 4. 0.5 M Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA), steril. 5. Galacto-Star 硫-galactosidase detection kid (Tropix/Applied Biosystems, Foster City, CA). 6. Dithiothreitol (DTT) (Boehringer- Mannheim Roche Diagnostics). 7. BCA assay reagents (Pierce, Rockford, IL). 8. Tresyl-MPEG-maleimide PEG, MW 5000 (Shearwater Polymers, Huntsville, AL). 9. VEGF121 10.Trauts reagent, 2-iminothiolane (Pierce): disimpan pada ruang gelap dengan suhu 40C. Stabil selama 4 minggu setelah dibuka. Larutan dan bahan-bahan yang digunakan: 11. OPD peroxidase substrate (Sigma, St. Louis, MO cat. no. P9187): dilarutkan dalam 20mL air. 12. PD-10 (Sephadex G-25 M) column (Pharmacia, Piscataway, NJ). 13. Thiol & Sulfide quantitation kit (Molecular Probes, Eugene, OR, cat. no. T-6060). 14. 際際滷-a-lyzer cassette, 10,000MW (Pierce). 15. Fractogel BioSec size exclusion resin (EM Sciences, Gibbstown, NJ) 150 mL (2.630 cm) in a XK 26/60 column (Pharmacia). 16. Fractogel DEAE resin, 4090袖m (EM Sciences). 17. Superdex 200 16/60 column (Pharmacia). 18. Ad2/CMV硫-gal 4 virus in PBS pH 7.0, 5% sucrose. Merupakan Adenovirus serotip 2 yaitu vektir adenovirus yang sudah dihilangkan area E1 nyadan digantikan dengan 硫-galactosidase trasgen, dan masih mengandung area E4. University of Indonesia
  • 7. Sel dan Media yang digunakan: 1. Media F-12K Kaighn yang sudah dimodifikasi (Invitrogen, Carlsbad, CA). 2. Fetal bovine serum (FBS) (JRH Biosciences, Lenexa, KS). 3. Penicillin G sodium (Invitrogen). 4. Streptomycin sulfate (Invitrogen). 5. 293 sel ginjal embrio manusia. Preparasi Rekombinasi Gen VEGF121 dengan Vektor Adenovirus Taqman Reagens: 1. Zirconia beads (Biospec Products, Bartlesville, OK): diautoklave di gelas vial ukuran kecil. 2. DNA lysis buffer: 100 mM pH 8.0 Tris HCl, 5 mM EDTA, 0.4% sodium dodecyl sulfate, 200 mMNaCl. 3. 2-mL sterile screw cap tubes (Axygen, Union City, CA). 4. DEPC water (water treated with diethylpyrocarbonate to eliminate RNase/DNase). 5. Primers and probe (IDT, Coralville, IA) University of Indonesia
  • 8. Metode Rekombinasi gen VEGF121 dengan vektor Adenovirus Penentuan konsentrasi partikel virus (Maizel et al. 1968 (Ref.62)) Preparasi Ad/PEG Kompleks. Menghilangkan ikatan TMPEG dan purifikasi Ad/PEG dengan Size Exclution Chromatography Generation of an Ad/PEG/VEGF121Co njugate Purifikasi Ad/PEG/VEGF121 dengan Ion Exchange Chromatography Kultur rekombinan Ad/PEG/VEGF121 University of Indonesia
  • 9. Penentuan konsentrasi partikel virus (Maizel et al. 1968 (Ref.62)) 1. Memasukkan 1亮L 10% SDS ke dalam 100亮L virus. Tahap ini akan membuat DNA virus keluar dari kapsidnya. 2. Menyiapkan sample dengan jumlah yang setara dalam PBS 5% sucrose sebagai blank. 3. Inkubasi dalam suhu ruang selama 30 menit. 4. Vortex. 5. Melakukan spektroskopi pada panjang gelombang absorbansi A260, gunakan koefisien kematian partikel 1 O.D. = 1,1 1012partikel/mL. 6. 1M larutan akan mengandung 6,02 1023 partikel/L. Preparasi Ad/PEG Kompleks. 1. Mencairkan Ad2/CMV硫-gal4 vektor murni (1x1012 partikel/mL dalam PBS yang mengandung 5% sukrosa), 1:1 (vol:vol) dengan 130 mM sodium phosphate pH 7,0, 5% sukrosa. 2. Memasukkan 1.0, 5.0, atau 10% (wt/vol) tambahan Tresyl-MPEG-maleimide (TMPEG- mal) dalam larutan virus. Untuk 10% reaksi TMPEG tambahkan 5% TMPEG kembali pada setiap selang waktu 30 menit. Langkah ini bertujuan untuk mempresipitasi virus. 3. Inkubasi campuran pada suhu ruang, untuk setiap 1% reaksi PEGylation inkubasi selama 45 menit, 5% PEGylation selama 30 menit dan 10% TMPEG, penambahan 2 x 5% TMPEG setiap 30 menit. 4. Letakkan campuran dalam bak es untuk menghentikan reaksi. Tresyl group pada TMPEG tidak akan bereaksi pada suhu dibawah 40C. University of Indonesia
  • 10. Menghilangkan ikatan TMPEG dan purifikasi Ad/PEG dengan Size Exclution Chromatography 1. Menyeimbangkan 150mL BioSec resin (2.6 30 cm) dengan PBS, pH 7,0 pada laju alir 2,0 mL/min, sebelum sample dialirkan. 2. Injeksikan sample ke dalam kolom. Volume sample tidak lebih dari 4.0 mL untuk hasil separasi yang baik. 3. Pantau pada panjang gelombang A260/A280 4. Tambahkan sukrosa untuk mencampai konsentrasi akhir 5%. 1. Asumsikan 1000PEG/virion untuk 1% Ad/PEG, [PEG] = 1000 x[virus], dengan kalkulasi molekular. 2. Dialisis VEGF121 dengan 際際滷-A- Lyzer cassette secara berlawanan dengan menggunakan 0,1 M sodium phosphate, 0,1M sodium chlorida, 1mM EDTA, pada pH7,5. 3. Menambahkan 1000 molar berlebih VEGF121 kemudian diinkubasi selama 6 jam pada suhu 40C. Generation of an Ad/PEG/VEGF121Conjugate University of Indonesia
  • 11. Purifikasi Ad/PEG/VEGF121 dengan Ion Exchange Chromatography 1. Menyiapkan 10 mL Fractogel DEAE dalam kolom XK16/60. 2. Menyiapkan DEAE Buffer A: 10mM potasium phosphate, pH 7,5 (1M = 15 gram dibasic, 2 gram monobasic per 1L) yang mengandung 0,15M NaCl, 0,01% Tween-80 (sterile fi ltered). 3. Menyiapkan DEAE Buffer B: 10mM potasium chloride, pH 7,5 yang mengandunga 1M KCl, 1M NaCl, 0,01% Tween-80 (sterile fi ltered). 4. Menyeimbangkan DEAE resin dengan buffer A 2mL/min. 5. Setelah mengalirkan sampel, cuci kolom dengan 1CV buffer A. 6. Gradien dinaikkan untuk 2CV adalah 12.5% buffer B dan 100% buffer B untuk diatas 4CV. 7. Ad/PEG/VEGF121 akan diilusi engan 25% buffer B, setara dengan 0,5M garam. 8. Monitor kolom pada panjang gelombang A260/A280. 9. Terakhir tambahakan 50% sukrosa untuk memperoleh konsentrasi akhir dari fraksi hasil pemisahan sebesar 5%. 1. Ad/PEG/VEGF121 dikultur dalam 293 sel (sel ginjal embrio manusia), dengan penambahan medium nutrisi. 2. Kemudian dimurnikan dengan CsCl berdasarkan prinsip gradien densitas. 3. Kemudian didialisis. 4. Lalu disimpan pada suhu -700C. 5. Tepat sebelum digunakan, vektor itu dicairkan atau diencerkan dalam larutan sukrosa 3%. Kultur rekombinan Ad/PEG/VEGF121 University of Indonesia
  • 13. didefinisikan sebagai proses di mana dua atau lebih komponen dalam kondisi campuran terpisah atau kasar diperlakukan sedemikian rupa sehingga setiap partikel dari salah satu bahan terletak sedekat mungkin dengan partikel bahan atau komponen lain University of Indonesia
  • 14. Tujuan pencampuran: Untuk memastikan bahwa ada keseragaman bentuk Untuk memulai atau meningkatkan reaksi fisika atau kimia seperti difusi, disolusi, dll untuk memperoleh jenis produk berikut. Ketika dua atau lebih cairan misibel dicampur bersama-sama, hasilnya dikenal sebagai larutan nyata. Ketika dua cairan imisibel dicampur dengan agen pengemulsi, hasilnya dikenal sebagai emulsi. Ketika padatan dilarutkan dalam suatu pembawa, hasilnya dikenal sebagai larutan. Ketika padat tidak larut dilarutkan dalam suatu pembawa, hasilnya dikenal sebagai suspensi. Ketika padatan atau cairan dicampur dengan basis semi padat, hasilnya dikenal sebagai salep atau supositoria. Ketika dua atau lebih bahan padat bersama, diperoleh serbuk yang bila diisi ke dalam kapsul dikenal sebagai kapsul dan ketika dikompresi di bawah tekanan tinggi disebut tablet University of Indonesia
  • 15. Klasifikasi Campuran Positif dua atau lebih gas atau cairan misibel dicampur bersama-sama melalui proses difusi Jenis bahan ini tidak memberikan masalah dalam pencampuran Negatif ketika padatan tidak terlarut dicampur dengan pembawa untuk membentuk suspensi atau ketika dua cairan tidak saling larut yang dicampur untuk membentuk emulsi lebih sulit disiapkan dan memerlukan tingkat pencampuran yang lebih tinggi Netral Banyak produk farmasi seperti pasta, salep, dan serbuk tercampur Produk tersebut statis dan komponennya tidak memiliki kecenderungan bercampur secara spontan University of Indonesia
  • 16. Mekanisme campuran Convective mixing Shear mixing Diffusive mixing perpindahan sekelompok partikel dalam jumlah besar terjadi dari satu bagian powder bed ke bagian yang lain gaya geser terbentuk dalam massa bahan dengan menggunakan agitator arm atau blast of air. bahan-bahan miring sehingga gaya gravitasi menyebabkan lapisan atas tergelincir dan difusi partikel individu berlangsung di atas permukaan yang baru dikembangkan University of Indonesia
  • 17. Mixing Guidelines Gunakan waktu yang cukup dalam pencampuran untuk memastikan bahwa polimer benar-benar terhidrasi sebelum menambahkan komponen formulasi tambahan. Pencampuran yang berlebihan atau tidak tepat selama dispersi dapat menyebabkan udara terperangkap, variasi viskositas, dan/atau ketidakstabilan formulasi. Udara terperangkap dapat diminimalkan dengan menggunakan variable drive motor. Setelah polimer terdispersi, udara terperangkap dapat diminimalkan dengan reposisi impeller dan mengurangi kecepatan pencampuran. Biarkan dispersi asam untuk melepaskan gelembung udara terperangkap. Dianjurkan melakukan pengadukan sedang. University of Indonesia
  • 18. Cont Setiap pencampuran intensitas tinggi yang diperlukan harus diselesaikan sebelum netralisasi. Hindari pencampuran high shear dengan Waring blender atau rotor-stator homogenizers. Pencampuran seperti itu dapat menggeser polimer dan menghasilkan kehilangan fungsionalitas permanen. Jika busa persisten dihasilkan, busa tersebut dapat hilang dengan merusak polimer secara parsial dengan penambahan asam dengan kadar yang sangat rendah sebelum menetralisir dispersi dengan basis yang cocok. Asam klorida atau fosfat memiliki efektivitas sebesar 0,5% dari berat polimer yang digunakan. University of Indonesia
  • 19. Efektifitas penghomogenannya bisa berlainan tergantung dari jenis alat yang digunakan. Pengaduk (Mixer) Jenis pengaduk ini bermacam ragamnya tergantung dari banyak volume cairan, kekentalan dsb. Alat ini mempunyai sifat menghomogenkan dan sekaligus memperkecil ukuran partikel walaupun efek menghomogenkan cairan lebih dominan. Homogenizer Alat ini mempunyai karakteristik memperkecil ukuran partikel Pengecilan partikel terjadi karena cara kerja alat ini yaitu dengan menekan cairan, dipaksa melalui celah yang sempit kemudian dibenturkan ke suatu dinding atau ditumbukkan pada peniti-peniti metal yang ada dalam celah tersebut. Cara sangat sensititf sehingga bisa didapat diameter pertikel rata-rata kurang dari 1 mikron. University of Indonesia
  • 21. Filling dan Sealing dengan Filler/Stopper Machine for Vials Digunakan untuk pengisisan, pemasangan sumbat, dan crimp capping. Pengisian berlangsung otomatis sesuai volum yang sudah ditentukan. Setelah dilakukan pengisisan selanjutnya dilakukan pemasangan sumbat dan crimp capping. University of Indonesia
  • 23. Sterilisasi Metode pembuatan sediaan injeksi terdapat dua cara, yaitu cara aseptik dan sterilisasi akhir. Proses aseptis dilakukan apabila bahan-bahan yang digunakan tidak tahan terhadap pemanasan. Teknik aseptik sediaan injeksi yang berbahan gen VEGF121 University of Indonesia
  • 24. Sterilisasi vial Seluruh peralatan dan material tahan panas disterilisasi dengan pemanasan. Sterilisasi autoklaf suhu 230 0C selama satu jam mampu membunuh secara cepat semua bentuk vegetatif mikroorganisme dalam 1 atau 2 menit University of Indonesia
  • 26. University of Indonesia INCOMING STOCK Routine Work Testing MANUFACTURING Conductivity Measurement Volume Filled Temperature of Sterility Environmental Control Test Visual Inspection FINISHED PRODUC T Leaker Test Pyrogen Test Particulate Test Sterility Test Uniformity of Content
  • 27. LEAKER TEST Filled and Sealed Ampoules ditaruh dalam ruang vakum Dicelupkan pada larutan 1% Methylene Blue Diberikan negative pressure Jika terjadi kebocoran, warna biru akan masuk karena perbedaan tekanan University of Indonesia Leakage (kebocoran) adalah hal yang sering terjadi dalam proses manufaktur kemasan obat Dikarenakan perbedaan temperatur dan tekanan di tiap unit atau ruangan, maka kemasan mengekspansi Test dilakukan pada ampoules, karena bahannya dari kaca
  • 29. LAL BACTERIAL TEST (Limulus Amebocyte Lysate Test) Test yang digunakan untuk mendeteksi keberadaan dan konsentrasi endotoksin bakteri dalam obat-obatan dan produk yang berkonsep biologi. Endotoksin adalah sejenis pyrogen yang keberadaannya ada pada dinding sel dari bakteri negative. LAL Test yang dilakukan berbentuk gel formation test. reagen LAL yaitu Limulus Polyphemus pada inkubasi selama 60 menit pada 37 derajat celcius. tes ini adalah hanya dapat mendekteksi bakteri gram negative dan tidak dapat mengukur tingkat endotoksinnya (tes semi-kualitatif). University of Indonesia
  • 30. RABBIT TEST Mempunyai objek percobaan kelinci Produk manufaktur obat dicobakan pada sekelompok kelinci (5-10 ekor) Prosedur tes sebagai berikut: 1. Pada sekelompok kelinci yang akan dicobakan, tidak boleh diberikan makanan pada hari percobaan 2. Kelinci-kelinci diukur temperature nya sebelum percobaan, dicatat. 3. Obat yang ingin diujikan disuntikkan pada pembuluh dekat telinga. 4. Melakukan pengamatan reaksi obat terhadap kelinci setiap 30 menit, 1 jam, 2 jam, dan 3 jam. 5. Jika ternyata memang ada kandungan bakteri di obat tersebut, dimana terjadi kenaikan temperature pada kelinci tersebut. 6. Jika kondisi dari kelinci 80% mengalami kenaikan temperature pada tubuhnya, dapat dipastikan ada kontaminasi bakteri dalam obat University of Indonesia
  • 31. PARTICULATE TEST Tes ini dilakukan untuk mendeteksi adanya partikel lain dengan metode pencahayaan yang sangat terang dengan background hitam putih Jika adanya partikel lain, maka produk harus dibuang Dapat dilakukan oleh human resources maupun device University of Indonesia
  • 32. STERILITY TEST Tujuan untuk mendeteksi adanya kontaminasi bakteri pada batch proses sebuah manufaktur Metode dibagi menjadi 2 cara: Membrane Filtration Method Menggunakan media yaitu fluid thioglycollate medium dan soya-bean casein digest medium. Direct Menoculation Method Karena mikroorganismenya tidak dapat tersaring, maka samoel langsung dideteksi melalui media atau device Dapat dilakukan secara product sampling atau keseluruhan manufaktur University of Indonesia
  • 34. PACKAGING DAN LABELING Packaging & Labeling Primer Sekunder Tersier Packaging primer injeksi cair yang dipiilih berbentuk VIALS Berbahan dasar kaca dan penggunaannya harus diambil menggunakan syringe yang akan disuntikkan University of Indonesia
  • 35. PACKAGING DAN LABELING Primer Packaging primer berbentuk ampoules yang telah diisi pada proses filling Proses primer labeling dilakukan pada ampoules oleh unit operasi Shrink Labeler atau Ampoule Labeler Sekunder Pemprosesan packaging sekunder lebih dikenal dengan nama pengepakan. Digunakan packaging boks-boks karton Digunakan mesin blister atau cartoning machine (mesin pengepakan otomatis). Mesin jenis ini bisa sekalian melakukan proses labeling. Labeling yang dilakukan biasanya nama, tanggal dan kode produksi , dll University of Indonesia
  • 36. PACKAGING DAN LABELING Tersier Digunakan unit operasi Cardboard Case Packager Penting untuk melindungi produk obat pada saat pengiriman jarak jauh. Pengemasan tersier ke dalam kardus dilakukan secara manual. University of Indonesia
  • 37. KESIMPULAN Secara garis besar, tahapan tahapan pembuatan obat terapi gen VEGF121 ini adalah persiapan mixing sterilisasi filling/sealing inspeksi labeling dan packaging. Untuk sterilisasi bahan gen VEGF121 menggunakan proses aseptic. Untuk sterilisasi wadah menggunakan autoklaf. Kemasan yang digunakan adalah VIALS. University of Indonesia
  • 38. THANK YOU ! F O R Y O U R AT T E N T I O N GROUP 3 P e m i c u 2