ºÝºÝߣ

ºÝºÝߣShare a Scribd company logo

Isolasi Dan Karakterisasi Fragmen C Dna

•Download as PPT, PDF•
•
Yassier Anwar
Yassier Anwar

Fragmen cDNA gen penyandi metallothionein tipe 2 (GmMt2) dari kedelai kultivar Slamet berhasil diisolasi dan berukuran 246 bp. Analisis menunjukkan fragmen GmMt2 memiliki urutan nukleotida dan asam amino yang sama dengan metallothionein dari Arabidopsis thaliana dan berperan dalam mengikat logam dan mendetoksifikasi unsur logam serta membatasi kerusakan oksidatif pada tanaman.

1 of 42
Downloaded 81 times
Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi Metallothionein dari Kedelai Kultivar Slamet YASSIER ANWAR P055040011 Pembimbing 1. Dr. Ir. SUHARSONO, DEA 2. Dr. Ir. UTUT WIDYASTUTI, M.Si
Latar Belakang Kebutuhan kedelai dalam negeri 2 juta ton/tahun Produksi kedelai dalam negeri 0.8 juta ton/tahun Impor kedelai 1.2 juta ton/tahun Peningkatan produksi kedelai dengan INTENSIFIKASI EKSTENSIFIKASI Potensi lahan + lahan asam ± 20 juta ha BPS, 2007 Latar Belakang
Kedelai Slamet Sumber gen untuk mekanisme toleran Al Kultivar lokal yang toleran terhadap tanah asam
Metallothionein Studi MT Pada Kedelai Protein pengikat ion logam, mengandung banyak asam amino cysteine , berat molekul rendah & ditemukan pada berbagai organisme dan berbagai tingkat jaringan/organ Berperan dalam detoksifikasi logam-logam yang dapat bersifat toksik Terlibat dalam proses fisiologis, proliferasi, aktifitas dari metalloenzim, dan faktor transkripsi Memiliki karakteristik yang unik dari komposisi asam amino cysteine Berperan dalam mekanisme homeostasis logam-logam esensial Berperan dalam menanggani & mencegah kerusakan akibat cekaman oksidatif
Mengisolasi dan mengkarakterisasi fragmen cDNA dari gen penyandi metallothionein tipe 2 dari G. max ( GmMt2 ) kultivar Slamet Tujuan Penelitian
Tempat Penelitian BIORIN BMST (PSSHB IPB) Waktu Penelitian September 2007 s/d April 2008 METODOLOGI PENELITIAN
2. pGEM-T Easy 1. Tanaman Kedelai Bahan Tempat penyisipan
3. E. coli galur DH5α 4. Primer spesifik MF & M7R Primer aktin ActF & ActR
Isolasi RNA total Sintesis cDNA total Verifikasi cDNA Isolasi Fragmen cDNA Mt2 Pengklonan Fragmen cDNA GmMt2 Seleksi E. coli pembawa plasmid Isolasi plasmid rekombinan Analisis cDNA Sisipan Sequensing Analisis dan Karakterisasi Simpulan Desain Primer Metode Penelitian
Rasio 1.8 s/d 2 menunjukkan kemurnian tinggi Tidak terkontaminasi oleh protein Hasil Penelitian Isolasi RNA Bahan Absorban pada Rasio λ260/λ280 Total RNA (μg/g sampel segar) λ260 λ280 1g ujung akar 0.223 0.118 1.88 187
Elektroforesis RNA total Integritas RNA tinggi Bersih dari Genom 28S 18S
RT-PCR cDNA terbentuk Bebas DNA RT 1. Terdapat fragmen GmMt2 2. Ukuran 250 pb mt2 M 1000 pb 250 pb M Akar 1000 pb 500 pb
Kloning-transformasi dan Verifikasi vektor pGEM-T Easy M Mt2 1000 pb 250 pb PCR Klon Rekombinan Koloni biru Koloni putih Hasil Transformasi Fragmen GmMt2 berhasil diklonkan ke E. Coli DH5 α 3000 pb 1000 pb 250 pb p M Eco RI
Plasmid Rekombinan pGEM-T Easy + GmMt2
Pensekuenan Fragmen GmMt2 Sequence ID: GmMt2 atgtcttgctgtggaggaaactgcggatgtggatctggctgcaagtgcggcaacggttgtggaggttgcaaaatgtaccctgacttgggattctccggcgagacaaccacaactgagacttttgtcttgggcgttgcaccggcgatgaagaatcagtacgag gcttcaggggagagtaacaacgctgagaacgatgcttgcaagtgtggatctgactgcaagtgtgatccttgcacctgcaagtga Fragmen GmMt2 berukuran 246 pb
Deduksi Asam Amino 81 asam amino Open Reading Frame
Analisis Restriksi Tidak mengandung situs restriksi dari MCS pGEM-T Easy
BLAST n
BLAST p
cDNA utuh GmMt2 telah berhasil diisolasi dari G. max L. dengan ukuran 246 pb. Fragmen GmMt2 mempunyai urutan nukleotida dan asam amino yang sama dengan AtMt2A dari A. thaliana . Motif urutan asam amino GmM T 2 terdiri dari Cys-Cys, Cys-X-Cys dan Cys-X-X-Cys . GmMT2 diduga memiliki peran yang sama dengan AtMT2A yaitu mengikat dan mendetoksifikasi unsur logam dan membatasi kerusakan oksidatif pada tanaman Simpulan
Terima Kasih Proyek HPTP batch III (atas nama Dr. Ir. SUHARSONO, DEA) 2. Dr. Ir. SUHARSONO, DEA 3. Dr. Ir. UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO, M.Si 4. Dr. Ir. MUHAMMAD JUSUF, DEA 5. Rekan-rekan di Lab. BIORIN dan BMST
Ìý
Isolasi RNA Total 1 g sampel digerus dengan N2 cair + 800 μ l TRIzol Inkubasi 3 menit, T ruang + 200 μ l Chloroform Inkubasi 5 menit, T ruang 9000 rpm, 6 ˚C, 15 menit Fase cair dipindahkan, + 500 μl Isopropyl alcohol Pelet + 500μl EtOH 70% Inkubasi 10 menit, T ruang 9000 rpm, 6 ˚C, 10 menit 5700 rpm, 6 ˚C, 5 menit Pelet dikeringkan + 30μl ddH2O-DEPC treated Kuantifikasi (Spektofotometer) Kualifikasi (Elektroforesis)
Sintesis cDNA Total 20 Final Volume 0.8 2 0.2 2 1 4 10 Jumlah ( μ l) No Bahan Kons. 1 RNA 5 μg / μl 2 Buffer RT 1X 3 Primer Oligo (dT) 20 pmol 4 Dithiotreitol (DTT) 10 mM 5 RT enzyme (Invitrogen) 2U/ μ l 6 dNTP mix 2 mM/μl 7 ddH2O(DEPC) - No Suhu (˚C) Waktu (menit) 1 30 10 2 45 50 3 95 5 4 15 10
Primer ActF : ATGGCAGATGCCGAGGATAT ActR : CAGTTGTGCGACCACTTGCA PCR Aktin No Bahan Kons. Jumlah ( μ l) 1 Template cDNA ( ± 200 ng) 10 ng/μl 1 2 Buffer Taq 10x 1 3 Primer ActF 10 pmol 0.5 4 Primer ActR 10 pmol 0.5 5 dNTP mix 2 mM/μl 1 6 DMSO 4 % 0.4 7 Taq Polymerase 5 U /μl 0.1 8 ddH2O - 5.5 Volume final 10 No PCR Suhu Waktu 1 Pra-PCR 95˚C 5 menit 2 Denaturasi 94˚C 30 detik 3 Annealing 55˚C 30 detik 4 Ekstensi 72˚C 1.5 menit 5 Siklus - 37 siklus 6 Final-PCR 72˚C 5 menit 7 Post-PCR 15˚C 5 menit
Desain Primer Spesifik Searching sequences of Mt2 Clustering of Mt2 FASTA Format a Group Primer3 (http://www.primer3.com) Find consensus sequence (BIOEDIT versi 7.0.5.2) Selection of Primer Spesific Primer of Mt2 Primer MF :TCGAGAAAAATGTCTTGCTGTG M7R :CCTTGCACCTGCAAGTGAAG
Primer MF :TCGAGAAAAATGTCTTGCTGTG M7R :CCTTGCACCTGCAAGTGAAG Isolasi Fragmen cDNA GmMt2 No Bahan Kons. Jumlah ( μ l) 1 Template cDNA ( ± 200 ng) 10 ng/μl 2 2 Buffer Taq (10x) 1x 2 3 Primer MF 20 pmol 1 4 primer M7R 20 pmol 1 5 dNTP mix 2 mM/μl 2 6 DMSO 4 % 0.8 7 Taq Polymerase 5 U /μl 0.2 8 ddH2O - 11 Volume final 20 No PCR Suhu Waktu 1 Pra-PCR 95˚C 5 menit 2 Denaturasi 94˚C 30 detik 3 Annealing 58˚C 30 detik 4 Ekstensi 72˚C 1.5 menit 5 Siklus - 37 siklus 6 Final-PCR 72˚C 5 menit 7 Post-PCR 15 ˚C 5 menit
Ligasi Fragmen Mt2 Pengklonan & Seleksi Inkubasi 4°C;overnight No Bahan Kons. Volume ( μ l) 1 Produk PCR ± 5 ng 3 2 pGEM-T Easy ± 10 ng 1 3 Buffer T4 DNA Ligase 10x 1 4 DNA ligase 1U/ μ l 0.5 5 ddH2O - 4.5 Volume final 10 Sel kompeten + hasil ligasi Di es 20 menit Kejutan suhu 42°C selama 45 detik Inkubasi 37°C;250rpm; selama 20menit + 100μl YT Di es 5 menit Sebar di media LA+ Ampisilin Inkubasi 38°C 16 jam Seleksi Biru-Putih E. Coli DH5 α Blue-white selection
Isolasi DNA Plasmid Kultur klon semalam @1.5ml 12000rpm 10‘ 4°C 12000rpm 5‘ 4°C 150µl buffer resuspensi, vortex 150µl buffer lysis, bolak-balik 150µl buffer netralisasi pelet ① ② ③ 12000rpm 5‘ 4°C vortex fase aqueous NaOAc 3M etOH abs 2xvol Inkubasi -20ºC, 2 jam 12000rpm 5‘ 4°C pelet Cuci dg etOH 70% 12000rpm 10‘ 4°C Kering vacuum 30-45’ Dilarutkan dlm TE/ddH 2 O, inkubasi semalam + RNase 0.1x vol Plasmid cek
Analisis Plasmid Rekombinan No Bahan Kons. Volume ( μ l) 1 Plasmid rekombinan 13 ng/ μl 15 2 Buffer Eco R1 (10x) 1X 2 3 Enzim Eco R1 10 U/ μl 1 4 ddH2O - 2 Volume final 20 Inkubasi 37°C; 2 jam
Analisis Situs Restriksi http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html Translasi (deduksi asam amino) http://www.expasy.ch/tools/translate BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast ORF http://www.softberry/bestorf/htm Domain http://www.myhits/motifscan/htm Analisis Sekuen
Hasil Sekuen
Biomolekuler Website
Cystein
Verifikasi dengan Aktin Primer aktin dari kedelai Primer ActF 5’ATGGCAGATGCCGAGGATAT3’ Primer ActR 5’CAGTTGTGCGACCACTTGCA3’ 450 pb cDNA murni Ekson 1 Ekson 2 Ekson 1 Ekson 2 Intron 90 pb 540 pb cDNA tidak murni Template: DNA genom
Ìý
Ìý
Ìý
Ìý
Ìý
Ìý
Ìý

More Related Content

Isolasi Dan Karakterisasi Fragmen C Dna

  • 1. Isolasi dan Karakterisasi Fragmen cDNA dari Gen Penyandi Metallothionein dari Kedelai Kultivar Slamet YASSIER ANWAR P055040011 Pembimbing 1. Dr. Ir. SUHARSONO, DEA 2. Dr. Ir. UTUT WIDYASTUTI, M.Si
  • 2. Latar Belakang Kebutuhan kedelai dalam negeri 2 juta ton/tahun Produksi kedelai dalam negeri 0.8 juta ton/tahun Impor kedelai 1.2 juta ton/tahun Peningkatan produksi kedelai dengan INTENSIFIKASI EKSTENSIFIKASI Potensi lahan + lahan asam ± 20 juta ha BPS, 2007 Latar Belakang
  • 3. Kedelai Slamet Sumber gen untuk mekanisme toleran Al Kultivar lokal yang toleran terhadap tanah asam
  • 4. Metallothionein Studi MT Pada Kedelai Protein pengikat ion logam, mengandung banyak asam amino cysteine , berat molekul rendah & ditemukan pada berbagai organisme dan berbagai tingkat jaringan/organ Berperan dalam detoksifikasi logam-logam yang dapat bersifat toksik Terlibat dalam proses fisiologis, proliferasi, aktifitas dari metalloenzim, dan faktor transkripsi Memiliki karakteristik yang unik dari komposisi asam amino cysteine Berperan dalam mekanisme homeostasis logam-logam esensial Berperan dalam menanggani & mencegah kerusakan akibat cekaman oksidatif
  • 5. Mengisolasi dan mengkarakterisasi fragmen cDNA dari gen penyandi metallothionein tipe 2 dari G. max ( GmMt2 ) kultivar Slamet Tujuan Penelitian
  • 6. Tempat Penelitian BIORIN BMST (PSSHB IPB) Waktu Penelitian September 2007 s/d April 2008 METODOLOGI PENELITIAN
  • 7. 2. pGEM-T Easy 1. Tanaman Kedelai Bahan Tempat penyisipan
  • 8. 3. E. coli galur DH5α 4. Primer spesifik MF & M7R Primer aktin ActF & ActR
  • 9. Isolasi RNA total Sintesis cDNA total Verifikasi cDNA Isolasi Fragmen cDNA Mt2 Pengklonan Fragmen cDNA GmMt2 Seleksi E. coli pembawa plasmid Isolasi plasmid rekombinan Analisis cDNA Sisipan Sequensing Analisis dan Karakterisasi Simpulan Desain Primer Metode Penelitian
  • 10. Rasio 1.8 s/d 2 menunjukkan kemurnian tinggi Tidak terkontaminasi oleh protein Hasil Penelitian Isolasi RNA Bahan Absorban pada Rasio λ260/λ280 Total RNA (μg/g sampel segar) λ260 λ280 1g ujung akar 0.223 0.118 1.88 187
  • 11. Elektroforesis RNA total Integritas RNA tinggi Bersih dari Genom 28S 18S
  • 12. RT-PCR cDNA terbentuk Bebas DNA RT 1. Terdapat fragmen GmMt2 2. Ukuran 250 pb mt2 M 1000 pb 250 pb M Akar 1000 pb 500 pb
  • 13. Kloning-transformasi dan Verifikasi vektor pGEM-T Easy M Mt2 1000 pb 250 pb PCR Klon Rekombinan Koloni biru Koloni putih Hasil Transformasi Fragmen GmMt2 berhasil diklonkan ke E. Coli DH5 α 3000 pb 1000 pb 250 pb p M Eco RI
  • 15. Pensekuenan Fragmen GmMt2 Sequence ID: GmMt2 atgtcttgctgtggaggaaactgcggatgtggatctggctgcaagtgcggcaacggttgtggaggttgcaaaatgtaccctgacttgggattctccggcgagacaaccacaactgagacttttgtcttgggcgttgcaccggcgatgaagaatcagtacgag gcttcaggggagagtaacaacgctgagaacgatgcttgcaagtgtggatctgactgcaagtgtgatccttgcacctgcaagtga Fragmen GmMt2 berukuran 246 pb
  • 16. Deduksi Asam Amino 81 asam amino Open Reading Frame
  • 17. Analisis Restriksi Tidak mengandung situs restriksi dari MCS pGEM-T Easy
  • 20. cDNA utuh GmMt2 telah berhasil diisolasi dari G. max L. dengan ukuran 246 pb. Fragmen GmMt2 mempunyai urutan nukleotida dan asam amino yang sama dengan AtMt2A dari A. thaliana . Motif urutan asam amino GmM T 2 terdiri dari Cys-Cys, Cys-X-Cys dan Cys-X-X-Cys . GmMT2 diduga memiliki peran yang sama dengan AtMT2A yaitu mengikat dan mendetoksifikasi unsur logam dan membatasi kerusakan oksidatif pada tanaman Simpulan
  • 21. Terima Kasih Proyek HPTP batch III (atas nama Dr. Ir. SUHARSONO, DEA) 2. Dr. Ir. SUHARSONO, DEA 3. Dr. Ir. UTUT WIDYASTUTI SUHARSONO, M.Si 4. Dr. Ir. MUHAMMAD JUSUF, DEA 5. Rekan-rekan di Lab. BIORIN dan BMST
  • 22. Ìý
  • 23. Isolasi RNA Total 1 g sampel digerus dengan N2 cair + 800 μ l TRIzol Inkubasi 3 menit, T ruang + 200 μ l Chloroform Inkubasi 5 menit, T ruang 9000 rpm, 6 ËšC, 15 menit Fase cair dipindahkan, + 500 μl Isopropyl alcohol Pelet + 500μl EtOH 70% Inkubasi 10 menit, T ruang 9000 rpm, 6 ËšC, 10 menit 5700 rpm, 6 ËšC, 5 menit Pelet dikeringkan + 30μl ddH2O-DEPC treated Kuantifikasi (Spektofotometer) Kualifikasi (Elektroforesis)
  • 24. Sintesis cDNA Total 20 Final Volume 0.8 2 0.2 2 1 4 10 Jumlah ( μ l) No Bahan Kons. 1 RNA 5 μg / μl 2 Buffer RT 1X 3 Primer Oligo (dT) 20 pmol 4 Dithiotreitol (DTT) 10 mM 5 RT enzyme (Invitrogen) 2U/ μ l 6 dNTP mix 2 mM/μl 7 ddH2O(DEPC) - No Suhu (ËšC) Waktu (menit) 1 30 10 2 45 50 3 95 5 4 15 10
  • 25. Primer ActF : ATGGCAGATGCCGAGGATAT ActR : CAGTTGTGCGACCACTTGCA PCR Aktin No Bahan Kons. Jumlah ( μ l) 1 Template cDNA ( ± 200 ng) 10 ng/μl 1 2 Buffer Taq 10x 1 3 Primer ActF 10 pmol 0.5 4 Primer ActR 10 pmol 0.5 5 dNTP mix 2 mM/μl 1 6 DMSO 4 % 0.4 7 Taq Polymerase 5 U /μl 0.1 8 ddH2O - 5.5 Volume final 10 No PCR Suhu Waktu 1 Pra-PCR 95ËšC 5 menit 2 Denaturasi 94ËšC 30 detik 3 Annealing 55ËšC 30 detik 4 Ekstensi 72ËšC 1.5 menit 5 Siklus - 37 siklus 6 Final-PCR 72ËšC 5 menit 7 Post-PCR 15ËšC 5 menit
  • 26. Desain Primer Spesifik Searching sequences of Mt2 Clustering of Mt2 FASTA Format a Group Primer3 (http://www.primer3.com) Find consensus sequence (BIOEDIT versi 7.0.5.2) Selection of Primer Spesific Primer of Mt2 Primer MF :TCGAGAAAAATGTCTTGCTGTG M7R :CCTTGCACCTGCAAGTGAAG
  • 27. Primer MF :TCGAGAAAAATGTCTTGCTGTG M7R :CCTTGCACCTGCAAGTGAAG Isolasi Fragmen cDNA GmMt2 No Bahan Kons. Jumlah ( μ l) 1 Template cDNA ( ± 200 ng) 10 ng/μl 2 2 Buffer Taq (10x) 1x 2 3 Primer MF 20 pmol 1 4 primer M7R 20 pmol 1 5 dNTP mix 2 mM/μl 2 6 DMSO 4 % 0.8 7 Taq Polymerase 5 U /μl 0.2 8 ddH2O - 11 Volume final 20 No PCR Suhu Waktu 1 Pra-PCR 95ËšC 5 menit 2 Denaturasi 94ËšC 30 detik 3 Annealing 58ËšC 30 detik 4 Ekstensi 72ËšC 1.5 menit 5 Siklus - 37 siklus 6 Final-PCR 72ËšC 5 menit 7 Post-PCR 15 ËšC 5 menit
  • 28. Ligasi Fragmen Mt2 Pengklonan & Seleksi Inkubasi 4°C;overnight No Bahan Kons. Volume ( μ l) 1 Produk PCR ± 5 ng 3 2 pGEM-T Easy ± 10 ng 1 3 Buffer T4 DNA Ligase 10x 1 4 DNA ligase 1U/ μ l 0.5 5 ddH2O - 4.5 Volume final 10 Sel kompeten + hasil ligasi Di es 20 menit Kejutan suhu 42°C selama 45 detik Inkubasi 37°C;250rpm; selama 20menit + 100μl YT Di es 5 menit Sebar di media LA+ Ampisilin Inkubasi 38°C 16 jam Seleksi Biru-Putih E. Coli DH5 α Blue-white selection
  • 29. Isolasi DNA Plasmid Kultur klon semalam @1.5ml 12000rpm 10‘ 4°C 12000rpm 5‘ 4°C 150µl buffer resuspensi, vortex 150µl buffer lysis, bolak-balik 150µl buffer netralisasi pelet â‘  â‘¡ â‘¢ 12000rpm 5‘ 4°C vortex fase aqueous NaOAc 3M etOH abs 2xvol Inkubasi -20ºC, 2 jam 12000rpm 5‘ 4°C pelet Cuci dg etOH 70% 12000rpm 10‘ 4°C Kering vacuum 30-45’ Dilarutkan dlm TE/ddH 2 O, inkubasi semalam + RNase 0.1x vol Plasmid cek
  • 30. Analisis Plasmid Rekombinan No Bahan Kons. Volume ( μ l) 1 Plasmid rekombinan 13 ng/ μl 15 2 Buffer Eco R1 (10x) 1X 2 3 Enzim Eco R1 10 U/ μl 1 4 ddH2O - 2 Volume final 20 Inkubasi 37°C; 2 jam
  • 31. Analisis Situs Restriksi http://www.firstmarket.com/cutter/cut2.html Translasi (deduksi asam amino) http://www.expasy.ch/tools/translate BLAST http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast ORF http://www.softberry/bestorf/htm Domain http://www.myhits/motifscan/htm Analisis Sekuen
  • 35. Verifikasi dengan Aktin Primer aktin dari kedelai Primer ActF 5’ATGGCAGATGCCGAGGATAT3’ Primer ActR 5’CAGTTGTGCGACCACTTGCA3’ 450 pb cDNA murni Ekson 1 Ekson 2 Ekson 1 Ekson 2 Intron 90 pb 540 pb cDNA tidak murni Template: DNA genom
  • 36. Ìý
  • 37. Ìý
  • 38. Ìý
  • 39. Ìý
  • 40. Ìý
  • 41. Ìý
  • 42. Ìý