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Analysis of differential splicing suggests different modes of short-term splicing regulation

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Mika Yoshimura

滨厂惭叠読み会2016の発表资料です

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16.08.17 ?ISMB読み会2016 Analysis of differential splicing suggests different modes of short-term splicing regulation 理化学研究所 情報基盤センター バイオインフォマティクス研究開発ユニット テクニカルスタッフ 芳村美佳(@nakaneko143) Hande ?Topa et.al Bioinformatics (2016) 32 (12):i147-?i155.
論?文の概要 ? 選択的スプライシングによる個々のisoformが、 短時間で別々の時系列発現変動を?示すことが?示唆された。 ? モチベ：選択的スプライシングの制御機構の解明。 pre-?mRNA 1 intron 2 intron 3 intron 4 spliced-?mRNA 1 2 3 1 2 4 細胞内で、各isoformは どれくらい発現している？ 経時的変化は？ ? 著者らは、short-?read ?RNA-?seq データを?用いた各isoformの 時系列発現変動を観測するモデルおよび評価?手法を開発した。 ? 上記を?用いて、breast ?cancer ?エストロゲン受容体シグナルの 発現データをもとに、isoformごとの時系列発現変動傾向を 観測?可視化することに成功した。
先?行研究 ~～イントロダクション ? isoform発現定量?手法 ? full-?length ?RNA-?Seq ? amplification-?free ?long-?read ?sequencing ?(Tilgner et ?al., ?2014) ? 課題：seq depth, ?コスト ? Short-?read ?RNA-?seq ? BitSeq (Glaus et ?al., ?2012) ：モデル構築+ベイズ推定 ? RSEM (Li ?B ?et ?al., ?2010) ?: ?EMアルゴリズム ? Cufflinks ?(Trapnell et ?al., ?2010) ?: ?ゲノムから推定 ? MISO ?(Mixture ?of ?Isoforms) ?(Katz ?et ?al, ?2010) ?: ?選択的スプライシングに焦点 ? 課題：transcripts ?アセンブリ ? 短時間の時系列発現定量?手法 ? analyzing ?time-?course ?RNA-?seq ? DyNB (?ij? et ?al., ?2014) ?: ガウス過程とNBを組み合わせたモデル ? 課題：スプライシングの考慮
この論?文の新規性(おそらく) ? isoform発現定量?手法 ? full-?length ?RNA-?Seq ? amplification-?free ?long-?read ?sequencing ?(Tilgner et ?al., ?2014) ? 課題：seq depth, ?コスト ? Short-?read ?RNA-?seq ? BitSeq (Glaus et ?al., ?2012) ? RSEM (Li ?B ?et ?al., ?2010) ? Cufflinks ?(Trapnell et ?al., ?2010) ? MISO ?(Mixture ?of ?Isoforms) ?(Katz ?et ?al, ?2010) ? 課題：transcripts ?アセンブリ ? 時系列サンプルの発現定量?手法 ? analyzing ?time-?course ?RNA-?seq ? DyNB (?ij? et ?al., ?2014) ? 課題：スプライシングの考慮 これらを組み合わせた アプローチを?用いて、 遺伝?子 に属する isoformごとの 時系列発現定量を実現した。 特定のシグナル伝達系で 時系列のisoform発現パターンを 解析した報告は今までにない
提案?手法 ~～概要 マッピング：Bowtie 発現定量：BitSeq 1) 時系列の各発現レベルを 3パターンに分類 I ?: ?遺伝?子全体 II ?: ?各transcriptsの発現 (絶対値) III ?:各transcriptsの発現 (相対値) 2) 各パターンにガウス過程回帰 & ? ベイズ因?子によるモデル評価 3) 各isoform特異的な発現変動傾向を 可視化 キモの部分（?青枠）
提案?手法 ~～ 1) ?3パターンの発現レベル ? 推定 transcript発現レベル ? MCMC ?kth ?サンプル (k ?= ?1 ?… ?, ?500) ?from ?BitSeq ? m ?: ?transcript ?(m ?= ?1 ?… ?, ?M) ? t ?: ?time point (t ?= ?1 ?… ?, ?n) θmt k パターンI ?: ?遺伝?子全体 パターンII ?: ?transcripts(絶対) パターンIII ?: ?transcripts(相対) Ek (log( θmt k m∈Ij ∑ )) Vark (log( θmt k m∈Ij ∑ )) Ek (log(θmt k )) mean ?= ? variances ?= ? mean ?= ? variances ?= ? mean ?= ? variances ?= ? Vark (log(θmt k )) Ek ( θmt k θmt k m∈Ij ∑ ) Vark ( θmt k θmt k m∈Ij ∑ ) I_?j : ?gene_?jのtranscript I_?j : ?gene_?jのtranscript
提案?手法 ~～2) ?モデル評価 ? ベイズファクターKによる評価 ? 時間依存モデル vs ?時間?非依存モデルの尤度?比 → BF ? logBF > ?3 = ?時間依存モデルの?方が良い とする (Jefferey?’s scale) f(t1) f(t2) f(tn) y1 y2 yn εt … … … … y1 y2 yn εt … … 時間依存モデル 時間?非依存モデル ガウス過程 ノイズ共分散?行列
検証?方法 ? エストロゲンレセプターαシグナル伝達系 RNA-?Seq データ ? Honkela et ?al., ?2015 ?(GSE62789) ? MCF7 ?breat cancer ?cell ?line ? エストラジオール添加後、10 ?time ?point で回収 (0, ?5, ?10, ?20, ?40, ?80, ?160, ?320, ?640, ?1280 ?min) ? リファレンス配列 ? Genecode.v19 ? long ?non-?coding ?RNA ?+ ?pre-?mRNA ?の配列を加える ? 34608 ?genes, ?119207 ?transcripts ? QCで15346 transcriptsを除いた ? 時間依存的発現変動のthreshold ? パターンII ?(発現レベル絶対値)：平均の最?大と最?小が1.5FC以上 ? パターンIII ?(発現レベル相対値)：平均の最?大と最?小が0.1FC以上
[結果] 遺伝?子全体の発現変動傾向と transcriptsの変動傾向の対応 Transcriptsの 絶対値 -? 相対値 変動していない (Gene) 変動している (Gene) Sum DE ?-? DE 336 88 424 NonDE -? DE 152 12 164 DE ?-? NonDE 1014 700 1714 NonDE -? NonDE 16511 449 16960 Sum 18013 1249 19262 ① ② ① ：全遺伝?子の約11%が選択的スプライシングをうけ、かつ時間的発現変動を ?示すisoformをもっている ② ：相対値で時間依存的発現変動を?示すisoformの検出感度が?非常に低い → ?全体でみたときにノイズとなり、発現変動の検出感度を下げる要因？
[結果] 複数の変動傾向を?示すisoformの例 GRHL3 RHOQ ? 時間的変動傾向は 各isoformで連動 ? 相対値では変動なし ? 最も多いケース ? RHOQ-?001(?赤)の 発現変動傾向は 他と連動していない ? 相対値のみで検出 同様の傾向：, MTCH2,ARL2BP,RB1CC1 HNRNPD, TBCEL, OSMR, ESR1, ADCY1, PMPCB, AP006222.2, EPS8, RAVER2 and P4HA2.
考察 ? なぜ同?一遺伝?子のisoform間で複数の発現変動制御があるのか 不明だが、解析の際には常に留意する必要がある ? バイオロジカルな深追いはしていない。正解がないから？ コメント ? 数年前に同じ著者が、ほぼ同じ?手法で論?文化している (Bioinformatics 31(11) ·? March ?2014) ? ショウジョウバエの世代ごとのゲノムワイドSNP頻度解析が 従来?手法より良くなったという内容 ? 今回との差分は観測データのノイズ共分散?行列の改良くらい ? やはり実?用的な問題設定を提?示すれば 多少過去のものに似ていても採択される？
[補?足] An ?interactive ?browser ?for ?viewing ? all ?model ?fits ? https://users.ics.aalto.fi/hande/splicingGP/ ? 本論?文でモデル評価した各geneごとの結果をGUIで参照できる
[補?足] 複数のisoform発現変動傾向が みられた遺伝?子のプロファイル Gene ?symbol name profile breast ?cancerとの関連 RHOQ ras homolog ?family ? member ?Q 低分?子量GTP結合タンパク 質ファミリー。シグナル伝 達のスイッチ機能を有し、 関連する細胞内機能は多岐 にわたる。 ※colorectal ?cancerと の関連が報告 J ?Exp ?Med. 2014 ?Apr ? 7;211(4):613-?21 MTCH2 mitochondrial ?carrier ? homolog ?2 アポトーシス関連遺伝?子。 抑制による癌化への関連が 報告されている。 Am ?J ?Pathol. 2013 ? Jun;182(6):2058-?70 ARL2BP ADP ?Ribosylation Factor ? Like ?GTPase 2 ?Binding ? Protein small ?GTPases ARL2 ?and ? ARL3のエフェクター。 breast ?cancer ?cellsで癌化 調節因?子HMGA1のノック ダウンによりdown regulationされたとの報告 がある。 PLoS ?One. ?2013; ?8(5): ? e63419. RB1CC1 RB1 ?Inducible ?Coiled-? Coil ?1 癌抑制遺伝?子RBIの発現を 誘導する働きをもつ。 breast ?cancer ?cellsでの変 異が報告されている。 Nature ?Genetics. 31, ? 285 ?-? 288 ?(2002)
[補?足] ガウス過程回帰~～予測分布 1) ?ガウシアンプロセス 2) ?時刻tの観測データyと同時分布 → ノイズ分布：平均0, ? 3) ?結合(同時)分布 → 3) ?ベイズの定理より予測分布の導出
[補?足] ガウス過程回帰~～周辺尤度関数 1) ?時刻tの観測データyの分布 2) ?カーネル → 3) ノイズ共分散?行列 →2乗指数カーネルを使?用 →各時点での分散を下限として与えている 4) 周辺尤度関数

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  • 1. 16.08.17 ?ISMB読み会2016 Analysis of differential splicing suggests different modes of short-term splicing regulation 理化学研究所 情報基盤センター バイオインフォマティクス研究開発ユニット テクニカルスタッフ 芳村美佳(@nakaneko143) Hande ?Topa et.al Bioinformatics (2016) 32 (12):i147-?i155.
  • 2. 論?文の概要 ? 選択的スプライシングによる個々のisoformが、 短時間で別々の時系列発現変動を?示すことが?示唆された。 ? モチベ：選択的スプライシングの制御機構の解明。 pre-?mRNA 1 intron 2 intron 3 intron 4 spliced-?mRNA 1 2 3 1 2 4 細胞内で、各isoformは どれくらい発現している？ 経時的変化は？ ? 著者らは、short-?read ?RNA-?seq データを?用いた各isoformの 時系列発現変動を観測するモデルおよび評価?手法を開発した。 ? 上記を?用いて、breast ?cancer ?エストロゲン受容体シグナルの 発現データをもとに、isoformごとの時系列発現変動傾向を 観測?可視化することに成功した。
  • 3. 先?行研究 ~～イントロダクション ? isoform発現定量?手法 ? full-?length ?RNA-?Seq ? amplification-?free ?long-?read ?sequencing ?(Tilgner et ?al., ?2014) ? 課題：seq depth, ?コスト ? Short-?read ?RNA-?seq ? BitSeq (Glaus et ?al., ?2012) ：モデル構築+ベイズ推定 ? RSEM (Li ?B ?et ?al., ?2010) ?: ?EMアルゴリズム ? Cufflinks ?(Trapnell et ?al., ?2010) ?: ?ゲノムから推定 ? MISO ?(Mixture ?of ?Isoforms) ?(Katz ?et ?al, ?2010) ?: ?選択的スプライシングに焦点 ? 課題：transcripts ?アセンブリ ? 短時間の時系列発現定量?手法 ? analyzing ?time-?course ?RNA-?seq ? DyNB (?ij? et ?al., ?2014) ?: ガウス過程とNBを組み合わせたモデル ? 課題：スプライシングの考慮
  • 4. この論?文の新規性(おそらく) ? isoform発現定量?手法 ? full-?length ?RNA-?Seq ? amplification-?free ?long-?read ?sequencing ?(Tilgner et ?al., ?2014) ? 課題：seq depth, ?コスト ? Short-?read ?RNA-?seq ? BitSeq (Glaus et ?al., ?2012) ? RSEM (Li ?B ?et ?al., ?2010) ? Cufflinks ?(Trapnell et ?al., ?2010) ? MISO ?(Mixture ?of ?Isoforms) ?(Katz ?et ?al, ?2010) ? 課題：transcripts ?アセンブリ ? 時系列サンプルの発現定量?手法 ? analyzing ?time-?course ?RNA-?seq ? DyNB (?ij? et ?al., ?2014) ? 課題：スプライシングの考慮 これらを組み合わせた アプローチを?用いて、 遺伝?子 に属する isoformごとの 時系列発現定量を実現した。 特定のシグナル伝達系で 時系列のisoform発現パターンを 解析した報告は今までにない
  • 5. 提案?手法 ~～概要 マッピング：Bowtie 発現定量：BitSeq 1) 時系列の各発現レベルを 3パターンに分類 I ?: ?遺伝?子全体 II ?: ?各transcriptsの発現 (絶対値) III ?:各transcriptsの発現 (相対値) 2) 各パターンにガウス過程回帰 & ? ベイズ因?子によるモデル評価 3) 各isoform特異的な発現変動傾向を 可視化 キモの部分（?青枠）
  • 6. 提案?手法 ~～ 1) ?3パターンの発現レベル ? 推定 transcript発現レベル ? MCMC ?kth ?サンプル (k ?= ?1 ?… ?, ?500) ?from ?BitSeq ? m ?: ?transcript ?(m ?= ?1 ?… ?, ?M) ? t ?: ?time point (t ?= ?1 ?… ?, ?n) θmt k パターンI ?: ?遺伝?子全体 パターンII ?: ?transcripts(絶対) パターンIII ?: ?transcripts(相対) Ek (log( θmt k m∈Ij ∑ )) Vark (log( θmt k m∈Ij ∑ )) Ek (log(θmt k )) mean ?= ? variances ?= ? mean ?= ? variances ?= ? mean ?= ? variances ?= ? Vark (log(θmt k )) Ek ( θmt k θmt k m∈Ij ∑ ) Vark ( θmt k θmt k m∈Ij ∑ ) I_?j : ?gene_?jのtranscript I_?j : ?gene_?jのtranscript
  • 7. 提案?手法 ~～2) ?モデル評価 ? ベイズファクターKによる評価 ? 時間依存モデル vs ?時間?非依存モデルの尤度?比 → BF ? logBF > ?3 = ?時間依存モデルの?方が良い とする (Jefferey?’s scale) f(t1) f(t2) f(tn) y1 y2 yn εt … … … … y1 y2 yn εt … … 時間依存モデル 時間?非依存モデル ガウス過程 ノイズ共分散?行列
  • 8. 検証?方法 ? エストロゲンレセプターαシグナル伝達系 RNA-?Seq データ ? Honkela et ?al., ?2015 ?(GSE62789) ? MCF7 ?breat cancer ?cell ?line ? エストラジオール添加後、10 ?time ?point で回収 (0, ?5, ?10, ?20, ?40, ?80, ?160, ?320, ?640, ?1280 ?min) ? リファレンス配列 ? Genecode.v19 ? long ?non-?coding ?RNA ?+ ?pre-?mRNA ?の配列を加える ? 34608 ?genes, ?119207 ?transcripts ? QCで15346 transcriptsを除いた ? 時間依存的発現変動のthreshold ? パターンII ?(発現レベル絶対値)：平均の最?大と最?小が1.5FC以上 ? パターンIII ?(発現レベル相対値)：平均の最?大と最?小が0.1FC以上
  • 9. [結果] 遺伝?子全体の発現変動傾向と transcriptsの変動傾向の対応 Transcriptsの 絶対値 -? 相対値 変動していない (Gene) 変動している (Gene) Sum DE ?-? DE 336 88 424 NonDE -? DE 152 12 164 DE ?-? NonDE 1014 700 1714 NonDE -? NonDE 16511 449 16960 Sum 18013 1249 19262 ① ② ① ：全遺伝?子の約11%が選択的スプライシングをうけ、かつ時間的発現変動を ?示すisoformをもっている ② ：相対値で時間依存的発現変動を?示すisoformの検出感度が?非常に低い → ?全体でみたときにノイズとなり、発現変動の検出感度を下げる要因？
  • 10. [結果] 複数の変動傾向を?示すisoformの例 GRHL3 RHOQ ? 時間的変動傾向は 各isoformで連動 ? 相対値では変動なし ? 最も多いケース ? RHOQ-?001(?赤)の 発現変動傾向は 他と連動していない ? 相対値のみで検出 同様の傾向：, MTCH2,ARL2BP,RB1CC1 HNRNPD, TBCEL, OSMR, ESR1, ADCY1, PMPCB, AP006222.2, EPS8, RAVER2 and P4HA2.
  • 11. 考察 ? なぜ同?一遺伝?子のisoform間で複数の発現変動制御があるのか 不明だが、解析の際には常に留意する必要がある ? バイオロジカルな深追いはしていない。正解がないから？ コメント ? 数年前に同じ著者が、ほぼ同じ?手法で論?文化している (Bioinformatics 31(11) ·? March ?2014) ? ショウジョウバエの世代ごとのゲノムワイドSNP頻度解析が 従来?手法より良くなったという内容 ? 今回との差分は観測データのノイズ共分散?行列の改良くらい ? やはり実?用的な問題設定を提?示すれば 多少過去のものに似ていても採択される？
  • 12. [補?足] An ?interactive ?browser ?for ?viewing ? all ?model ?fits ? https://users.ics.aalto.fi/hande/splicingGP/ ? 本論?文でモデル評価した各geneごとの結果をGUIで参照できる
  • 13. [補?足] 複数のisoform発現変動傾向が みられた遺伝?子のプロファイル Gene ?symbol name profile breast ?cancerとの関連 RHOQ ras homolog ?family ? member ?Q 低分?子量GTP結合タンパク 質ファミリー。シグナル伝 達のスイッチ機能を有し、 関連する細胞内機能は多岐 にわたる。 ※colorectal ?cancerと の関連が報告 J ?Exp ?Med. 2014 ?Apr ? 7;211(4):613-?21 MTCH2 mitochondrial ?carrier ? homolog ?2 アポトーシス関連遺伝?子。 抑制による癌化への関連が 報告されている。 Am ?J ?Pathol. 2013 ? Jun;182(6):2058-?70 ARL2BP ADP ?Ribosylation Factor ? Like ?GTPase 2 ?Binding ? Protein small ?GTPases ARL2 ?and ? ARL3のエフェクター。 breast ?cancer ?cellsで癌化 調節因?子HMGA1のノック ダウンによりdown regulationされたとの報告 がある。 PLoS ?One. ?2013; ?8(5): ? e63419. RB1CC1 RB1 ?Inducible ?Coiled-? Coil ?1 癌抑制遺伝?子RBIの発現を 誘導する働きをもつ。 breast ?cancer ?cellsでの変 異が報告されている。 Nature ?Genetics. 31, ? 285 ?-? 288 ?(2002)
  • 14. [補?足] ガウス過程回帰~～予測分布 1) ?ガウシアンプロセス 2) ?時刻tの観測データyと同時分布 → ノイズ分布：平均0, ? 3) ?結合(同時)分布 → 3) ?ベイズの定理より予測分布の導出
  • 15. [補?足] ガウス過程回帰~～周辺尤度関数 1) ?時刻tの観測データyの分布 2) ?カーネル → 3) ノイズ共分散?行列 →2乗指数カーネルを使?用 →各時点での分散を下限として与えている 4) 周辺尤度関数