Kísérletek izolált vaszkuláris gyűrűkön
- 1. Kísérletek izolált vaszkuláris gyűrűkön Ph.D. Martin Mihály, PhD., MD.
- 2. A VÉREREK FIZIOLÓGIÁJA • Az érrendszer fiziológiájának jó megértése elengedhetetlen a kísérlet lefolyásának megértéséhez • A vazodilatáció és az érszűkület mechanizmusai
- 3. Intracelluláris jelátvitel A receptorok típusai: 1. Receptorfüggő ioncsatornák (ionotróp és receptor receptorok) 2. G-fehérjével (metabotróp receptorokkal) összekapcsolt receptorok 3. Kináz receptorok 4. Nukleáris receptorok
- 4. R R E R Ú R Ú R Celluláris válasz Celluláris válasz Celluláris válasz Celluláris válasz hiperpolarizációt vagy depolarizáció Az ingerlékenys ég változása más hírvivők mentesítési Ca2+ a proteinek foszforilezésén ek más a proteinek foszforilezésén ek transzkripciós gének protein szintézis R transzkripciós gének protein szintézis Első receptor- függő ioncsatornák Második kapcsolt receptorok a G- fehérjék (A metabotrop receptorok) 3. kináz receptorok 4. nukleáris receptor Idővonal: ms Példa: dohányos ACh receptor Idővonal: órák Példa: citokin receptor Idővonal: órák Példa: ösztrogén receptorok Idővonal: másodperc Példa: Muszkarin acetil-kolin-receptor
- 5. meta 12. cél α GDP meta 1 GTP βγ GDP P hidrolízis Kapcsolt receptorok G - fehérje
- 6. Intracelluláris jelátviteli Kapcsolt receptorok a G-fehérje meta 1 2. cél α βγ GDP meta 1 2. cél α βγ GDP GTP meta 1 2. cél α βγ GTP meta 1 2. cél α βγ GDP + P receptor elfoglalt meta aktiváltGTP hidrolizált El s ő 4. H ar m M á s o di k GDP
- 8. Adenilátcikláz AC α βγ GTP ATP tábor tétlen protein kináz A aktív protein kináz A foszfodiészteráz ATP tábor AC fokozott lipolízis ⇣ glikogén szintézis ⇡ glikogén lebomlása ...
- 9. Ca2+ Foszfolipáz C Fos. C α βγ GTP SEN2 DAG IP3 IP4 aktiválás protein kináz C Felszabadulás Unutarst. Ca ++ A belépő Ca ++ a membránon keresztül kalmodulingé n célenzimeinek Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+
- 12. News in Physiol. Sci. 14; 238-242, 1999; a Prof. Ines Drenjančević - Peric 20-HETE és EETS szerepe a vese vaszkuláris tónusának szabályozásában
- 13. α1 Fos. C α βγ GTP SEN2 IP3 IP4 Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ kalmodulingé n Kináz miozin könnyű lánc IP3 Simaizom-sejtek L Ca2+ csatornák függő feszültség Ca2+ csatornák függő ligand ATP ATP Ca2+ csatornák szabályozott állomány Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Tová bb+
- 15. L-arginin NEM eNOS GMP guanilátcikláz cGMP endothel állomás simaizoms ejtek bazális membrán HIR DET ÉS Az endothel relaxáló faktor Ca2+ - kalmodulingén + -
- 16. Fiziológiai humorális szabályozás érszűkítő • noradrenalin • angiotenzin II. • vazopresszin (ADH) • endothelin értágítók bradykinin szerotonin hisztamin prosztaglandinok NO (EDRF) C-natriuretikus peptid Adrenomodulin EDHF (Hiperpolarizációs endoteliális faktor)
- 17. Fiziológiai idegi szabályozás érszűkítő • szimpatikus: NA keresztül α1 α2 értágítók • paraszimpatikus: Ach • szimpatikus: Átmenő β2
- 18. VAZOAKTÍV GYÓGYSZEREK HATÁSAI AZ EREKRE • acetilkolin • L-NAME • indometacin • KOTRIMAZOL • verapamil • NO-donorok • KCI • noradrenalin
- 19. Noradrenalin α1 Fos. C α βγ GTP SEN2 DAG IP3 A protein kináz C aktiválás Unutarst. Ca ++ felszabadulása Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ Ca2+ kalmodulingé n célenzimek IP3 RIP3 Ca2+ Ca2+
- 21. L - N A M E L-arginin NEM eNOS GMP guanilátcikláz cGMP endothel állomás Simaizom sejtek bazális membrán
- 22. Indometacin arachidonsav sav OFJ2 COX AMP adenilátcikláz cAMP endothel állomás simaizomsejt ek - OFJ2 (Prosztaciklin) szerepe az endothelium-függő értágulásban viszonylag kicsi bazális membrán
- 23. Klotrimazol
- 25. A VIZSGÁLAT ELŐKÉSZÍTÉSE • Indító rendszer (37 ° C hőmérséklet, O2 szállítása stb.) • A rendszer kalibrálása • Krebs Henseleit oldat elkészítése • Gyógyszeres terápia
- 26. A szigetelt szervek fürdőinek 4-vero csatornarendszere tartalmazza:: Négycsatornás standard fürdőrendszer szigetelt testekhez (szövetgyűrűk és hevederek) minden tartozékkal (csövek, kábelek stb.) Négycsatornás mérő erősítője izometrikus erőátalakító Szoftver adatgyűjtéshez és feldolgozáshoz Rendszer szoláris rendszer fogadására és átadására az elszigetelt testfürdő rendszerekről a számítógépre (négyszeres, a nyolc csatornarendszerre történő bővítés lehetőségével) 20 l-es víztartály, fűtő- és vízkeringéssel, és 20 - 50 ° C hőmérséklet-szabályozási tartomány és ± 0,1 ° C pontossággal
- 28. Erőátalakító medence, 20 ml Makro és mikrofeszültség beállító csavar
- 30. Hozzávaló Focus / mM Tömeg / g Tömeg / g ionmentes víz - 4 L 6L NaCl 113 27580 41,37 KCI 4.7 1402 2103 kalcium2 x 2H2TOVÁBB 2.5 1470 2205 EDTA 0026 0,0304 0,05 MgSO4 x 6H2TOVÁBB 1.2 1185 1,78 KH2PER4 1.2 0,653 0,98 nátrium-hidrogén3 22 7,395 11.09 Szőlőcukor - 7999 11,99 Krebs - Henseleit oldatban
- 31. GYÓGYSZEREK ELŐKÉSZÍTÉSE A VIZSGÁLATHOZ • A gyógyszereket 20 mM (kivételesen 3M és 2 mM) mennyiségben készítjük el. • 2–3 hónapig tároljuk -20 ° C-on • KCI
- 32. Gyógyszer/hatóanyag Mr. (G / L) Készítmény 20 mM oldat Koncentráció a medencében További hígításra van szükség 20 mM oldat Vol. amely hozzáadódik a medencéhez (μL) KCI 74,56 előkészített 3M 11,3 g / 50 ml 60 mM Nem 400 noradrenalin 205.0 41 mg / 10 ml 10-4 M Tengerimalac: 100 x (10-6) Patkány: 1000x (10-7) 100 acetilkolin 181,7 36,4mg / 10 ml 10-4 M Tengerimalac: 10 x (10-5) Patkány: 100x (10-6) 100 L-NAME 268,0 53,6mg / 10 ml 3x10-4 M Nem 300 indometacin 358,0 71,6mg / 10 ml 10-4 M 10x (10-5 M) 100 klotrimazol 344,8 69 mg / 10 ml 10-4 M 10x (10-5 M) 100 verapamil 491,0 AMP: 5 mg / 2 ml előkészített 2 mM A 4 ml amp. + 6 mlH2TOVÁBB 20 μM Nem 200 * Az oldószer Indometasin 96% etanol vagy DMSO / gyártótól függően.
- 33. Éܷ
- 37. SZABVÁNYOS PROTOKOLL 1. A véredények stabilizálása 2. A kezdeti összehúzódás előtti vizsgálat 3. Endothelialis intaktitásvizsgálat 4. Vaszkuláris aktivációs teszt
- 38. A véredény stabilizálása (60 perc) Vérerek feszültsége 20 mN A véredény feszültségét több alkalommal 20 mN-ra (vagy 0 mN-ra korrigáljuk, ha a rendszer alapvetően - 20 mN) korrigálja Ebben az időszakban a medencéket 3-4 alkalommal (kb. 15 percenként) mossuk
- 39. 2. A kezdeti összehúzódás előtti vizsgálat 400μL 3M KCI (60 mM) Öblítés Öblítés Öblítés 4 perc 1 perc 1 perc 1 perc 3 x
- 40. 3. Endothelialis intaktitásvizsgálat 100μL 1000x osztály. 20 mM noradrenalin (10-7M) 100μL 100x Class. 20 mM acetilkolin (10-6M) Öblítés4 min 1 perc 1 perc Öblítés Öblítés 4 min
- 41. 4. Vaszkuláris aktivációs teszt 100μL 1000x osztály. 20 mM noradrenalin (10-7M) értágító különböző dózisokban 4 min
- 43. ADATFELDOLGOZÁS A vasodilatáció% -ának kiszámításához használt képlet ..
- 44. x0 xmax x3 Értágulat% = xmax - X3 xmax - X0 % Fennmaradó összehúzódás = x3 - X0 xmax - X0 értágulat
- 45. A KÍSÉRLET Példa egy vizsgálatra: A hiperbár terápia hatása a DM patkányvezető véredényekre
- 46. 24 patkány 12 Ctrl. (ellenőrzés) 12 DM (cukorbetegség, kezelt STZ) 6 Ctrl. 6 Ctrl. + citrát 6 DM 6 DM + HOBT L-NAME klotrimazol Els ő Má so dik Ctrl. + HBOT
- 47. Csoport GUK (mmol/ L) Súly (g) A rendszer amelyben működik Megjegyzések Címke gyűrűk A - Ellenőrző citrát (A felesleges 10.08.2009., TH: 09.09.2009, 90 mg) a1 9.7 310 ÉS. Az aorta ráncos volt és eltorzult A1a 1-4 A1B 9.7 320 II. A1B 1-4 A1c 9.7 305 ÉS. Az aorta ráncos volt és eltorzult A1c 1-4 A2A 11.3 310 ÉS. 2a 1-4 A2b 10 290 II. Problémák a kísérlet során - a tartály hosszabb ideig száraz volt, nem volt előkészítve 2b 1-4 A2c hiányzik szalagok 300 II. A2c 1-4 B - a kezeletlen kontroll (A felesleg 12.08.2009.) B1a 9.3 360 ÉS. B1a 1-4 B1b 8.6 320 II. B1b 1-4 B1c 10.9 305 ÉS. B1b 1-4 B2a 9.5 350 ÉS. A szérum leolvasztása A2a, A2b és B2b-vel együtt – hagyjuk, hogy Danini hagyjon 0,5 ml-t az oxigénnek. B2a 1-4 b2b 10.7 285 II. A szérum dehidratálással hígítható b2b 1-4 B2 10.3 280 ÉS. b2c 1-4 C - Cukorbetegek + HBTh (A felesleg 2009/07/25., TH: 09.09.2009, 90 mg) C1a > 33 250 ÉS. 1-4 C1a C1b > 33 285 II. C1b 1-4 C1c 8 290 II. C1c 1-4 C2 > 33 225 ÉS. 1-4 C2a C2b > 33 250 II. C2b 1-4 c2c > 33 225 II. C2C 1-4 D - Cukorbetegek kezeletlen (A felesleg 01.08.2009., TH: 09.09.2009, 90 mg) D1A > 33 250 ÉS. D1A 1-4 D1b 7.8 320 II. D1b 1-4 D1c > 33 210 II. D1c 1-4 D2a > 33 200 ÉS. D2a 1-4 D2B > 33 170 II. D2b 1-4 D2C 10.2 300 ÉS. Fűt a szérum + fehér fehér vérrög D2C 1-4
- 48. A kezdeti összehúzódás előtti vizsgálat 400μL 3M KCI (60 mM) Öblítés Öblítés Öblítés 4 perc 1 perc 1 perc 1 perc 3 x
- 50. A: kontrol. C: cukorbetegség. + HBTh 10 perc
- 51. A: kontrol. C: cukorbetegség. + HBTh
- 53. Ach 10 percig. után az L-NAME
- 54. Ach 10 perc klotrimazol után