Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita e differenziazione in vitro di cellule
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Il documento tratta della modellazione matematica e dei codici di simulazione per la proliferazione e differenziazione in vitro delle cellule nell'ambito dell'ingegneria tissutale. Vengono esplorate varie tecniche di coltivazione cellulare e l'uso di bioreattori, nonché la creazione e validazione di modelli matematici per ottimizzare i processi di ingegneria tissutale. Infine, sono presentati esempi applicativi e potenziali campi di applicazione nel settore biomedico.
Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita e differenziazione in vitro di cellule
- 1. Modellazione matematica e codici di simulazione per la proliferazione, crescita e differenziazione in vitro di cellule Massimo Pisu CRS4 - Programma Bioingegneria - Settore Biomedicina massimo@crs4.it
- 2. Indice degli argomenti • Breve introduzione all’Ingegneria tissutale • Coltivazioni cellulari e bioreattori • Modellazione matematica e simulazione • Risultati ottenuti: alcuni esempi • Potenziali applicazioni
- 3. Ingegneria Tissutale: Definizione «L’Ingegneria Tissutale è un campo interdisciplinare della bioingegneria che applica diversi principi dell’ingegneria e delle scienze biologiche allo scopo di ripristinare, mantenere o migliorare funzioni di tessuti o organi» R. Langer and J.P. Vacanti, Science (1993)
- 4. Causa patologie e terapie correnti • L’organo/tessuto può essere danneggiato per patologie, anomalie congenite, incidenti, interventi chirurgici • Attualmente, per la cura di questi difetti del tessuto, si procede col trapianto d’organo o inserimento di altro tessuto dello stesso paziente, inserimento di dispositivi artificiali e trattamento farmacologico
- 5. Paradigma dell’Ingegneria Tissutale cellule coltivazione in vitro tessuto ingegnerizzato scaffold
- 6. Esempio di ingegneria tissutale P. Bianco, Nature, 2001
- 7. Stato dell’arte J. Vacanti, J. Pediatric Surgery, 2010
- 8. Stato dell’arte-2 Roberto Tozzi, PhD Thesis, 2010
- 9. Cellule: classificazione Autologhe Cellule Singeniche per Allogeniche impianto Xenogeniche
- 10. Tipi di cellule Condrociti Osteoblasti Specializzate Endoteliali Cellule Non specializzate Epatociti (Staminali) ……..
- 11. Cellule staminali • TOTIPOTENTI: in grado di differenziare in tutti i tipi di cellule. • PLURIPOTENTI: possono specializzarsi in tutti i tipi di cellule che troviamo in un individuo adulto ma non in cellule che compongono i tessuti extra-embrionali. • MULTIPOTENTI: sono in grado di specializzarsi unicamente in alcuni tipi di cellule. • UNIPOTENTI: capaci di differenziarsi in un unico tipo cellulare.
- 12. Matrice extracellulare (ECM) Nei tessuti connettivi • Glicoproteine • Proteoglicani • Acido ialuronico • Minerali Proteine (collagene, elastina, fibrina), Glicosaminoglicani (GAG), Minerali (idrossiapatite) L’ECM può fungere da deposito di fattori di crescita. Svolge la funzione di supporto delle cellule e del loro ancoraggio e di divisione tra i diversi tessuti
- 13. Scaffold È un supporto (impalcatura) di tipo organico o inorganico, naturale o artificiale, polimerico o non. Funzioni principali dello scaffold • Conferire la forma 3D desiderata del tessuto • Stimolare la proliferazione cellulare e quindi di ECM • Mantenere le proprietà meccaniche del tessuto impiantato prima della biodegradazione in vivo.
- 14. Scaffold: caratteristiche ideali Bio- compatibilità Bio- degradabilità Porosità Proprietà in vivo controllata Garantire adesione cellulare
- 15. Scaffold: morfologia Fibroso Spugnoso Gelatinoso
- 16. Coltivazione in vitro Fasi • Prelievo (biopsia) • Isolamento (washing, filtrazione, centrifuga) • Seeding su scaffold • Espansione/crescita/differenziazione Analisi e caratterizzazione • Preparazione cellule da analizzare (trypsina/EDTA) • Conta cellulare attraverso Emocitometro (Camera di Burker) • Distribuzione/conta cellulare con Coulter Counter • Caratterizzazione del fenotipo con Citofluorimetro a flusso
- 17. Sistemi di coltivazione in vitro • Sistemi di espansione in statico (piatti di petri, well plates, flask) • Sistemi di espansione in dinamico (bioreattori di vari tipi) I bioreattori consentono il raggiungimento di alte densità cellulari (108/cm3) rispetto a quelle dei sistemi statici (106/cm3)
- 18. Vantaggi di un bioreattore Un bioreattore consente di: • Potenziare il trasporto dei nutrienti all’interno della coltura • Produrre degli stimoli fisico-chimici necessari • Monitorare e regolare i parametri fisico- chimici in tempo reale • Produzione su larga scala di cellule e tessuti
- 22. Modellazione matematica La modellazione matematica e la simulazione computazionale hanno lo scopo di: • Riduzione dei costi della sperimentazione • Progettazione di apparecchiature • Ottimizzazione delle condizioni operative
- 23. Modellazione matematica-2 I modelli matematici e i codici di calcolo sviluppati dal Programma di Bioingegneria del CRS4 sono basati principalmente su: • Principi di conservazione della massa (specie coinvolte, ossigeno, nutrienti, ECM, GFs) • Bilancio di popolazione (sulle cellule) - I bilanci descrivono l’evoluzione temporale/spaziale delle specie coinvolte in termini di concentrazione, numero e dimensione delle cellule (massa / dimensione caratteristica / diametro). - I bilanci contengono termini diffusionali, reattivi (consumo nutrienti, ossigeno, consumo o produzione di GFs), crescita e divisione cellulare, trasformazione (differenziazione)
- 24. Modellazione matematica-3 • Le equazioni del modello sono implementate in un codice di calcolo scritto in linguaggio FORTRAN • La risoluzione numerica dei sistemi differenziali o algebrico-differenziali risultanti viene effettuata tramite librerie matematiche standard (esempio IMSL) • Un singolo run di calcolo, in base alla complessità, può richiedere pochi minuti o parecchie ore. • Il modello viene validato mediante confronto diretto con i dati sperimentali disponibili.
- 25. Sistemi investigati • Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate; • Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e osteoblasti (tessuto connettivo/osseo); • Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti (tessuto non connettivo); • Espansione di MSC (cellule ovine); • Espansione di condrociti ovini; • Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC
- 26. Esempi di applicazione: I Espansione di condrociti e cartilagini ingegnerizzate Coltivazioni in sistema dinamico (bioreattore NASA commissionato per il MIT) , utilizzo di condrociti articolari bovini, scaffolds PGA, soluzione di nutrienti a base di Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)
- 27. Cartilagini ingegnerizzate Culture Culture medium bulk medium Sterile gas a incubator Culture medium z Scaffolds h/2 d/2 b 0 y q x z r h/2 d d/2 c 0 r d
- 28. Cartilagini ingegnerizzate-2 Modello matematico
- 29. Cartilagini ingegnerizzate-3 Modello matematico-2
- 30. Cartilagini ingegnerizzate-4 PO2=80 mm hg t=10 days
- 31. Cartilagini ingegnerizzate-5 PO2=40 mm hg t=5 weeks
- 32. Cartilagini ingegnerizzate-6 Coltivazione su bioreattore con PO2=80 mm hg
- 33. Cartilagini ingegnerizzate-7 Sistema statico, flask, condrociti articolari bovini , DMEM, scaffolds PGA
- 34. Cartilagini ingegnerizzate-8 Sistema statico, well plates, condrociti articolari bovini,DMEM, scaffolds PGA/PLA
- 35. Esempi di applicazione: II Espansione e differenziazione di MSC in condrociti e osteoblasti (tessuto connettivo/osseo) Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule mesenchimali umane, soluzione di nutrienti DMEM, uso di fattori di crescita TGF-b superfamily, CDMP-1
- 36. Espansione e differenziazione di MSC
- 37. Espansione e differenziazione di MSC-2 Modello matematico
- 38. Espansione e differenziazione di MSC-3 Modello matematico-2
- 39. Espansione e differenziazione di MSC-4 Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b superfamily
- 40. Espansione e differenziazione di MSC-5 t=21 days Sistema statico, petri dishes, cellule mesenchimali umane, DMEM, TGF-b1 e CDMP-1
- 41. Espansione e differenziazione di MSC-6 Simulazione qualitativa dell’evoluzione di una guarigione da frattura
- 42. Esempi di applicazione: III Espansione e differenziazione di CNSSC in astrociti (tessuto non connettivo) Coltivazione in sistemi statici, cellule CNSSC murine, aggiunta di LIF, Activin-A
- 43. Espansione e differenziazione di CNSSC
- 44. Espansione e differenziazione di CNSSC-2 Modello matematico
- 45. Espansione e differenziazione di CNSSC-4 Sistemi statici, CNSSC murine, aggiunta di LIF
- 46. Espansione e differenziazione di CNSSC-5 Coltivazione con aggiunta di LIF + Activin A
- 47. Espansione e differenziazione di CNSSC-6 t=3 days Coltivazione con aggiunta di Activin A
- 48. Esempi di applicazione: IV Espansione di MSC (cellule ovine) Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, cellule ovine, soluzione di nutrienti a base di MEM (Minimum Essential Medium Eagle)
- 49. Espansione di MSC (cellule ovine) Modello matematico
- 50. Espansione di MSC (cellule ovine)-2 Sistema statico, petri dishes, medium Minimum Essential Medium Eagle (MEM)
- 51. Esempi di applicazione: V Espansione di condrociti ovini Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione di nutrienti a base di DMEM
- 52. Espansione di condrociti ovini Modello matematico
- 53. Espansione di condrociti ovini-2 Sistema statico, petri dishes, medium DMEM
- 54. Espansione di condrociti ovini-3
- 55. Esempi di applicazione: VI Effetto di alcuni farmaci sull’espansione di HUVEC Coltivazione in sistemi statici, petri dishes, soluzione di nutrienti a base di EBM (Endothelial Basal Medium) + EGM-2 (Endothelial Cell Growth Medium)
- 56. Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC Modello matematico
- 57. Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-2 Sistema statico, petri dishes, Endothelial Basal Medium (EBM) + Endothelial Cell Growth Medium (EGM-2)
- 58. Effetto farmaci sull’espansione di HUVEC-3
- 59. Possibili campi di applicazione L’approccio modellistico presentato può essere utilizzato in diversi campi della biomedicina: • Ingegneria Tissutale; • Medicina rigenerativa; • Coltivazione cellulare per Terapia Genica; • Studio dell’evoluzione di masse tumorali.
- 60. Riferimenti bibliografici • R. Langer e J.P. Vacanti. Tissue engineering. Science, 260, 920-926, (1993). • L.E. Freed e G. Vunjak-Novakovic. Tissue engineering of cartilage. In: J.D. Bronzino, ed. The Biomedical Engineering Handbook. New York: CRC Press, 1995, pp. 1788– 1806, (1995). • G. Vunjak-Novakovic, L.E. Freed, R.J. Biron e R. Langer. Effects of mixing on the composition and morphology of tissue engineered cartilage. AIChE J 42, 850, (1996). • B. Obradovic, J.H. Meldon, L.E. Freed e G. Vunjak-Novakovic. Glycosaminoglycan deposition in engineered cartilage: experiments and mathematical model. A.I.Ch.E. Journal 46, 1860, (2000). • M. Satoh, H. Sugino e T. Yoshida. Activin promotes astrocytic differentiation of a multipotent neural stem cell line and an astrocyte progenitor cell line from murine central nervous system. Neuroscience Letters 284, 143–146, (2000). • P. Bianco. Stem cells in tissue engineering. Nature, 414,118-121, (2001).
- 61. Riferimenti bibliografici-2 • F. Barry, R.E. Boynton, B. Liu e J.M. Murphy. Chondrogenic differentiation of mesenchymal stem cells from bone marrow: differentiation-dependent gene expression of matrix components. Exp. Cell Res. 268, 189–200, (2001). • C.G. Wilson, L.J. Bonassar e S.S. Kohles. Modeling the dynamic composition of engineered cartilage. Arch. Biochem. Biophys. 408, 246, (2002). • M. Pisu, N. Lai, A. Cincotti, F. Delogu e G. Cao. A simulation model for the growth of tissue engineered cartilage on polymeric scaffolds. Journal of Chemical Reaction Engineering, http://www.bepress.com/ijcre/vol1/A38, (2003). • M. Pisu, N. Lai, A. Cincotti, A. Concas e G. Cao. Modeling of engineered cartilage growth in rotating bioreactors. Chemical Engineering Science, 59, 5035-5040, (2004). • X. Bai, Z. Xiao, Y. Pan, J. Hu, J. Pohl, J. Wen e L. Li. Cartilage-derived morphogenetic protein-1 promotes the differentiation of mesenchymal stem cells into chondrocytes. Biochem, Biophys. Res. Commun. 325, 453–460, (2004).
- 62. Riferimenti bibliografici-3 • M. Pisu, A. Concas, N. Lai e G. Cao. A novel simulation model for engineered cartilage growth in static systems. Tissue Engineering, 12, 2311-2320, (2006). • M. Pisu, A. Concas e G. Cao. A novel simulation model for stem cells differentiation. Journal of Biotechnology. 130, 171-182, (2007). • M. Pisu, A. Concas, S. Fadda, A. Cincotti e G. Cao. A simulation model for stem cells differentiation into specialized cells of non-connective tissues, Journal of Computational Biology and Chemistry. 32, 338-344, (2008). • L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, M. Pisu, A. Cincotti, M. Arras, E. Desogus, F. Piras, G. Piga, G. La Nasa e G. Cao. Experimental analysis and modeling of in vitro mesenchymal stem cells proliferation. Cell Proliferation, 42,602-616 (2009). • L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, A. Cincotti, M. Pisu, A. Concas e G. Cao. Experimental analysis and modelling of bone marrow mesenchimal stem cells proliferation. Chemical Engineering Science, 65, 562-568 (2010).
- 63. Riferimenti bibliografici-4 • L. Mancuso, M.I. Liuzzo, S. Fadda, M. Pisu, A. Cincotti, M. Arras, G. La Nasa, A. Concas e G. Cao, In vitro ovine articular chondrocytes proliferation: experiments and modeling. Cell Proliferation, 43, 310-320 (2010). • L. Mancuso, M. Scanu, M. Pisu, A. Concas e G. Cao. Experimental analysis and modeling of in vitro HUVECs proliferation in the presence of various types of drugs. Cell Proliferation, 43, 617-628 (2010). • J. Vacanti. Tissue engineering and regenerative medicine: from first principles to state of the art, Journal of Pediatric Surgery, 45, 291–294, (2010). • R. Tozzi. Nuovi Idrogeli per l'Ingegneria Tissutale ed il Drug Delivery, Dipartimento farmaceutico, Università di Parma. PhD Thesis, http://hdl.handle.net/1889/1437 (2010).