More Related Content
What's hot (20)
Similar to Presentation1 (20)
Presentation1
- 1. TRANSGENIC PLANTS EXPRESSING ANTIMICROBIAL LACTOFERRIN PROTEIN ARE RESISTANT TO A Tanaman transgenik FUNGAL PATHOGEN Mengekspresikan Protein Antimicrobial Laktoferin yang Tahan terhadap patogen jamur SEMINAR JURNAL CREATED By...: 1. M.Anas Muttaqin 2. Atik Nur syarifah 3. Dwi Rohmiyati 4. Tri Yulianti 5. Haibatun Nisa
- 2. TRANSGENIC PLANTS EXPRESSING ANTIMICROBIAL LACTOFERRIN PROTEIN ARE RESISTANT TO A FUNGAL PATHOGEN Trung C. NGUYEN, Dilip K. LAKSHMAN, Jigang HAN1, Leny C. GALVEZ, Amitava MITRA* 1Department of Plant Pathology, University of Nebraska Lincoln, NE 68583, USA and 2USDA-ARS, Sustainable Agricultural Systems Laboratory, Beltsville, MD, USA.
- 3. ABSTRAK... Tembakau (Nicotiana tabacum var Xanthi) dan Arabidopsis (Arabidopsis thaliana) merupakan tanaman transgenik yang mengekspresikan sebuah antimikroba bovine laktoferin (BLF). Gen ini dikembangkan dan dievaluasi karena ketahanannya melawan jamur Rhizoctonia solani. Dimana jamur ini bersifat patogen, agen penyebab penyakit rebah. Tanaman ini diubah dengan Agrobacterium strain C58C1 yang mengandung konstruksi plasmid membawa BLF dan dimodifikasi menjadi cDNA. introgresi dari BLF cDNA ke tembakau rentan dan garis Arabidopsis thaliana dikonfirmasi oleh Southern blot dan ekspresi full-length transkrip laktoferin dan protein masing-masing terdeteksi oleh blot Utara dan blot Barat. Baris transgenik memisahkan penyisipan lokus tunggal yang telah diidentifikasi dan digunakan untuk tes tahan penyakit. Tanaman tembakau transgenik menunjukkan tingkat resistensi tinggi terhadap Rhizoctonia solani dalam tes daun terpisah. Demikian pula, bibit transgenik Arabidopsis thaliana resisten terhadap jamur dan mencegah gejala damping off. Penggunaan gen laktoferin adalah salah satu pendekatan baru yang potensial untuk mempertimbangkan pengendalian penyakit yang disebabkan oleh patogen jamur. Kata kunci: Arabidopsis, tahan penyakit, transformasi, Rhizoctonia.
- 4. PENDAHULUAN Pada tahun 2000 sebanyak 90 % tanaman di daerah Amerika serikat terserang penyakit yang disebabkan oleh pathogen yang menyebabkan kebusukan pada akar. Pathogen terbesar yang menyerang tanaman tingkat tinggi sebanyak 188 spesies ( 32 famili) termasuk juga tanaman hias dan rumput rumputan adalah jamur Rhizoctonia solani Selain itu jamur tersebut juga menyerang jaringan tanaman timbul beberapa penyakit
- 5. LANJUTAN....... Pembusukan akar tanaman yang disebabkan oleh jamur Rhizoctonia solani umumnya dapat diatasi sejak kemunculan benih dengan cara fungisida, fumigasi tanah, biologi dan budaya praktek (bioteknologi ) Penggunaan fungisida sebenarnya bisa diandalkan tetapi pestisida yang termasuk dalam golongan fungisida dapat bersifat racun dan merusak lingkungan dan menyebabkan pathogen tersebut resisten terhadap pestisida. ( misal : methyl bromide)
- 6. Beberapa jenis fungisida ada yang dilarang penggunaannya. Karena keterbatasan fungisida yang cocok terhadap tanaman holtikultura yang terserang jamur Rhizoctonia solani maka alternatif yang banyak dijadikan pilihan adalah praktek menejemen alternatif (bioteknologi )
- 7. Alternatif bioteknologi tanaman transgenik diinduksikan dengan gen Rhizoctonia solani menyebabkan tanaman transgenik tersebut mempunyai resistensi terhadap jamur tersebut. Penggunaan tanaman transgenik mempunyai banyak keuntungan diantaranya : Konsumsi oleh manusia lebih aman dengan tambahan nilai gizi. Tanaman transgenik yang digunakan adalah Nicotiana tabacum dan Arabidopsis thaliana yang mengekspresikan bovine laktoferin (BLF) sebagai antimikroba terhadap jamur Rhizoctonia solani
- 8. BAHAN DAN METODE Bahan 1. Gen laktoferin bovine 2. Tembakau (Nicotiana tabacum var Xanthi) 3. Arabidopsis thaliana 4. Agrobacterium (strain C58CI) 5. Agrobacterium galur EHA 105 6. Virus mosaik kembang kol 35S 7. Plasmid biner pAM4212 8. Kertas filter steril 9. Cawan petri steril 10. Lampu neon 11. Pot 12. Medium agar
- 9. Metode: 1. Konstruksi dari vektor dan pengembangan tanaman transgenik, dengan menggunakan metode: a. metode kokultivasi yang di gunakan untuk transformasi tanaman tembakau b. Metode plant floral dip untuk mentransformasikan Arabidopsis 2. Persiapan pembiakan dan inokulum dari isolasi patogen R.solani 3. Analisis ekspresi laktoferin pada tanaman transgenik 4. Bioassay untuk in vitro dan in vivo dari tanaman transgenik yang resisten terhadap ekspresi laktoferin 5. Germinasi biji selama keluar dari perkecambahan
- 10. Kontruksi vektor dan pengembangan tanaman transgenik sebuah vektor biner yang mengandung gen laktoferin bovine digunakan untuk transformasi tembakau dan Arabidopsis thaliana. Gen laktoferin didukung oleh promotor virus mosaik kembang kol 35S dan urutan DNA Agrobacterium sp.T-DNA digunakan sebagai sinyal terminasi transkripsi menciptakan pAM 4212 plasmid biner. Plasmid dipindahkan ke Agrobacterium sp.galur EHA 105 untuk transformasi tanaman. Metode kokultivasi digunakan untuk transformasi tembakau. Tanaman Arabidopsis thaliana ditransformasi dengan metode planta floral dip.
- 11. kultur dan preparasi inokulum dari isolasi patogen R. Solani R.solani AG-4 dipertahankan dalam medium agar potato dextrose (DIFCO, detroit, MI). Inokulum R.solani untuk bioassay tanah dibuat dengan menambahkan 10 busi tumbuh. Jamur pertumbuhan aktif dalam 200gr gandum di autoklaf dengan kelembapan 15-20% dan diinkubasi 2 minggu. Gandum yang telah kering, disaring dan disimpan pada suhu 4尊C dalam botol plastik steril untuk inokulasi tanah. Analisis ekspresi laktoferin pada tanaman transgenik
- 12. Bioassay untuk in vitro dan in vivo tanaman transgenik resisten mengekspresikan laktoferin uji difusi agar gel : total protein terlarut dari daun transgenik dan kontrol di ekstrak. R.solani ditempatkan ditengah agar berdiameter 5mm. Sampel ditambahkan ke dalam setiap sumur perifer potato agar dextrosa dan di inkubasi selama 4 hari pada suhu kamar. Masing masing perlakuan 3 kali ulangan dan seluruh percobaan diulang sekali lagi. Diamati dan difoto ketika jamur di piring kontrol mencapai pinggir. Daun assay terpisah keseluruhan : daun ditempatkan pada kertas filter steril yang lembab di cawan petri steril. R.solani ditempatkan di tengah setiap daun. Daun difoto pada hari ke 3,4,5,7,dan 9 setelah inokulasi dengan plug miselium. Inokulasi dilakukan dalam 3 kali ulangan dan daun di inkubasi dalam ruang lembab di bawah lampu neon pada suhu kamar dengan cara acak.
- 13. Perkecambahan biji untuk bibit dumping off Pot plastik berisi tanah yang diinokulasi / tidak diinokulasi di taburi benih Arabidopsis thaliana transgenik. Pot di inkubasi pada suhu 22尊, kelembapan relatif 75-80% dan 16 h (7350 lx) dengan iluminasi irigasi setiap hari dengan air steril.
- 14. HASIL Pengembangan jalur transgenik Lima baris transgenik dari setiap tembakau dan Arabidopsis thaliana membawa satu salinan gen BLF dengan tingkat ekspresi tertinggi protein BLF terpilih. Ekspresi BLF pada tanaman transgenik Dua baris Arabidopsis thaliana menunjukkan potongan transkrip BLF dan garis satunya tidak memiliki transkrip BLF. Hasil percobaan immuno-blotting dengan BLF antibodi spesifik menunjukkan bahwa kedua tembakau dan Arabidopsis thaliana mengekspresikan BLF.
- 15. PENGHAMBATAN IN VITRO B dan D menunjukkan ekstrak dari dua tembakau transgenik yang tidak mengekspresikan protein BLF. A dan C merupakan ekstrak tembakau transgenik yang mengekspresikan BLF Efek penghambatan pada A dan C terlihat jelas, sedangkan B dan D tidak terlihat.
- 16. PELEPASAN BIO-ASSAY DAUN TEMBAKAU Penghambatan in vitro R.solani dengan ekstrak protein tembakau transgenik dan Arabidopsis thaliana yang mengekspresikan protein lactoferin sembilan hari setelah inokulasi Daun transgenik tidak menunjukkan nekrosis yang terlihat selama 5-6 hari. Wilayah nekrotic pada hari ke-7 terlihat kecil, dan sedikit meningkat pada hari ke-9. tetapi meningkat dengan cepat setelah hari kesepuluh, dan menutupi seluruh daun selama dua hari berikutnya.
- 18. BIBIT ARABIDOPSIS YANG MENGEKSPRESIKAN BLF Benih perkecambahan tanaman Arabidopsis thaliana transgenik dan Arabidopsis thaliana kontrol sebanding, tetapi pembentukan bibit kontrol dipengaruhi oleh Rhizoctonia solani. Kebanyakan bibit dalam pot kontrol mati setelah perkecambahan, tetapi bibit transgenik tumbuh normal dan menunjukkan perlawanan terhadap Rhizoctonia solani. Resistensi terhadap Rhizoctonia solani telah ditetapkan disemua Arabidopsis thaliana transgenik yang mengekspresikan lactoferin.
- 19. Transgenik kontrol transgenik kontrol
- 20. PEMBAHASAN Melalui percobaan secara in vitro diketahui bahwa BLF menghambat pertumbuhan patogen pada tanaman yang disebabkan oleh jamur Rhizoctonia solani Selain itu ekspresi BLF pada tanaman transgenik ( Nicotiana tabacum dan Arabidopsis thaliana ) lebih resistensi terhadap patogen sehingga tidak terjadi kemajuan penyakit. Meskipun tanaman tersebut merupakan tanaman transgenik namun tidak merubah morfologi dan fisiologi tanaman tersebut.
- 21. BLF menghambat bakteri phytopatogenetik. Melindungi tumbuhan yang paling penting adalah pada saat perkembangan awal bibit agar tidak terinfeksi oleh jamur Rhizoctonia solani Memperlambat perkembangan penyakit yng disebabkan oleh jamur dengan cara genetik dan aplikasi penggunaan pestisida yang ramah lingkungan. Arabidopsis thaliana yang ditransgenik kan dari bibit sampai tumbuh mempunyai perlindungan yang lengkap terhadap efek jamur Rhizoctonia solani
- 22. KESIMPULAN Intinya penanggulangan tumbuhan yang terkena penyakit yang disebabkan oleh jamur R.solani dapat diatasi dengan cara BLF (Bovine laktoferin ) yang dihasilkan dari tanaman transgenik. Kelebihan penggunaan tanaman transgenik selain untuk menanggulangi penyakit juga berperan untuk menambah nilai gizi bagi manusia.