Baltymų biologija nauja
- 1. Baltymų biologija Martyna Petrulytė Lietuvos Sveikatos Mokslų Universitetas
- 2. Baltymai ▲ Baltymai - tai polimerinės medžiagos, sudarytos iš monomerų – aminorūgščių, kurias jungia peptidiniai ryšiai: ~N-C-(C=O)~N-C-(C=O)~N-C-(C=O) ~ Jie susidaro tarp karboksilo (-COOH) grupės vienoje aminorūgšties molekulėje ir aminogrupės (-NH2) – kitoje. ▲ Šios reakcijos metu atskyla vandens molekulė, tai vadinama dehidratacijos reakcija (polikondensacija).
- 3. Baltymų klasifikacija Pagal cheminę sudėtį skirstomi į paprastuosius (proteinus) ir sudėtinius (proteidus). ▲ Paprastiems baltymams priskiriami tik tie baltymai, kurie sudaryti vien tik iš aminorūgščių. ▲ Sudėtiniams baltymams priskiriami baltymai, turintys nepeptidinę dalį, kaip pavyzdžiui: lipoproteinai turi lipidinę grupę, glikoproteinai – angliavandenio liekaną, metaloproteinai - metalo atomą, chromoproteinai - pigmentinę grupę.
- 4. Sudėtiniai baltymai Sudėtinių baltymų struktūroje aptinkama nebaltyminė dalimis. ▲ Jei ši dalis yra tvirtai prijungta prie molekulės ir baltymui atliekant savo funkcijas ji neatsiskiria, tai ši grupė vadinama prostetine grupe. Pvz., hemo prostetinė grupė hemoglobine. ▲Jei, baltymui atliekant savo funkcijas, nebaltyminė dalis tai prisijungia, tai atsiskiria nuo baltymo, ji vadinama kofaktoriumi. Kofaktorius – į fermento sudėtį įeinanti nebaltyminės kilmės nedidelės molekulinės masės organinė medžiaga ar jonas, būtina fermento veikimui. Jei kofaktorius yra organinės kilmės, jis vadinamas kofermentu (coenzyme).
- 5. Sudėtiniai baltymai Baltymas be savo prostetinės grupės arba kofermento vadinamas apoenzimu (apofermentu), o baltymas su prisijungusia grupe – holoenzimu (holofermentu).
- 6. Baltymų klasifikacija Pagal struktūrą, t.y. polipeptidinių grandinių skaičių skirstomi į: ▲ jei molekulėje yra viena polipeptidinė grandinė, tai baltymas vadinamas monomeriniu; ▲ jei molekulėje yra dvi polipeptidinės grandinės, baltymas vadinimas dimeriniu; ▲ jei molekulėje yra daugiau nei dvi polipeptidinės grandinės, baltymas yra oligomerinis baltymas (trimerinis, jei grandinės 3; tetramerinis - jei 4, pentamerinis, jei 5 ir t.t. )
- 7. Baltymų klasifikacija Pagal molekulės formą: ▲ Globuliniai baltymai – netaisyklingai ovalios arba elipsiškos molekulės. ▲ Fibriliniai baltymai –siūlo formos molekulės; ▲Membraniniai baltymai, nuo vieno iki kelių kartų perveriantys membraną ir turintys skirtingas struktūras membranoje ir membranos išorėje. Pvz., rodopsinas.
- 8. Baltymų klasifikacija Globuliniai baltymai ▲ Globulinių baltymų ilgio ir pločio santykis yra mažesnis nei 10 kartų. ▲ Globuliniams baltymams būdingas kompaktiškas polipeptidinių grandinių susisukimas. Forma – sferinė arba elipsinė. ▲ Gerai tirpsta vandenyje, nesunkiai difunduoja. ▲Šių baltymų pavyzdžiai yra hemoglobinas, insulinas, pepsinas. Fibriliniai baltymai ▲ Fibrilinių baltymų ilgio ir pločio santykis didesnis nei 10 kartų. ▲ Fibriliniai baltymai paprastai susideda iš kelių polipeptidinių grandinių, kurios susijungia tarpusavyje kovalentiniais ir vandeniliniais ryšiais. Forma – siūlinė. ▲ Blogai tirpsta vandenyje,. ▲ Fibrilinių baltymų pavyzdžiai yra kolagenas, keratinas, fibrinogenas.
- 10. Membraninių baltymų klasifikacija ▲ Transportiniai baltymai (kanalai ir nešikliai) ▲ Receptoriai ▲ Fermentai ▲ Linkeriai (sujungia atskirus baltymus, taip sudarydami sąlygas jiems veikti kartu) ▲ ąٱė tapatumo žymenys
- 11. Baltymai palaiko pastovų pH (veikia kaip buferiai)
- 12. Baltymai palaiko pastovų pH (veikia kaip buferiai) Priklausomai nuo terpės pH, baltymai gali turėti suminį nulinį, teigiamą arba neigiamą krūvį. Skirtingai nuo aminorūgščių, jonizuotų karboksilo grupių ar aminogrupių baltymų makromolekulėse yra labai daug.
- 14. Aminorūgštys ▲ Nuo peptidinės grandinės karkaso (backbone) į šonus nusitęsia aminorūgščių dalys, vadinamos šoninėmis arba R- grupėmis (side chains): -N-C-C-N-C-C-N- ▲ąٱėe dažniausiai aptinkama 20 skirtingų aminorūgščių. Neseniai atrastos dar dvi - selenocisteinas ir pirolizinas, tačiau jos aptinkamos retai.
- 15. Aminorūgštys ▲ Dauguma aminorūgščių tirpaluose egzistuoja cviterijonų pavidalu, t.y., turi ir teigiamą ir neigiamų krūvį. ▲ Aminorūgšties krūvis priklauso nuo terpės pH. Tirpalo pH reikšmė, kuriai esant dalelė netenka krūvio, t.y., tampa neutrali, vadinama izoelektriniu tašku (pI). Tai reiškia, jog aminorūgštyje yra vienodas teigiamų ir neigiamų jonų krūvių skaičius. ▲ Paprastai gamtoje būna tik L- konfigūracijos aminorūgštys.
- 16. Aminorūgštys Aminorūgštis Santru mpa Poliškumas Alaninas Ala Nepolinė Argininas Arg Polinė (bazinė) Asparaginas Asn Nepolinė Asparto rūgštis Asp Polinė (rūgštinė) Cisteinas Cys Nežymiai polinė
- 17. Aminorūgštys Aminorūgštis Santru mpa Poliškumas Glutamo rūgštis Glu Polinė (rūgštinė) Glutaminas Gln Nepolinė Glicinas Gly Nepolinė Histidinas His Polinė (bazinė) Izoleucinas Ile Nepolinė
- 18. Aminorūgštys Aminorūgštis Santrumpa Poliškumas Leucinas Leu Nepolinė Lizinas Lys Polinė (šarminė) Metioninas Met Nepolinė Fenilalaninas Phe Nepolinė Prolinas Pro Nepolinė
- 19. Aminorūgštys Aminorūgštis Santrumpa Poliškumas Serinas Ser Nežymiai polinė Treoninas Thr Nežymiai polinė Triptofanas Trp Nežymiai polinė Tirozinas Tyr Nežymiai polinė Valinas Val Nepolinė
- 20. Erdvinė struktūra Baltymų erdvinė struktūra susideda dažniausiai iš trijų lygmenų (nors gali būti ir keturi): ▲ Pirminė struktūra - tai aminorūgščių seka, kurią koduoja DNR ir kuri susijungusi peptidiniais ryšiais. ▲ Antrinė baltymo struktūra susidaro tada, kai polipeptidinė aminorūgščių grandinėlė susiveja vandenilinių ryšių dėka ir erdvėje sudaro dviejų tipų struktūras: α spirales ir β klostes. ▲ Tretinė baltymo struktūra susidaro susilanksčius antrinei baltymo struktūrai į įvairios formos molekules, kurias stabilizuoja vandeniliniai, joniniai, kovalentiniai ryšiai bei hidrofobinė sąveika. ▲ Ketvirtinė baltymo struktūra susidaro susijungus kelioms polipeptidinėms grandinėms.
- 21. α spiralės ir β klostės ▲ α-spiralės susidaro taip: vandeniliniais ryšiais kiekviena karbonilo (>C=O) grupė susijungia su kas ketvirta po jos einančia amino (>N-H) grupe. ▲ β klostės susidaro taip: lygiagrečiai sugulus dviem ir daugiau polipeptidinėms grandinėms, tarp jų susidaro vandenilinės jungtys, stabilizuojančios šią struktūrą.
- 22. motyvai (Beta-alpha-beta (βαβ) motif) sudaro statinės formos struktūras
- 23. Tretinę baltymo struktūrą palaiko įvairūs ryšiai
- 24. Tretinę baltymo struktūrą palaiko įvairūs ryšiai
- 25. Ketvirtinė baltymo struktūra būdinga TIK kai kuriems baltymams
- 26. Šoninės grupės Šoninės aminorūgštys skirstomos į grupes: ▲ Polinės (turinčios teigiamą arba neigiamą krūvį), kurios gali: • disocijuoti ir įgauti neigiamą krūvį (pvz., asparto rūgštis) -COOH virsta į -COO- ; • prisijungti protoną ir įgauti teigiamą (pvz., lizinas) krūvį -NH2 virsta -NH3 + . ▲ Nežymiai polinės (turinčios -OH ir -NH2 grupes, kurios turi dalinius teigiamus arba dalinius neigiamus krūvius (pvz., treoninas). ▲ Nepolinės (hidrofobinės) – šoninėse grupėse turi aromatinę grupę (pvz., tirptofanas) arba yra sudarytos iš alifatinių (neturinčių ciklo) dalių (pvz., izoleucinas). ▲ Tio grupė (-SH) grupės – sudaro nepolines molekulių dalis, vadinamas disulfidiniais tilteliais (-S-S-). Svarbiausia aminorūgštis, turinti -SH grupę, yra cisteinas.
- 27. Denatūracija ▲ Baltymo erdvinė struktūra lemia jo atliekamas funkcijas. Toks baltymas, kuris turi natūralią konformaciją, t.y., atlieka jam būdingas funkcijas, vadinamas natyviu. ▲ Paveikus baltymą tokiai s veiksniais kaip temperatūra, pH, organiniais tirpikliais, įvyksta jo dentaūracija. Denatūruotas baltymas praranda funkcinį aktyvumą. ▲ Kai kuriems baltymams būdinga renatūracija – procesas, kurio metu denatūruotas baltymas atgauna natyvią formą.
- 28. Baltymų gryninimo metodai 1.Išsūdymas Išsūdymas remiasi jų išskirtiniu tirpumu įvairios koncentracijos druskų tirpaluose. Dažniausiai išsūdyti naudojamos įvairios amonio sulfato (NH4)2SO4 koncentracijos.
- 29. Dializė atliekama naudojant pusiau pralaidžias membranas, kaip pavyzdžiui, celofaną. Tokios membranos praleidžia tik tam tikro dydžio molekules, o didesnės yra sulaikomos. Baltymų gryninimo metodai 2.Dializė
- 30. Baltymų gryninimo metodai 3. Elektroforezė SDS-PAGE SDS-PAGE – tai natrio dodecilsulfato poliakrilamidinio gelio elektroforezė, kuri atliekama denatūruojančiomis sąlygomis. NDS yra anijoninis detergentas, kuris suteikia baltymams neigiamą krūvį. Tad paveikus baltymą SDSu, jis tampa neigiamas. PAGE atskiria skirtingus baltymus pagal jų molekulinę masę.
- 31. Norint atlikti baltymų išgryninimą elektroforezės metodu, būtina sukurti denatūravimo terpę. Kaip buvo minėta praeitoje skaidrėje, viena iš medžiagų, denatūruojančių baltymus, yra SDS. Šioje PAGE reakcijoje taip pat naudojami: EDTA – medžiaga, prisijungianti divalenčius katijonus, todėl sumažina proteazių, kurių kofaktoriai yra tokie divalenčiai metalai kaip magnis ir kalcis, aktyvumą. Tris buferis reikalingas pastovaus pH palaikymui. Glicerolis – alkoholis, kuris neleidžia mėginiui iškilti į paviršių iš šulinėlio. Bromfenolio mėlis yra dažas, kurio dėka galime sekti elektroforezės eigą. Ditiotreitolis (DTT) yra reduktorius, kuris redukuoja disulfidines jungtis tarp cisteino molekulių. Baltymų gryninimo metodai 3. Elektroforezė SDS-PAGE
- 32. Baltymų gryninimo metodai 3. Elektroforezė SDS-PAGE
- 33. Baltymų gryninimo metodai 4.Chromatografija Yra keturios pagrindinės chromatografijos rūšys: 1. Jonų mainų 2. Gelfiltracijos 3. Afininė 4. Hidrofobinės sąveikos
- 34. Baltymų gryninimo metodai 4.Chromatografija Gelfiltracijos metodas naudojamas išfrakcionuoti baltymus pagal jų molekulinę masę, t.y. dydį.
- 35. Baltymų gryninimo metodai 4.Chromatografija Jonų mainų chromatografija remiasi baltymų krūvių skirtumu. Reakcijoje naudojami polimerai, turintys skirtingo krūvio funkcines grupes. Skiriami teigiamą krūvį turintys polimerai ir neigiamą krūvį turintys polimerai.
- 36. Baltymų gryninimo metodai 4.Chromatografija Afininėje (giminingumo) chromatografijoje panaudojama baltymų savybė sąveikauti su skirtingais ligandais, kurie yra imobilizuoti prie kieto nešiklio. Ligandai gali būti substratas arba kofermentas. Prie ligandų specifiškai jungiasi tik baltymai. Visi kiti baltymai patenka į eliuatą (skystį, išsiskiriantį reakcijos metu).
- 37. Baltymų gryninimo metodai 4.Chromatografija Hidrofobinės sąveikos metu hidrofobinės baltymo dalys jungiasi prie tam tikrų vamzdelio vietų. Didelė druskų koncentracija tirpale stabilizuoja baltymus, todėl padidėja baltymų hidrofobinių dalių sąveika su vamzdelio sienelėmis. Keičiant pilamo druskos tirpalo koncentraciją, keičiasi baltymų hidrofobinė sąveika su vamzdeliu, todėl galima išskirti skirtingus baltymus.