Hayvan doku kültürü EGEKÖK Maraton Kök Hücre
2 likes7,039 views
28 Şubat 2014 günü Yeşil Grubun yaptığı sunum
Hayvan doku kültürü EGEKÖK Maraton Kök Hücre
- 2. Tanımlar kelime İn vivo İn vitro İn situ Besi vasatı Media Biyoreaktörler Toxaohene Kontaminasyon İnkübatör disseksiyon anlamı
- 3. Tarihçe • 1880 Roux tuz solusyonunda tavuk embriyosu 1900 Harrison (matriks bağlılığı, besinler, nispeten yavaş büyüme hızı) Carrel (cerrah, 1923) ( Aseptik teknikler ) 1940/1950’s Major Polio epidemics (Polio aşısı ilk kez primer maymun böbrek hücrelerinde üretildi. ) 1950: Hela hücre hattı: insan karsinoma 1970: Recombinant DNA 1975 Kohler and Milstein (Hybridoma)
- 4. Kullanım alanları Fizyolojik çalışmalar Hücrelerin fonksiyonlarının anlaşılması Hücre içi aktivite Hücre içi değişim Çevresel ilişkiler Hücre-hücre ilişkileri Hücre ürünleri ve salgıları Doku mühendisliği (Deri, kıkırdak, karaciğer) Biyolojik malzemeler (ilaç sanayi proteinleri) Monoklonal antibodyler Hormonlar (EPO, FSH) Enzimler ( -glucosidase) Aşılar (Polio) Genetik çalışmaları
- 5. Doku kültürü laboratuarının özellikleri Steril alan (temiz, sakin) Hayvan yetiştirme ve mikrobiyoloji lab. Uzak olmalı Hazırlık alanı Yıkama alanı İnkübatörler için alan Lavabolar Saklama alanları Sıvılar, 4, -20 C Cam eşya Plastikler Özel ekipmanlar Kimyasallar Karbondioksit tüpleri Sıvı azot tankları
- 7. ekipmanlar Laminar flow kabin CO2 inkübatör İnverted mikroskop ܳDZı ٱö Su arıtma cihazı Santrifüj
- 9. İnkübatör • Özellikle memeli hücreleri için karbondioksitli inkübatör gerekli – Isı 36 ºC – Nem %95 – CO2 %5 – Hassas ve kolay kontrol edilebilir olmalı
- 12. ܳDZı
- 13. ٱö
- 14. Su arıtma cihazı
- 21. Biyolojik Kontaminasyon Kültür ortamında belirlenmesi kolay olanlar Bakteri Küf Mantar Kültür ortamında belirlenmesi zor olanlar Virüs Protozoa Mycoplazma Diğer hücre hatları
- 23. Kontaminasyon kontrolü Tüm otoklav ve kuru hava fırınlarında termometreler ve kayıt cihazları kontrol edilerek kalibrasyonları yapılmalı. Spor test stripleri ve kapsülleri otoklavın içinde bulundurulmalı. Kullanılan tüm malzemeler uygun sterilizasyon testlerine tabi tutulmalı Mycoplasmanın belirlenmesi Vasatta doğrudan kültür Mycoplasmanın spesifik karakterlerinin ölçülmesi (PCR, DNA belirleme vs.) Diğer kontaminantların belirlenmesi Karyotip oluşturma Elektroforez ve izoenzim analizi İmmunolojik ve biyokimyasal teknikler DNA belirleme işlemleri
- 24. Sterilizasyon Yaşayan tüm organizmaların ve sporlarının inaktivasyonu ya da eleminasyonu DEZENFEKTAN: Bakteri, mantar ve virüsleri -sporlarını değil- öldürerek tüm bu organizmaları enfeksiyon yapamaz hale getiren maddeler Örnek: Formaldehyde
- 25. Sterilizasyon Yöntemleri Kullanılan Yöntemler: 1. Buhar Sterilizasyonu 2. Kuru Isı Sterilizasyonu 3. Filtrasyon 4. Gaz Sterilizasyonu 5. Radyasyon NOT: Son ürünler mutlaka sterilizasyon testinden geçirilmelidir.
- 27. Besi vasatı Kültürdeki hücrelerin yaşamını devam ettirmesi için gerek duydukları besin maddelerini içeren çözeltilerdir. Çalışmalar ilerledikçe kimyasal yapısı bilinen besi vasatlarına ihtiyaç duyulmuştur.
- 28. Besi vasatının fizikokimyasal özellikleri pH: 7.4 Hücre kültürü için atmosferik oksijen gerekirken, doku kültürleri için %95 oksijen gerekir. • İnsan ve sıcakkanlı hayvanlarda 36,5-37⁰C • Antibiyotik (?) • Nütrisyonel maddeler • Büyüme Faktörleri
- 30. Kültür mediumunun dört önemli bileşeni vardır. 1. Mineral elementler 2. Organik maddeler 3. Büyüme düzenleyicileri (büyüme hormonu) 4. Destek sistemleri
- 32. Hücre hattı Primer kültür pasajlandığında hücre hattı Tek tür hücre grubu ayırma yöntemleri ile ayrılırsa hücre soyu Ölümlü hücre hatları belli sayıda jenerasyon oluşturur. Bu sayı 20-80 arasında değişebilir Türe Hücre farklılıklarına Kültür şartlarına Klonal varyasyona bağlıdır.
- 33. Özellikler Ölümlü ölümsüz Genetik Diploid, euploid Aneploid, polyploid Değişim (transformasyon) normal Ölümsüz, büyüme kontrolu yok, tumor oluşturabilir. Matrikse bağımlılık Var Yok Kontak inhibisyon Var yok Hücre çoğalmasında yoğunluk sınırlaması Var Kaybedilmiş ya da azalmış Büyüme şekli Tek tabaka Tek tabaka ya da süspansiyon
- 34. Özellikler Ölümlü ölümsüz Serum gereksinimi Yüksek Düşük Markırlar Dokuya spesifik Kromozomal, enzimik, antijenik Özel fonksiyonlar Yeniden kazanılabilir Genellikle kaybedilmiş Büyüme oranı Yavaş (24-96 saat) Hızlı (12-24 saat) Kontrol parametreleri Jenerasyon sayısı, dokuya spesifik markırlar Boyanma özellikleri
- 36. Karakterizasyon 1. Çapraz kontaminasyonun olmaması 2. Orijinlenen türün doğrulanması 3. Hücrenin ait olduğu dokunun belirlenmesi 4. Doku içerisinde hücrenin pozisyonu (kök h., öncül h., farklılaşmış h.) 5. Hücrelerin transforme olup olmadığı - hücre hattı ölümlü&ölümsüz?? - malignansi ile ilgili özellikler gösteriyor 6. Hücre hattının genetik kararsızlık ya da fenotipik varyasyon eğilimi var mı? 7. Aynı orijine sahip spesifik hücre hatlarının, hücre soylarının ya da hibrid hücre hatlarının ve bunlara özgü niteliklerin belirlenmesi mu?
- 37. KRİTER METOD Karyotip Metafaz kromozomları ve bantlama İzoenzim analizi Elektroforez Hücre yüzey antijenleri immunohistokimya Sitoiskelet çalışmaları Spesifik sitokeratinleri belirlemek üzere immunolojik teknikler DNA fingerprint Elektroforez, kesim enzimlerinin kullanımı DNA profili PCR ile Mikrosatellit tekrarların belirlenmesi
- 40. Hücre hattını dondurmak Genetik kararsızlık sonucu genotip değişimleri Yaşlanma ve hücre hattının son bulması Büyüme karakteristiklerinin değişimi Malignansi ile ilişkili özelliklerin kazanılması Mikroorganizmalarla kontaminasyon Diğer hücre hatlarıyla çapraz kontaminasyon Yapılan hatalar İnkübasyonda meydana gelen aksamalar Para ve zaman tasarrufu Diğer kullanıcıların da faydalanması için.
- 41. Dondurmak için gerekli olanlar Dondurulacak kültür Eğer tek tabaka kültürü ise %25 tripsin ve fosfatla tamponlanmış tuz solusyonu Besi vasatı Kriyoprotektant
- 43. Hücre hattını çözmek Çözdürülecek ampulun yeri belirlenir. Besi vasatı ve kültür kapları hazırlanır. Ampul sıvı azottan alınır. doğru ampul olup olmadığı kontrol edilir. 37 C su banyosuna konur. Çözüldükten sonra ampul %70 alkolle silinir. Laminair flow kabin içinde açılır. Ampul içeriği pipetle kültür kabına konur. Besi vasatı yavaşça hücre süspansiyonuna eklenir. 10 ml besi vasatı yaklaşık 2 dk süre içerisinde kültüre eklenir. 2 dk 100g’de santrifüjlenir. Üstteki besi vasatı atılır. Hücreler taze besi vasatı ile yeniden süspanse edilir. Kültür kaplarına ekim yapılır. Ampul naftalen black ya da trypan blue ile boyanır. 24 saat sonra tek tabaka oluşturan hücrelerde tutunma ve yaşam yüzdesi belirlenir. Süspanse hücreler için canlı hücre sayımı yapılır ve mikroskopta gözlenir.
- 45. Avantajlar Hayvanda meydana gelen varyasyonlar olmaksızın hücre davranışı üzerinde çalışma Çevre şartlarının kontrolü Hücre karakteristikleri nesiller boyunca devam edebilir. Deneylerin tekrarlanabilirliği daha kolay. Kültürler reaktiflere maruz bırakılabilir (radyoaktif kimyasallar, ilaçlar) Hayvan denelemelerindeki yasal ve etik problemler yoktur.
- 46. Dezavantajlar Sağlıklı ve tekrarlanabilir denemelerin yapılabilmesi için standart tekniklerin geliştirilmesi gerek. Aseptik tekniklerin öğrenilmesi zaman alır. Sınırlı miktarda materyal üretimi Farklılaşmış özelliklerin kaybı ve seleksiyon meydana gelebilir.