II. Kísérleti módszerek és nagy adathalmazok
- 1. Improved Medical Education in Basic Sciences for Better Medical Practicing ImproveMEd Rendszerbiológia orvostudományhoz II. Kísérleti módszerek és nagy adathalmazok
- 2. A rendszerbiológiában végzett kísérleteknek nem kell omic-skála ahhoz, hogy megfeleljenek a rendszerbiológia kritériumainak! Gondoljunk olyan alrendszerekre irányuló kísérleteket, mint pl. az energia metabolizmus szempontjából releváns mRNS követése különböző táplálási minták alatt, vagy több időpontban az táplálá kezdetétől. Amiben a rendszerbiológia különbözik a közös tudományos kutatásoktól: 1. Mennyiségi adatok - hol, mekkora és milyen gyorsan változik (dinamikus, időbeli eltartottság) egy entitás? 2. Számítógépes modellek - pontos számszerűsítésen és időzítésen alapuló szimulációk Továbbá igényli a pozitív és negatív kontrollokra és legalább 3 ismétlésre van szükség! 2. Hipotézis által vezérelt tanulmányok, amelyek a molekulák (vagy a célzott sejtszervecske) célzott részhalmazát követik - a kisméretű rendszerek biológiája. 1. Hypothesis generating studies!
- 3. Molekulák: • DNS-ek mikroarray-ja és szekvenálás alapú technológiák RNS-ek mRNS-szekvenálása Fehérjék Tömegspektrometria-alapú proteomika Lipidek folyadékkromatográfiás és tömegspektrometriája Metabolitok folyadékkromatográfiás tömegspektrometria
- 4. Átlagnépesség technikák • A sejtek vagy szövetminta populációja ≈ 1 millió sejt vagy több • Álagos sok sejten Egyedi sejt technikák • Egysejtes minta sejt-sejt variabilitás HepaRG stabil sejtvonalMájszövet Hepatocyte spheroids
- 5. Microarray - differenciál expresszió • A domináns technika a 2000-es években • Főleg a transzkriptumok szintjének mérésére szolgál • Egyéb alkalmazások: genotipizálás, DNS-feltérképezés (kópiaszám variáció), DNS-metiláció • A Microarray különböző oligonukleotidokkal nyomtatott foltokból áll • A fluoreszcensen jelzett minta (próbák) és a kinyomtatott oligonukletidek közötti hibridizáció • GEO adatbázis https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/qqtutorial.ht ml
- 6. Array CGH összehasonlító genomi hibridizáció • molekuláris citogenetikai módszer / kariotipizálás • CNV relatív a minta teszteléséhez • Abban a feltételezésen alapul, hogy a szorosan összefüggő egyénekből származó minták két különböző (egészséges és beteg) különböznek a kromoszóma vagy a kromoszómális régió nyereségében vagy elvesztésében • A daganat-specifikus DNS kiegyensúlyozatlan átrendeződések nagy léptékű analízise 5-10 megabázis rezolúcióval • OMIM adatbázis https://www.ncbi.nlm.nih.gov/omim
- 7. Microarrays Methylation Assay - epigenom • The final nucleoA génexpresszió epigenetikus szabályozása fontos a fejlődésben, a genetikai lenyomatban, tumorogenezisben ... • Genom széles CpG metilációs szint 30 000-től 500 000 CpG lokusig, amely az egész genomot lefedi • Az első lépés a minták biszulfit átalakítása - a nem metilezett helyek C-t U-be konvertálják, míg a metilezett metilációt vesztít • Az átalakított DNS-t tovább erősítjük (és U-t T-re cserélünk) • A fragmentált és denaturált oligonukleotidokat hibridizálják kétféle allél specifikus gyöngyökkel minden egyes lokusz esetében • Az aneloid allél specifikus oligonukleotid végső nukleotidját tovább emeljük a jelölt dDNT-vel • A szoftver az egyes helyek és osztályok relatív fluoreszcenciáját 0, 0,5 vagy 1 (homozigóta nem metilezett, heterozigóta vagy homozigóta metilezett) • ENCODE https://genome.ucsc.edu/encode/dataMatrix/encodeChipMatrixHuman.htm l
- 8. Szekvenálás alapú technológiák • DNS- vagy RNS-elkülönítéssel kezdődik, amelyet DNS fragmentáció vagy cDNS- szintézis követ • A következő lépés az amplifikáció (klónfragmentumok vektorba, transzformáló baktériumok vektorokkal és amplifikálással) • Sok rövid DNS-darab párhuzamos szekvenálása • Összefüggő töredékek összeállítása
- 9. Egész genom szekvenálás (WGS) vs. teljes egzóma szekvenálás (WES) • A WGS megpróbálja az egész genomot szekvenálni. Egyes szekvenciák technikailag kihívást jelentenek a szekvenciák (telomerek, centromerek, magas CG tartalom vagy ismétlődő lókuszok) számára, és azokat a közös szekvenáló platformnak nem fogadták el, ami a genom lefedettségének 95-98% -át jelenti, de uniformizált módon. • A WES szekvencia csak exomes (kódoló szekvenciák) vagy a genom 2% -a, mindegyik exomes szekvencia 30-100x (nagy mélység). A DNS-RNS hibridizációt a kódoló régiók kiválasztására használják, ami az úgynevezett "forró pontok" túlreprezentáltáságt és a kimaradt variánsok alulreprezentációját okozza. Gyorsabb, aprólékosabb és könnyebb adatelemzés, de alacsony általános lefedettség. uniform bias
- 10. Az exome szekvenálás során dúsítási lépést alkalmaznak a célzott DNS kiválasztására • A mendel-rendellenességek gyakran megzavarják a fehérjét kódoló régiókat • Az Exom a ritka betegségek változatainak jó forrása • A fragmentumok izolálására a Microarreys használható • A WES nagy mélységű szekvenciát ad • Bamshat et al. (2011) Nature Review Genetika
- 11. A genomonkénti költség megnyerte a versenyt, és a WGS vált laginkább alkalmazott módszerré, különösen a tumor-specifikus átrendeződések esetén A szekvenálási módszerek fejlődése 1. Az első generációs Sanger szekvenálás; lánclezáró technológia - a lánc szintézis megszüntetésére használt ddNTP-k kapilláris elektroforéziseivel (egy szál egyszerre, lassú, pontos, drága) 2. A második (következő) generációs szekvenálás - szekvenálás szintézissel - nano- technologia bevezetése - párhuzamos szekvenálás és nincs szükség szétválasztási lépésre - korlátozások az olvasási hosszban 3. A harmadik generációs szekvencia - immobilizált polimeráz + fluoreszcens dNTP + kiváló optika - a bázis beépítés és a bázis módosítása
- 12. A WGS vagy a WES-ből érkező adatoknak nagyszámú populáción végzett verifikációra van szükségük! (több mint 1000 egyénen) • Genotípusok és fenotípusok adatbázis (dbGaP)? https: //www.ncbi.nlm.nih.gov/gap? Genommal összefüggő tanulmányok Foo et al. (2012) Nature Review Neurology
- 13. RNS-Seq Transzkriptom • Az mRNS, az rRNS, a miRNS párhuzamos szekvenálása ... • Gén expressziós profil • Kvantitatív módszer ideális a rendszerbiológiai kísérletekhez • Alternatív összekapcsolási változatok és új transzkripciós változatok azonosítása • GEO adatbázis https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/info/qqtutorial.html • Target Scan adatbázisok (miRNS) http://www.targetscan.org/vert_71/ Wang et al.(2009) Nature Reviews Genetics
- 14. Az RNS-szekvencia domináns transzkripciós módszerré válik, és helyettesíti a microarray-ot Wang et al.(2009) Nature Reviews Genetics
- 15. ChIP-seq? Chromatin Immunprecipitációs szekvenálás • Kombinálja a transzkripciós faktorok vagy egyéb DNS-kötő fehérjék kicsapódását (specifikus antitestek alkalmazásával) vagy a hiszton módosításait és a koimmuniprecipitált DNS mély szekvenciáját • Megtalálja a szabályozó szekvenciákat, promotereket, erősítőket, halkítókat, távtartókat ... • A genom funkcionális szervezése
- 16. A Western Blot volt az első módszer egynél több fehérje mennyiségi meghatározására és azonosítására • Semi-kvantitatív az enzim mögötti nemlineáris kinetika miatt - másodlagos antitestek és szubsztrát reakció • A nem-lineáris kinetikát kemilumineszcens reakció vagy röntgenkészítési film esetében is mutatják • A LICOR olyan infravörös fluoreszcencia, amely kevés hátteret biztosít és a fluoreszcens jel lineárisan arányos az antitest mennyiségével • https://www.licor.com/bio/applications/quantitative_ western_blots/
- 17. Előremenő és fordított fázisú fehérje array (FPPA & RPPA) • Kísérletet tesz az alacsony átbocsátási sebességű Western blot módszer (8-16 sávok minták) nagy átbocsátási módszerré történő átalakítására • Előretekintő változatban egy ellenanyagot észlelünk a csúszdán, és a főbb mintákat megvizsgáljuk az epitóp jelenlétére • Fordított változatban számos ellenanyagot (nagy fajlagossággal) látunk el a csúszdán, és egy mintát vizsgálunk az összes antitest számára. • Nagy fajsúlyú antitesteket igényel, drága.
- 18. Tömegspektrometria, proteomika, lipidomika, metabolomika • A proteomika gyakran tandem tömegspektrometriát használ (két tömegspecifikáció párhuzamosan) • Mennyiségi, mivel a fehérjék teljes szintjét méri • Részleteket ad a poszttranszlációs módosításokról • Ha immunprecipitációval kombináljuk, információt nyújt a fehérje kölcsönhatásokról • Számos lépést foglal magában: elválasztás, emésztés, dúsítás, ismételt elválasztás, ionizáció, tömegszűrés (MS1), fragmentáció és tömegelemzés (MS2), azonosítás, mennyiségi meghatározás • Sok változat
- 19. Tömegspektrometria (MS), proteomika, lipidomika, metabolomika Az utolsó lépés az ismert peptidek nagy adatbázisán és a bioinformatikai keresésen alapul. Az MS és a különböző adatbázisok eltérő verzióját alkalmazzák a lipidomikra és a metabolomikára. UniProtKB adatbázishttps://web.expasy.org/docs/swiss- prot_guideline.html
- 20. Proteomikai analízis dekódolt különbségeket a MAPK pathway között a normál és a tumorsejtekben. Choudhary & Mann (2010) Nature Reviews Molecular and Cell Biology
- 21. proteomika, lipidomika, metabolomika Az utolsó lépés az ismert peptidek nagy adatbázisán és a bioinformatikai keresésen alapul. Az MS és a különböző adatbázisok eltérő verzióját alkalmazzák a lipidomikra és a metabolomikára. UniProtKB adatbázishttps://web.expasy.org/docs/swiss- prot_guideline.html
- 22. Folyadékkromatográfia (LC) és LC / MS lipidomikumok, metabolomika Palermo et al. (2017) Analytica Chimica Acta Nagyon gyakran LC és MS eljáráoskat kombinálva és szekvenciában használatják. Ugyanezeken a mintákon a lipidomikus és metabolomikus vizsgálatok egymás után is elvégezhetők unyanazon a mintán. Az LC-t arra használják, hogy a mintát frakciók formájában osztják mint elválasztási technika, míg az MS molekulák azonosítására szolgálnak.
- 23. A rendszer biológiai kísérletei nagy adathalmazt használnak nagy áteresztő képességű módszerek alkalmazásával : • DNS-ek mikroarrayjei és szekvenálás alapú technológiái (NGS) exome / genom • DNS + szabályozó fehérjék ChIP-seq ReMap • RNS-ek RNS-szekvenciát tartalmaznak • Proteinek MS proteom • Lipidek LC / MS lipidom • Metabolitok LC / MS metabolom