狠狠撸

NGSを用いたジェノタイピングを
?
様々な解析に用いるには？
?
～高密度SNPデータ解析の処方箋～
鐘ケ江弘美
?

?
東京大学大学院　農学生命科学研究科
?
生産?環境生物学専攻生物測定学研究室
2015/11/11
1

Molecular
?Markers
?? Simple
?Sequence
?Repeats
?(SSR)
?markers
?
?
遺伝子のマッピングやQTL解析、マーカー選抜など様々な解析に利用される
?
共優性マーカー(codominant
?maker)、mul=allelicマーカー
?
再現性が高く、他の種でも利用可能
?

?
?
?? Single
?Nucleo8de
?Polymorphism
?(SNP)
?markers
?
SSRマーカーと比較するとハイスループット
?
連鎖地図やゲノミックセレクション、GWASに利用されている　
?

?
?? Next
?genera8on
?sequencing
?(NGS)
?を使ったジェノタイピング
?
RAD-?‐seq、GBS、low
?depth
?WGS
?
一度に多くのSNPを得ることができる
?
マーカーの偏りが少ない
?
欠測も多い
?

?

?
C
A
SNP
2015/11/11
2

RAD-?‐seq
?

?
?
?
?
Genome
?wide
?resequence
?
SNP
?posi=on
?
系統名
3
RAD-?‐seqでは欠測が多い
SNP
?posi=on
?
系統名
2015/11/11

GWAS
?やゲノミックセレクションに利用する時の問題点
High
?coverage
?? 欠測が少ない
?? コストが高い
Low
?coverage
?? 欠測が多い
?? コストが低い
?? 遺伝子型の正確性
が低下する可能性
2015/11/11
4

2015/11/11
5
ゲノミックセレクション　–出穂日の予測
予測モデル
?
y:出穂日
?
y=f(x1,x2,x3,...,xk)
出穂日予測
?
y＝f（x）

?

C
A
SNP
表現型(y）およびDNAマーカー多型を調査し、
?
回帰分析を用いて、予測式f(x)を求めておく
実際にはどこに遺伝子があるか分からないので、
高密度DNA多型を網羅的に予測に利用する
出穂日(y)が未知の個体でも、
?
DNAマーカー多型(x1,x2,x3,...,xk)から
?
出穂日を予測できる。
?
Togo
?picture
?gallery
?by
?DBCLS
?is
?

?Licensed
?under
?a
?Crea=ve
?Commons
?表示 2.1
?日本 (c)
?

2015/11/11
6
ゲノミックセレクション
?
?-?‐欠測が多い場合
?
予測モデル
?
y:出穂日
?
y=f(x1,x2,x3,...,xk)
出穂日予測
?
y＝f（x）

?

C
A
SNP
欠測があるマーカーはマーカー遺伝子型から
行列を計算できない
?

?

?

?

欠測が多く、DNA多型が低密度
?
DNA多型を網羅的に予測に利用できない
出穂日の予測精度が低下
?
Togo
?picture
?gallery
?by
?DBCLS
?is
?

?Licensed
?under
?a
?Crea=ve
?Commons
?表示 2.1
?日本 (c)
?
検出力の低下
x1
?
x2
?
x3
?
…
?
DNA多型
?
y1
?
y2
?
y3
?
…
?
=
b
?+
?e
出穂日
?

GWAS
?やゲノミックセレクションに利用する時の問題点
High
?coverage
??欠測が少ない
??コストが高い
Low
?coverage
??欠測が多い
??コストが低い
??ジェノタイピングの正確性が
低下する可能性
2015/11/11
7
欠測した遺伝子型を補完し
?
低コストでジェノタイピング
?

2015/11/11
8
マーカーセットが異なるデータを用いる場合
setA
setB
両方のセットで遺伝子型データのある
重なったマーカーしか利用できない
2つのデータセットで共通していない
マーカーの遺伝子型を補完する
Imputa=onを行うことで、
?
すべてのマーカーを利用できる
setA
setB
Imputa8onを行わない場合
Imputa8onを行う場合

欠測した遺伝子型の補完
2015/11/11
9
手作業で欠測を補完する場合
C
G
遺伝子型が似ている系統の情報をもとに、補完
?

?
-?‐>
?多数の系統およびSNPマーカーを利用する場合、手作業では不可能

2015/11/11
10
IMPUTATION　ソフトウエア
ソフトウエア名
URL
Beagle
hWps://faculty.washington.edu/browning/beagle/
beagle.html
Tassel
hWp://www.maizegene=cs.net/#!tassel/c17q9
IMPUTE2
hWps://mathgen.stats.ox.ac.uk/impute/
impute_v2.html
PLINK
hWp://pngu.mgh.harvard.edu/~purcell/plink/
pimputa=on.shtml
minimac2
hWp://genome.sph.umich.edu/wiki/Minimac2

2015/11/11
11
遺伝子型の予測
Step
?2
Step
?1
Step
?3
品種A
品種B
品種C
品種D
品種E
品種F
マーカー
マーカー
マーカー
サンプルで遺伝子型を
?
共有している領域を特定
?
ハプロタイプの情報から
?
欠測している遺伝子型を補完
ゲノムに存在する連鎖不平衡と
?
ハプロタイプブロック構造を利用
T C
C A G C G
T
C
G A G G A G C
C C ?
A G C T C C G A G C ?
T C
T C ?
A G C G T C G A ?
G A G C
C C C A A C G T ?
G A G C G T C
A C C A
G C T C C ?
A G G G G T
C C C A G C T C C G A G
G ?
T T
T C C A G C G T C G ?
G G A G C
C C ?
T C
T C ?
A G C G T C G A ?
G A G C
C C C A A C G T ?
G A G C G T C
A C C A G C T C C ?
A G G G G T
C C C A G C T C C G A G G ?
T T
品種A
品種B
品種C
品種D
品種E
品種F
T C C A G C G T C G A G G A G C
C C C A G C T C C G A G C G T C
C C C A A C G T C G A G C G T C
A C C A G C T C C G A G G G G T
C C C A G C T C C G A G G G T T
品種A
品種B
品種C
品種D
品種E
品種F

2015/11/11
12
リファレンスパネルを用いた遺伝子型の予測
サンプル
リファレンスパネル
T ?
C A G C ?
?
?
G A G G A G ?
C C C A G C ?
?
?
G A G C ?
T C
T ?
C A G C ?
?
?
G A G G A G ?
C C C A G C ?
?
?
G A G C ?
T C
サンプル
サンプル
Step
?2
Step
?1
Step
?3
品種A
品種B
品種C
品種D
品種E
品種F
品種A
品種B
品種C
品種D
品種E
品種F
品種A
品種B
品種C
品種D
品種E
品種F
マーカー
マーカー
マーカー
サンプルとリファレンスパネルの中の個体
で、遺伝子型を共有している領域を特定
?
リファレンスパネルの遺伝子型と
?
ハプロタイプの情報から
?
欠測している遺伝子型を補完
ゲノムに存在する連鎖不平衡と
?
ハプロタイプブロック構造を利用

2015/11/11
13
リファレンスパネルを用いた遺伝子型の予測
欠測を含むRAD-?‐seq
ジェノタイピング
?
されていないSNP
ジェノタイピングされて
いないSNPの補完
?
遺伝子型を補完した
サンプルデータ
リファレンスパネルの遺伝子型に基づいて
?
統計学的にサンプルの遺伝子型を予測
遺伝子型を補完することにより、
?
解析するSNP数を増やすことが可能
T C C A G C ?
?
?
G A G G A G C
C C C A G C ?
?
?
G A G C G T C
T ?
C A G C ?
C ?
G A G G A G ?
C C ?
T C
品種A
品種B
品種A
品種B
マーカー
マーカー

2015/11/11
14
リファレンスパネルの作成
?? 自前のデータだけでは、リファレンスパネルとして利用できる系統数が少ない
?

?
?? 公共データベースで公開されているゲノム配列を解析することで、系統数を
増やすことができる
?
?? 公開されたデータを使うことで、シーケンスにコストがかからない
?

?
?? SNPの遺伝子型情報を利用してリファレンスパネルを作成
?
データベース名
URL
DRAsearch
hWps://trace.ddbj.nig.ac.jp/DRASearch/
DBCLS
?SRA
hWp://sra.dbcls.jp
NCBI
hWp://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/
DNAnexus
hWp://sra.dnanexus.com/
公開されているゲノム配列を検索

2015/11/11
15
公開されているゲノム配列を検索
DBCLS
?SRA
検索結果を
?
タブ区切りで
?
保存可能
下位を含めて、生物種で検索
hWp://sra.dbcls.jp

imputa8onを行う前に、以下のようなマーカーを除去
?? 欠測率の高いマーカー
?
?? 分離比が歪んでいるマーカー
?
?? 実験サンプル間で不一致が多いマーカー
?
?? MAFが非常に低いマーカー
2015/11/11
16
データのフィルタリング
どのような条件でマーカーを除去するか？
?
最適な条件はサンプルごとに異なるので、
?
それぞれの研究に応じて適切な条件を用いる

2015/11/11
17
Imputa8onに用いるソフトの選択の例
家系情報の
?
利用
reference
?
genome
?
の利用
マーカーの
?
順序の利用
連鎖地図は利用
できますか？
全ゲノムシーケ
ンスは利用可能
ですか?
R
?
qtl
家系情報を利用
しますか？
Tassel
Beagle
R
missForest
Yes
No
Yes
No
Yes
No
どのソフトが適しているのか？はサンプルごとに異なる
?
いくつかのソフトで解析し、最適なソフトを選択する

2015/11/11
18

?R　　missForest
missForest:
?Nonparametric
?Missing
?Value
?Imputa8on
?using
?Random
?Forest
?
hWps://cran.r-?‐project.org/web/packages/missForest/missForest.pdf
?? ノンパラメトリック
?
?? mixed-?‐type
?imputa=on
?method
?
?? random
?forestを用いて、実測値から欠測値を予測
?

?R　　qtl
hWp://www.rqtl.org/manual/qtl-?‐manual.pdf
?? calc.genoprob
?
?:
?Calculate
?condi7onal
?genotype
?probabili7es
?
地図距離に基づいて、欠測値を予測

imputa=on,genotype
?calling,
?genotype
?phasing,
?IBD
?segment
?detec=onを行う
?? 2015.11.11現在の最新版はBeagle
?version
?4.1
?
?? hWp://faculty.washington.edu/browning/beagle/beagle.html
?
?? Beagle
?4.1の場合、Java
?version
?8が必要
2015/11/11
19
Beagleとは？
HPからのBeagleのダウンロード
hWps://faculty.washington.edu/browning/beagle/beagle.html#download
wget
?を使う方法
wget
?hWp://faculty.washington.edu/browning/beagle/beagle.21Oct15.abc.jar

?? vcfおよびvcf.gzを利用可能
?
?? Beagleで利用するためにはGTあるいはGLのFORMATが必要
2015/11/11
20
Beagleの入力ファイル
#CHROM
POS
ID
REF
ALT
QUAL
FILTER
INFO
FORMAT
RTx430
Tx642
Chr01
236
ss.3
C
T
2256.5
PASS
AC=2;AF=0.043
GT:AD:DP:GQ:PL
0/0:14,0:14:33:0,33,423
0/0:143,0:143:99:0,376,5016
Chr01
284
ss.6
T
A
5219.94
PASS
AC=6;AF=0.130
GT:AD:DP:GQ:PL
0/0:14,0:14:36:0,36,491
0/0:135,0:135:99:0,370,4920
Chr01
871
ss.
10
C
T
24370.1
PASS
AC=32;AF=0.696
GT:AD:DP:GQ:PL
1/1:0,10:10:24:328,24,0
0/0:88,0:88:99:0,244,3212
GT:
?genotype,
?encoded
?as
?allele
?values
?separated
?by
?either
?of
?/
?or
?|.
?The
?allele
?
values
?are
?0
?for
?the
?reference
?allele
?(what
?is
?in
?the
?REF
??eld),
?1
?for
?the
??rst
?allele
?
listed
?in
?ALT,
?2
?for
?the
?second
?allele
?list
?in
?ALT
?and
?so
?on.
?

?
GL
?:
?genotype
?likelihoods
?comprised
?of
?comma
?separated
??oa=ng
?point
?log10-?‐scaled
?
likelihoods
?for
?all
?possible　genotypes
?given
?the
?set
?of
?alleles
?de?ned
?REF
?and
?ALT
?
?elds.
GT　FORMATの例

2015/11/11
21
Beagleの実行
Format
?GT
?vcf
??le
java
?-?‐jar
?beagle.21Oct15.abc.jar
?gt="test.sorghum.Nov11.abc.vcf.gz"
?out="out.gt"
データサイズが大きい場合は、染色体ごとにvcfファイルを分けて、実行する
Format
?GL
?vcf
??le
java
?-?‐jar
?gl="test.21Oct15.abc.vcf.gz"
?out="out.gl"
test.sorghum.Nov11.abc.vcf.gz
?
phytozome
?sorghum
?v.2.1　SNP数 3,699,951
?
?
?22系統　のサイズを小さくしたvcf
??le
?
gt=で入力するvcf
??leを指定、　out=で出力ファイルを指定　
?

リファレンスパネルを利用した欠測の補完
?
java
?-?‐jar
?ref=ref.21Oct15.abc.vcf.gz
?gt=target.21Oct15.abc.vcf.gz
?
out=out.ref
ref=でリファレンスパネルのvcf
??leを指定
gl=で入力するvcf
??leを指定

2015/11/11
22
Beagleの実行結果
#CHROM
POS
ID
REF
ALT
QUAL
FILTER
INFO
FORMAT
RTx430
Tx642
Ajabsido
SC35
SC971
SC265
SC283
Chr01
236
ss.3
C
T
.
PASS
.
GT:DS
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
Chr01
284
ss.6
T
A
.
PASS
.
GT:DS
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
1|1:2
0|0:0
Chr01
871
ss.10
C
T
.
PASS
.
GT:DS
1|1:2
0|0:0
1|1:2
0|1:1
1|1:2
1|1:2
0|1:1
出力ファイル　out.gt.vcf.gz　ファイルを解凍
gunzip
?out.gt.vcf.gz
imputa=on前の入力ファイルは　0/0,0/1,1/1
?
imputa=on後の出力ファイルは　0|0,0|1,1|1
?

?
GT:
?0がREF
?alleleで、1がALT
?allele
?
0/0はREFのホモ
?
0/1はREFとALTのヘテロ
?
1/1はALTのホモ

?
|
?
?
?はphasedを示す
?
/
?　は unphasedを示す
?

2015/11/11
23
Beagleの実行結果
#CHROM
POS
ID
REF
ALT
QUAL
FILTER
INFO
FORMAT
RTx430
Tx642
Ajabsido
SC35
SC971
SC265
SC283
Chr01
236
ss.3
C
T
.
PASS
.
GT:DS
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
Chr01
284
ss.6
T
A
.
PASS
.
GT:DS
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
0|0:0
1|1:2
0|0:0
Chr01
871
ss.10
C
T
.
PASS
.
GT:DS
1|1:2
0|0:0
1|1:2
0|1:1
1|1:2
1|1:2
0|1:1
marker
RTx430
Tx642
Ajabsido
SC35
SC971
SC265
SC283
Chr01:236
0
0
0
0
0
0
0
Chr01:284
0
0
0
0
0
2
0
Chr01:871
2
0
2
1
2
2
1
imputa8on後のvcfファイル
0/0はREFのホモ
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?
?-?‐>
?
?
?
?0
?
0/1はREFとALTのヘテロ
?
?
?-?‐>
?
?
?
?1
?
1/1はALTのホモ

?
?
?
?-?‐>
?
?
?
?2
GWASやゲノミックセレクションなど、様々な解析に用いるためにスコア化

2015/11/11
24
Tasselとは？
Trait
?Analysis
?by
?aSSocia0on,
?Evolu0on
?and
?Linkage
?? 作物の解析に最適化
?
?? 欠測の補完だけではなく、様々な機能がある
?
?? コマンドラインからだけではなく、充実したGUIから簡単に解析可能

HPからのダウンロード
?
?

?java
?1.8
?
?

2015/11/11
25
Tasselのダウンロード
ここからOSに合わせてダウンロード
YouTubeでの解説

2015/11/11
26
Tasselの入力ファイル
メニューのDataからLoadを選択　　→　Make
?Best
?Guess
?

?vcf
??leを入力ファイルとして利用　
YouTubeでの解説
vcf
??leだけでなく、Hapmapや
Plinkなどのファイルを利用可能
?

2015/11/11
27
Tassel　遺伝子型データの表示
Major
?alleleとMinor
?alleleを色分けして表示させることで、データの確認が可能
?

2015/11/11
28
Tassel　染色体ごとに分けたファイルを作成
Dataから
?
Separateを選択
?

?
元のファイルの下に
?
染色体ごとに分けた
?
ファイルが作成される

2015/11/11
29
Tassel　データのフィルタリング
Filter
?→　Filter
?Genotype
?Table
?Sitesを選択
MAFでフィルタリング
sequence
?
?leを選択
YouTubeでの解説
Filter
?→　Taxa
?Names
系統名を
?
検索しながら
?
フィルタリングが可能
?

2015/11/11
30
Tassel　LD
?plotの作成
Step
?1
Step
?2
Step
?3
Step
?4
Analysis
?→
?Linkage
?Disequilibriumを選択
Result
?フォルダにLDの結果が表示される
Result
?→
?LD
?plot
LD
?plot
?が表示される

2015/11/11
31
Tassel　Phenotype の欠測を補完
欠測を補完する方法を選択
hWps://bitbucket.org/tasseladmin/tassel-?‐5-?‐source/wiki/UserManual/NumericalImpute/NumericalImpute
Impute
?→
?Numerial
?Imputeを選択
元のファイルの下に
?
Imputed
?ファイルが作成される

2015/11/11
32
Tassel　Genotype の欠測を補完
Impute
?By
?FILLIN
?
Impute
?BY
?FSFHap
?
Tasselには2種類のImpute方法
?

?
集団に合わせて使い分ける
?
Fast,
?Inbred
?Line
?Library
?Imputa=oN
?
generalized
?approach
impute
?missing
?data
?in
?full
?sib
?families
?(bi-?‐parental
?families)

2015/11/11
33
Tassel　-?‐
?Impute
?By
?FILLIN
?
hWps://bitbucket.org/tasseladmin/tassel-?‐5-?‐source/wiki/UserManual/FILLIN/FILLIN　より引用
Beagleとは異なり、欠測を埋められないマーカーがある

?? Inbred
?の両親と後代のImputa=on
?
?? 欠測率が高く、ヘテロ率の高いGBSデータ用に開発
?

?
?? 親の遺伝子型と後代の遺伝子型データが必要

?
?? ヘテロの両親のF1には利用できない
?
?? 両親の遺伝子型が正確である場合にはこれを利用した方が良い
?

?

2015/11/11
34
Tassel　-?‐
?Impute
?BY
?FSFHap
?
hWps://bitbucket.org/tasseladmin/tassel-?‐5-?‐source/wiki/UserManual/FSFHapImputa=on/FSFHapImputa=on

2015/11/11
35
Genotype-?‐Imputa8on
?Accuracy
?
hWps://ciedeakin.?les.wordpress.com/2013/12/glaubitzswarts_gbs20140213.pdfy　　より引用

2015/11/11
36
Genotype-?‐Imputa8on
?Accuracy
?
?? 正確に遺伝子型を補完することができなければ、その後の解析に影響する
?

?
?? 遺伝子型に矛盾がないか？を確認することでimputa=onの正確性を調べることが
可能
?

?
?? 既知の遺伝子型をマスクすることで、遺伝子型の正確性を解析
?　
?

?既知の遺伝子型と補完された遺伝子型を比較
?

?
?? Tasselの場合はすべての遺伝子型を補完することができない
?

?このため、Tasselで遺伝子型を予測したのち、補完できなかった遺伝子型を

?Beagleを用いて補完する方法もある
?

?
?? BeagleとTasselを両方用いて、一致する遺伝子型だけを利用することで正確性が
高くなる
?

?
?? Inbredに関してはTasselの方が優れているが、ヘテロな集団の場合はBeagleの方
が適している
?

?

狠狠撸

狈骋厂を用いたジェノタイピングを様々な解析に用いるには？

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