ゲノム育种を実装?利用するための狈骋厂データ解析
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NGSワークショップ2017 ワークショップ「NGSデータの多彩な活用」 20171112@龍谷大学瀬田キャンパス
![[DDBJing33] ゲノムワイド多型を利用した遺伝解析の実際](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/33ddbjingshirasawa-151120004737-lva1-app6891-thumbnail.jpg?width=560&fit=bounds)
![[DL輪読会]DropBlock: A regularization method for convolutional networks](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/dlyokota20190222-190222002832-thumbnail.jpg?width=560&fit=bounds)
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- 1. ゲノム育種を 実装?利用するための NGSデータ解析 鐘ケ江 弘美 東京大学大学院 農学生命科学研究科 生産?環境生物学専攻 生物測定学研究室 2017/11/12 @ 龍谷大学 2017年 鳥取大学 NGS ワークショップ 2017 「NGS データの多彩な活用」 1
- 2. DNAマーカー選抜育種 ? 有用遺伝子の有無を識別できるマーカーを利用 ? 有用な遺伝子を保持 しているか？を短時間で診断 ? DNAマーカ-選抜 により優良品種の育成が短期間で可能になる ? 単一あるいは少数の遺伝子で決定されている形質に限られている ? 多くの遺伝子が少しずつ寄与している形質には利用できない ソルガム 2
- 5. 果樹のゲノミックセレクション Minamikawa MF, Nonaka K, Kaminuma E, Kajiya-Kanegae H, Onogi A, Goto S, Yoshioka T, Imai A, Hamada H, Hayashi T, Matsumoto S, Katayose Y, Toyoda A, Fujiyama A, Nakamura Y, Shimizu T, Iwata H. Genome-wide association study and genomic prediction in citrus: Potential of genomics-assisted breeding for fruit quality traits. Sci Rep. 2017 Jul 5;7(1):4721. 5
- 6. Molecular Markers Simple Sequence Repeats (SSR) markers 遺伝子のマッピングやQTL解析、マーカー選抜など様々な解析に利用される 共優性マーカー(codominant maker)、multiallelicマーカー 再現性が高く、他の種でも利用可能 Single Nucleotide Polymorphism (SNP) markers SSRマーカーと比較するとハイスループット 連鎖地図やゲノミックセレクション、GWASに利用されている Next generation sequencing (NGS) を使ったジェノタイピング RAD-Seq、GBS、low depth WGS、Amplicon Seq、GRAS-Di 一度に多くのSNPを得ることができる マーカーの偏りが少ない 6
- 11. Rice Diversity SNP数と欠測率の関係 https://ricediversity.org/data/ 1,568個体 High Density Rice Array 700k Missing SNP 1 5,525 0.9 441,294 0.8 679,654 0.6 700,000 HDRA-G6-4-RDP1-RDP2-NIAS.ACGT.VCF.gz 欠測 少多 Missing = 1 全ての個体で遺伝子型が 決まっているマーカー 11
- 14. データのフィルタリング ? 実験サンプル間で不一致が多いマーカー ? 親のWGSで多型のないマーカー Imputationを行う前に、 以下のようなマーカーを除去 ? 欠測が多いマーカー ? MAFが非常に低いマーカー Reference panelの利用 14
- 15. vcftools を用いたSNPのフィルタリング vcftools_0.1.13 入力vcf file : name.vcf.gz 出力vcf file : name_bi_MQ20_DP3-100_maf0.025.recode.vcf minQ 20 : --minQ 20 Depth 3-100 : --minDP 3 --maxDP 100 biallelic : --min-alleles 2 --max-alleles 2 SNP only : --remove-indels maf 0.025 : --maf 0.025 vcftools --gzvcf name.vcf.gz --min-alleles 2 --max-alleles 2 --minDP 3 --maxDP 100 -- remove-indels --max-missing 0.8 --minQ 20 --maf 0.025 --recode --out name_bi_MQ20_DP3-100_maf0.025 15 -- max-missing : 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 0.9, 0.95 など様々な条件を試す
- 16. 欠測した遺伝子型の補完 16
- 17. Beagleとは？ ? 2017.11.10 現在の最新版はBeagle version 4.1 ? http://faculty.washington.edu/browning/beagle/beagle.html ? reference genome へのマッピングが必要 ? Beagle 4.1の場合、Java version 8が必要 ? 親子関係を用いて(ped argument)解析する場合は、Beagle 4.0 を使用 ? 参考文献 B L Browning and S R Browning (2016). Genotype imputation with millions of reference samples. Am J Hum Genet 98:116-126. doi:10.1016/j.ajhg.2015.11.020 17
- 18. Beagleの入力ファイル ? vcfおよびvcf.gzを利用可能 ? Beagleで利用するためにはGTあるいはGLのFORMATが必要 #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT RTx430 Tx642 Chr01 123ss.3 C T 2256.5PASS AC=2;AF=0.043 GT:AD:DP:GQ:PL 0/0:14,0:14:33:0,33,423 0/0:143,0:143:99:0,376,5016 Chr01 284ss.6 T A 5219.94PASS AC=6;AF=0.130 GT:AD:DP:GQ:PL 0/0:14,0:14:36:0,36,491 0/0:135,0:135:99:0,370,4920 Chr01 871ss.10 C T 24370.1PASS AC=32;AF=0.696 GT:AD:DP:GQ:PL 1/1:0,10:10:24:328,24,0 0/0:88,0:88:99:0,244,3212 18
- 19. Beagle 実行 データサイズが大きい場合は、染色体ごとにvcfファイルを分けて、実行する Format GT vcf file gt=で入力するvcf fileを指定、 out=で出力ファイルを指定 Format GL vcf file gl=で入力するvcf fileを指定、 out=で出力ファイルを指定 リファレンスパネルを利用した欠測の補完 ref=でリファレンスパネルのvcf fileを指定 19
- 20. Beagleの実行結果 imputation前の入力ファイルは 0/0,0/1,1/1 imputation後の出力ファイルは 0|0,0|1,1|1 GT: 0がREF alleleで、1がALT allele 0/0はREFのホモ 0/1はREFとALTのヘテロ 1/1はALTのホモ #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT RTx430 Tx642 Ajabsido SC35 SC971 SC265 SC283 Chr01 236 ss.3 C T . PASS . GT:DS 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 Chr01 284 ss.6 T A . PASS . GT:DS 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 1|1:2 0|0:0 Chr01 871 ss.10 C T . PASS . GT:DS 1|1:2 0|0:0 1|1:2 0|1:1 1|1:2 1|1:2 0|1:1 zcat out.gt.vcf.gz | grep -v “##” | head zcat:圧縮されたファイルの内容を表示する 20
- 21. Beagleの実行 imputation後のvcfファイル #CHROM POS ID REF ALT QUAL FILTER INFO FORMAT RTx430 Tx642 Ajabsido SC35 SC971 SC265 SC283 Chr01 236 ss.3 C T . PASS . GT:DS 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 Chr01 284 ss.6 T A . PASS . GT:DS 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 0|0:0 1|1:2 0|0:0 Chr01 871 ss.10 C T . PASS . GT:DS 1|1:2 0|0:0 1|1:2 0|1:1 1|1:2 1|1:2 0|1:1 GWASやゲノミックセレクションなど、様々な解析に用いるためにスコア化 marker RTx430 Tx642 Ajabsido SC35 SC971 SC265 SC283 Chr01:236 0 0 0 0 0 0 0 Chr01:284 0 0 0 0 0 2 0 Chr01:871 2 0 2 1 2 2 1 vcftools --vcf file1.vcf --extract-FORMAT-info GT -- 012 option も利用可能 21
- 22. 交配後代のジェノタイピング 22
- 24. r/qtlによるImputation require(qtl) qtl パッケージを読み込む データを読み込む cross <- read.cross(format = "csvs", genfile = "geno.csv", phefile = “pheno.csv") fill.geno : 欠測を補完 fill.geno(cross, method=c("imp","argmax", "no_dbl_XO", “maxmarginal"),error.prob=0.0001, map.function=c("haldane","kosambi","c- f","morgan"),min.prob=0.95) https://www.rdocumentation.org/packages/qtl/versions/1.41-6/topics/fill.geno 24
- 25. r/qtlによるImputation fill.geno : 欠測を補完 methodの選択 https://www.rdocumentation.org/packages/qtl/versions/1.41-6/topics/fill.geno imp impute using a single simulation replicate from sim.geno sim.geno argmax Viterbi algorithm, as implemented in argmax.geno argmax.geno no_dbl_XO simply filling in missing genotypes between markers with matching genotypes maxmarginal choosing (at each marker) the genotype with maximal marginal probability 25
- 26. r/qtlによるImputation sim.geno(cross, n.draws=16, step=0, off.end=0, error.prob=0.0001, map.function=c("haldane","kosambi","c-f","morgan"), stepwidth=c("fixed", "variable", "max")) sim.geno : Simulate Genotypes Given Observed Marker Data argmax.geno : Reconstruct Underlying Genotypes argmax.geno(cross, step=0, off.end=0, error.prob=0.0001, map.function=c("haldane","kosambi","c-f","morgan"), stepwidth=c("fixed", "variable", "max")) 26
- 27. r/qtlの入力ファイル 遺伝子型 genfile ad.cross(format = "csvs", genfile = "geno.csv", phefile = "pheno.csv", estimate.map=FALSE, BC.g 表現型 phefile マーカー 系統名 系統名 形質名 chr pos(cM) 27
- 28. Genetic and Physical Map Correlation 28
- 29. 高標高×低標高交雑に由来するトドマツ分離集団を用いた RAD-Seqによる連鎖地図構築?QTL解析 Genetic mapping of local adaptation along the altitudinal gradient in Abies sachalinensis Goto S, Kajiya-Kanegae H, Ishizuka W, Kitamura K, Ueno S, Hisamoto Y, Kudoh H, Yasugi M, Nagano AJ, Iwata H Tree Genetics & Genomes (2017) 13: 104. https://doi.org/10.1007/s11295-017-1191-3 29
- 31. トドマツ 連鎖地図作成 ? 連鎖地図作成→大量のマーカーが必要 ? 分離集団が必要 ? トランスポゾンや反復配列が多い ? モミ属のゲノムサイズは巨大（≒20Gb） スギは約11G ? ゲノムは解読されていない ? 既存のマーカー 核SSR 4座, 葉緑体SSR 3座 ? 新規マーカー開発に莫大な労力と費用 ? 両親2個体＋実生376個体のRAD-Seq分析 ? リファレンスゲノムを利用できないため、 ? Stacksを利用して遺伝子型を決定 31
- 32. トドマツ 連鎖地図 ? JoinMap を用いて連鎖地図作成 ? 事前にゲノム情報がなくても、RAD-Seqで連鎖地図を作成 ? 連鎖地図は両親ともに、モミ属の染色体数と同じ12連鎖群に収束 32
- 34. トドマツ 遺伝子型修正 修正前 修正後 修正前 修正後 242.2cM 127.7cM34
- 35. Tasselとは？ ? TASSEL 5 ? Java platform ? 作物ゲノムの多様性解析に最適 化されている ? 欠測の補完だけでなく、様々な 機能がある ? コマンドラインからだけでなく 、充実したGUIから簡単に解析可 能 35
- 36. TASSELのインストール ? Tassel 5.0 にはJava 1.8が必要 ? gitではなくdownloadも可能 ? https://bitbucket.org/tasseladmin/tassel- 5-source/downloads/ ? GBS Pipeline v2 ? Tassel 5.0 Youtube Tutorials ? https://www.youtube.com/channel/UCS 1SdXlyMI1OsSf5yA_oFqw git clone https://bitbucket.org/tasseladmin/tassel-5-standalone.git 36
- 37. Tassel 5 GBS v2 Pipeline https://bitbucket.org/tasseladmin/tassel-5-source/wiki/Tassel5GBSv2Pipeline 37
- 40. Tassel データのフィルタリング Filter → Filter Genotype Table Sitesを選択 40
- 42. TASSEL Trait format <Trait> EarHT dpoll EarDia 811 59.5 NA NA 33-16 64.75 64.5 NA 38-11 92.25 68.5 37.897 4226 65.5 59.5 32.219 42
- 44. TASSEL Numerical Imputation Imputation 前 Imputation 後 44
- 45. TASSEL Imputation FILLIN all types of populations but optimized for those with higher inbreeding coefficients FSFHap optimized for finding recombination break points in full-sib families LD-kNNi k-nearest neighbor genotype imputation method (for unordered markers) 45
- 46. TASSEL - Impute By FILLIN 46
- 49. データの前処理の重要性 ? データのフォーマット変換、欠測値や外れ値の除去 ? そのまま入力しても、良い結果は得られない Garbage In, Garbage Out. 40% 40% 20% 環境構築 データの前処理 解析 49
- 50. 「こんなExcel file は前処理に時間がかかる」 全角空白 全角記号 全角数字 セル内改行 セル内コメント セルの結合 セルの結合 全角空白 全角記号 全角数字 50