[DDBJing33] ゲノムワイド多型を利用した遺伝解析の実際
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ゲノムワイド多型を利用した遺伝解析の実際 講師：白澤 健太（かずさDNA研究所 先端研究部 植物ゲノム?遺伝学研究室 主任研究員） 2015年11月11日「第33回 DDBJing 講習会 in 東京」 ＠国立研究開発法人 科学技術振興機構 東京本部別館 YouTube：https://youtu.be/AL8gkTCLj_w DDBJing 講習会：http://www.ddbj.nig.ac.jp/ddbjing/ddbjing.html
[DDBJing33] ゲノムワイド多型を利用した遺伝解析の実際
- 2. なぜ、ゲノムワイド多型データが必要か？ ? マーカー数：少 ? 解像度：低MAS QTL GWAS ? マーカー数：多 ? 解像度：高GS
- 3. ゲノムワイド多型データの集め方 ? RFLP – サザンブロット分析 ? RAPD, AFLP – PCR→電気泳動 ? SSR (microsatellite) – PCR→電気泳動 ? SNP – PCR→電気泳動 – qPCR – チップ – NGS
- 4. NGSを利用したゲノムワイド多型分析 ? 全ゲノム解読 ? トランスクリプトーム ? エキソンキャプチャ ? ターゲットアンプリコン シークエンス ? Reduced-representationラ イブラリ – RAD-Seq – GBS – ddRAD-Seq Davy et al. (2011) Nat Rev Genet 12, 499-510
- 5. WGS RAD-Seq Digestion Adapter ligation PCR amplification Sequencing RAD-Seq in Kazusa 100PE 250PE
- 6. RAD-Seqワークフロー 1日目 2日目 3日目 4日目 5日目 9:00 PCR?精製 シークエンス シークエンス 10:00 情報処理 11:00 サイズ セレクション12:00 13:00 サンプリング 精製?定量 14:00 DNA抽出 15:00 シークエンス 16:00 制限酵素 処理 アダプター 付加17:00 SNPリスト DNA調整からSNPリストまで最短で5日
- 8. RAD-Seqの成功のポイント 1. 制限酵素選び 2. ゲノム中のSNP密度 3. ゲノム中の厂狈笔分布
- 9. トマトゲノム中の制限酵素サイト数 制限酵素サイト数 0 50,000 100,000 150,000 200,000 250,000 300,000 350,000 400,000 450,000 500,000 SalI PstI EcoRI HindIII MspI Numberofrestrictionsites 制限酵素断片数（300-900 bp） 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 SalI - PstI PstI - EcoRI EcoRI - HindIII PstI - MspI Numberofrestrictionfragments
- 10. RAD-SNP数と制限酵素断片数との関係 SalI - PstI PstI - EcoRI EcoRI - HindIII PstI - MspI y = 0.281x - 2129.8 R? = 0.995 0 2,000 4,000 6,000 8,000 10,000 12,000 14,000 16,000 18,000 20,000 0 10,000 20,000 30,000 40,000 50,000 60,000 70,000 80,000 #RAD-SNPs No. of fragments (300-900 bp)
- 11. RAD-SNPのゲノム中の位置 0% 20% 40% 60% 80% 100% WGS SalI - PstI PstI - EcoRI EcoRi - HindIII PstI - MspI Intergenic SNPs Genic SNPs
- 13. RAD-SNP数と全ゲノムSNP数との関係 Regina Micro-Tom M82 Moneymaker San Marzano Ailsa Craig y = 0.0237x - 1849.3 R? = 0.7304 0 5,000 10,000 15,000 20,000 25,000 30,000 0 200,000 400,000 600,000 800,000 1,000,000 1,200,000 #RAD-SNPs #Genome-wide SNPs
- 15. RMF2-01 RMF2-02 RMF2-96 Micro-TomRegina x ↓ F1 … Index-01 Index-02 Index-96… MiSeq Fastq-01 Fastq-02 Fastq-96… BAM-01 BAM-02 BAM-96… F2-VCF Filtered VCF Imputed VCF Index-REG Index-MT Fastq-REG Fastq-MT BAM-REG BAM-MT P-VCF Filtered VCF Excluding identical loci 解析の流れ F2 lines Seq. library Sequencing Seq. data Mapping SNP calling Filtering Imputing Applications Cleaning
- 16. 欠失データの補間 補間前 補間後
- 17. 連鎖地図と物理地図の比較 1.2 M SNPs (WGS) vs 1.3 K SNPs (RAD-Seq)
- 18. まとめ ? RAD-Seqの成功のポイント – 制限酵素選び – ゲノム中のSNP密度 – ゲノム中の厂狈笔分布 ? RAD-Seq?GBSの次にあるもの ? 情報解析のことをよく知る（逆も然り） – 自分でできなくて良い – できても良い – 計算機でできること?できないことを知る – お互いの理解を深める