�ݺ�ߣ

VALIDASI
METODE
ANALISIS
KIMIA

5 Pertanyaan yang harus dijawab
• Apa itu validasi metode ?
• Mengapa validasi metode dibutuhkan ?
• Kapan anda memerlukan validasi metode ?
• Bagaimana cara anda memvalidasi ?
• Bagaimana anda mengenari suatu metode telah
• divalidasi ?

Apa itu Validasi Metode?
 Validasi : konfirmasi melalui pengujian dan pengadaan
bahwa tertentu untuk suatu maksud khusus dipenuhi
(Klausul 5.4.5.1)
 Validation : Confirmation, through the provision of
qbjectlVe eyiderca, that the requirements for a specific
intended use or application have been fulfilled

 Bukti objektif : data pendukung eksistensi sesuatu atau
kebenaran sesuatu.
 (Objective evidence : data supporting the existence or
verity of something)
 Persyaratan : kebutuhan atau harapan yang dinyatakan,
secara umum diterapkan dan menjadi keharusan.
(Requirements : needs or expectations that is stated,
generally implied or obligatory)

 Validasi metode adalah proses pembuktian bahwa metode
tersebut sesuai untuk maksud/tujuan tertentu.
 Method validation is then the process of proving that a
method is suitable for its inrtended purpose
 Proses validasi suatu metode biasanya sangat dekat dengan
proses pengembangan suatu metode.
 The process of validating a method is usually very close to the
process of developing a method

MENGAPA VALIDASI METODE
DIBUTUHKAN?

Mengapa Validasi Metode dibutuhkan?
Persyaratan Umum Kompetensi
Laboratorium Pengujian Dan Laboratorium Karibrasi
Validasi metode adalah sebuah
mandatory untuk lso 17025:2005
(klausul 5.4.5)
Bagian yang harus dikomunikasikan
kepada peranggan (Klausul 4.4.1)

Penyajian bukti ilmiah akan ujuk kerja metode yang digunakan
dan untuk komunikasi kepada semua pihak yang berkepentingan,
semua kreteria dan persyaratan yang ditetapkan

Mencapai hasil yang benar dan membuktikan
kebenarannya !
 customers mempercayai laboratorium
dalam hal hasil data yang valid dan
reliable. Validasi metode menjadi tahap
penting dalam mencapai tujuan ini.
 validasi Metode membantu praktisi
raboratorium dalam proses pembuktian
bahwa fungsi darisebuah metode telah
sesuai dengan tujuan.

Sistem Manajemen mutu :
validasi Metode seringkali rnenjadi
bagian dari prosedur legal atau bagian
dari perundang-u ndangan/peraturan.
Validasi Metode memungkinkan untuk
membandingkan hasil dari contoh
sampel yang dianalisis di laboratorium
yang berbeda-beda.

VALIDASI
1. Metode tidak baku
2. Metode yang dikembangkan laboratorium
3. Metode baku yang digunakan di luar lingkup
4. Metode baku yang dimodifikasi
ISO/IEC 17025:2005
Kapan Validasi Metode Dibutuhkan ?
Umum:
Sebuah metode harus divalidasi bila performance parameter metode
uji tersebut belum valid atau belum dibuktikan valid untuk penggunaan
problem analisis khusus.

Validasi metode diperlukan untuk :
A Pengembangan metode
 Evaluasi terhadap performance parameter
 Sebelum menggunakan metode yang dipublikasi
 Untuk mendapatkan jaminan bahwa hasil in-house
sesuai dengan hasil yang dipublikasi.

Validasi metode diperlukan untuk :
B Perubahan Penggunaan
Jenis sampel baru, level analit, penggunaan, dan perubahan
lingkungan kerja.
C Mengikuti Periode “tidak digunakan”
Terlalu lama tidak digunakannya metode tersebut di
laboratorium

Kapan Validasi & Kapan Verifikasi ?

Ayo memvalidasi metode !
Siapa?
Laboratorium yang sedang develop sebuah
metode bertanggung jawab atas benarnya
validasi metode tersebut.
• Metode tidak baku, metode yang
didesain/dikembangkan laboratorium,
metode yang digunakan di luar lingkup
yang dimaksud, penegasan serta
modifikasi dari metode baku.
Laboratorium yang menggunakan metode uji (official)
bertanggungjawab untuk mengecek bahwa metode yang
tervalidasi tersebut benar dalam penggunaannya.

Apa ?
Praktisi laboratorium harus menentukan
sejumlah parameter yangdiperlukan selama
proses validasi, dan initergantung tingkat
validasi yang diperlukan (The degree of
validation of the method)

Bagaimana ?
Seseorang harus merencanakan sebuah
eksperimen dengan tujuan mendapatkan data
karakteristik dari parameter pengukuran
(sebuah rencana matang dapat menghemat
waktu dengan karakterisasi parameter-
parameter yang berbeda melalui experimen
yang sama)

Hasil
 Seseorang harus dapat merrgambil
informasi yang berguna dari parameter
pengukuran (menggunakan Statistik dan
Excel)
 Seseorang harus mengambil kesimpulan
atas hasil yang didapat dalam sebuah
laporan yang mendetaii.

Parameter Utama yang harus Divalidasi

1 Ruang Lingkup Aplikasi
Menjelaskan {keadaan analit), bagaimana metode uji
menunjukkan kesesuaian pengukuran, pengujian analit
dalam suatu matrik dan pada level konsentrasi yang
diharapkan.

2 Rentang Ukur
Menjelaskan rentang konsentrasi dimana metode uji
diaplikasikan yang dinyatakan dalam presisi, akurasi
(trueness) dan linieritas.

3 Selektivitas
Menunjukkan kemampuan suatu metode membedakan
antara analit yang dituju dan komponen lain / bentuk-
bentuk analit lain yang mungkin ada dalam matrik.

3 Linearitas
Menentukan kemampuan suatu metode untuk
mendapatkan respon yang proporsional terhadap
konsentrasi analit.

 The Limit of Detection (LoD) is the lowest concentration that
can be detected with an acceptable confidence
 The Limit of Quantification (LoA) is the lowest concentration
that can be quantified with an acceptable precision and
accuracy
 Decision Limit (CCu), Detection Capability (CCF)
• The decision limit (CCcr) is the lowest concentration at which
one can be sure that the analyte is present (equal to or
greater than LoD).
• The detection capability (CCF) is the smallest content of the
substance that can be detected, identified andior quantified
in a sample iequal to or greaterthan LoQ)

4 Kebenaran (Trueness)
Kebenaran (trueness) suatu metode adalah ukuran
sejauh mana kedekatan hasil pengukuran dengan nilai
sebenarnya. Kebenaran hasil yang diperoleh lebih sering
disebut akurasi pengukuran/pengujian

5 Ketepatan (Precision)
Ketelitian menggambarkan tingkat kedekatan antara
hasil uji independen yang diperoleh dibawah kondisi
yang sama yang dinyatakan dalam repeatability
(pengulangan dengan perbedaan waktu yang relatif
singkat antar pengukuran independen) dan
reproducibility (pengulangan dengan perbedaan waktu
relatif lama antar pengukuran

Parameter Utama yang Harus Divalidasi
6 Robustness (Ruggedness)
Test Robustness adalah pengukuran kapasitas metode
uji untuk tetap tidak terpengaruh oleh perubahan kecil
dari lingkungan dan/atau kondisi operasional" Perlakuan
tersebut sengaja dilakukan untuk melitrat perubahan
karakteristik parameter metode uji.

Parameter Utama yang Harus Divalidasi
7
Ketidakpastian Pengukuran
(Measurement Uncertanity)
Ketidakpastian adalah suatu parameter yang terasosiasi
dengan hasil pengujian/ pengukuran, yang
mencerminkan ketersebaran nilai-nilainya yang layak
dimiliki pada benda yang diuji/ukur

BAGAIMANA MENGENALI METODE
YANG TELAH DIVALIDASI?

Bagaimana mengenali metode yang telah
divalidasi
• Evaluate method performance parameters
• Are target values achieved ?
YES
NO
Method is fit-for-purpose in its field of
application meaning that method is validated
More development required and method has
then to be revalidated

Kesimpulan
Validasi Metode sangatlah dibutuhkan! Walaupun akan
menambah biaya yang harus dikeluarkan namun tanpa validasi
metode, analisis bagaikan tanpa nilai.
There is not 1 way of performing validation : tingkat dan
parameter validdasi akan sangat bergantung pada keadaan
(kadangkala verrfikasi saja cukup). Dalam keadaan tertentu,
sebuah parameter penting bagi situasi khusus, dan tidak
significant pada situasi yang lain : use common sense !

 Validasi metode adalah sebuah proses yang harus
direncanakan berdasarkan 'reliable data'.
 Rekaman validasi harus memuat hasil validasi dan
karakteristik perrformance metode uji.
Kesimpulan

Field of Application : Selectivity
Validation of Anlytical
Methods Training

Field Of Application And Application Range
(Working Range)
Lingkup aplikasi (Field of Application) menjelaskan
keadaan analyte, matrix dan concentration yang
dengannya metode uji sesuai digunakan.
Sebuah metode tervalidasi untuk tujuan lingkup yang
spesifik tidak dapat digunakan untuk matrices yang lain.
Rentang aplikasi (Application / working Range)
menyatakan rentang dimana metode sesuai
peruntukannya, dinyatakan dalam precision, trueness dan
linearity.

Selectivity
Selectivitas (also called specificity or confirmation of
identity)  kemampuan untuk mengukur target analit
dengan keberadaan komponen-komponen lain dalam
matrik sampel.
Can A be accurately measured in the presence of B?

Selectivitas  parameter qualitatif
• Metode uji selektif/tidak selektif bila pengukuran A dengan
keberadaan B"
Selectivity
Pengujian selektivitas direncanakan dengan menggunakan
pengetahuan yang ada sebelumnya.
 Apa prinsip pengukurannya ?
 Jenis spesi kimia seperti apa yang dapat mengganggu dalam
pengukuran?
 Bentuk substansi apa saja (bagian dari analit) yang ada
dalam matrix?
 Apakah substansi-substansi tersebut dapat mengganggu
pengukuran?

What is the principle of the measurement?
Titration of the acid groups with NaOH
What kind of molecules can interfere with the measurement?
Other acids
 What substances (apart from the analyte) are present in the
matrix?
Sugars, minerals, organic acids, polyphenols....
Can any of those substances interfere with the measurement?
Yes, the other organic acids (citric acid, taftaric acid...)
Selectivity
Penentuan asam maleat dalam jus anggur merah dengan titrasi
asam-basa.
The method is not selective when measuring l--Malic acid in red grapejuice

Selectivity: Methodology
 L-Malic acid in grape juice by enzymatic determination
 The method is selective when measurlng L-Malic acid in
red grape juice

Selectivity: Methodology
L-Malic acid in grape juice by enzymatic determination
 What is the principle of the measurement?
Reaction af L-Malic with an enzyme
 what kind of molecules can interfere with the measurement?
Very strong acids (denaturation of enzyme)
Substances absorbing at 340nm
 What substances (apart from the analyte) are present in the
matrix?
Sugars, minerals, organic acids, polyphenols... .
 Can any of those substances interfere with the measu-
rement?
No

Bagaimana menetapkan selektivitas? (1 )
• Analisa A tanpa dan adanya B dalam sampel.
• Evaluasi pengaruh B (bandingkan averages dan standard
deviasi dan hasil keduanya)

Inserrt Teknik Statistik
• Uji statistik untuk nilai rata-rata (mean)
• Uji statistik untuk standard deviasi

Teknik Statistik
• Prinsip-prinsip statistik digunakan untuk menunjukkan tingkat
pengendalian, evaluasi data, mendesain pengukuran, rencana
sampling, dan mengambil keputusan.
• Persyaratan dasar penggunaan teknik statistik:
Sistem pengukuran stabil
Pengukuran individual independen satu terhadap lainnya
Pengukuran individual mewakili random dari populasi data
yang dihasilkan
• Proses pengukuran selalu terkontrol secara statistik

Teknik Statistik
Elilf dasar:
1,65, 1,15 1,00 1,05 1,35 1,65 1,15 1,35 1,15 1,67
Rank data,
1.00 1,05 1,15 1,15 1,15 1,35 1,35 1,65 1,65 1,67
Lrrnetic mean = average (rata-rata)
X = ixjn = (xr * *, * xg * .....Xn)/n
= 13,17114 = 1,37
Median = nilai tengah dari rank data
= (Xs + xa)12 = (1,15 + 1,35)12= 1,250
Range = perbedaan data maksimum dan minimum
= X1o - xl = 1,67 - 1,00 = 0,67

Teknik Statistik
Varian S2
Standard Deviation S
Coefficient Variance CV
Relative Standard Deviation RSD

Standard deviasi dari pasangan data
s = D / √2
D = perbedaan absolut antara pasangan data
Standard deviasi gabungan
Derajad kebebasan untuk masing-masing set data.
Derajad kebebasan adalan n-1 (n jumlah data)
Teknik Statistik

Teknik Statistik
(Uji nilai rata-rata, t test)
Standard deviasi dari duplikasi pengukuran
Membandingkan dua nilai rata-rata (t test)
t= (x-y)/sp
x_dan y nilai rata-rata
Sp standard deviasi gabungan
 Nilai t kemudian dibandingkan dengan nilai t tabel dengan
tingkat kepercayaan biasanya 95% dan derajad kebebasan
(degree of fredom of yang sama).
 Bila nilai t hitung > nilai t tabel, berarti nilai x dan y nyata
berbeda
 Bila nilai t hitung < nilai t tabel, berarti nilai x dan y nyata
tidak berbeda

Teknik Statistik (Uji Standard Deviasi)
 Membandingkan dua standard deviasi (F test)
F = S1
2 / S2
2
s1 dan s2 nilai dua standard deviasi dengan s1> S2
 Nilai F dibandingkan dengan nilai F tabel.
 Bila F yang dihitung > F tabel berarti perbedaan s1 > s, adalah
benar.
 Bila F yang dihitung < F tabel berarti tak ada perbedaan antara
s., dan $2
 Untuk uji t dan F perlu mengenal penggunaan tabel T dan F

F-Test at 95% Confidential Level

If This is Not Possible ....(2)
 Bandingkan dengan metode yang secara prinsip sama
sekali berbeda.
 Analisa dan bandingkan dengan material yang
terkarakteristik dengan baik (certified reference
materials)

• Analisa blank extracts dan check keberadaan interferences.
• Spike (masukan dengan akurat) blank extracts dan
bandingkan dengan larutan standard
If This is Not Possible ....(2)

How To Make a Method Selective
1. Analisa secara kristis significance dari
ketidakselektifan
• check tingkat dan jenis gangguan pada analit
dalam matrix
• Jika masih dibawah tingkat gangguan yang
menyebabkan efek yang significant, metode
mungkin cukup selektif tanpa modifikasi.

How To Make a Method Selective
2. Lakukan step isolasi sebelum
dilakukan analisa, dan jadikan bagian
dari keseluruhan metode.
3. Forget it and try a different method!

Limit of Detection (LoD)
Limit of Quantification (LoQ)

LoD, LoQ
Limit of quantification (LoQ) adalah konsentrasi
terkecil yang dapat dikuantifikasi dengan presisi
dan akurasi yang dapat diterima.
LoD
LoQ
The Limit of detection (LoD) adalah konsentrasi
terkecil yang dapat dideteksi dengan presisi dan
akurasi yang dapat diterima.

LoD, LoQ : Methodology
Bagaimana menentukan LoD and LoQ?
Situasi 1 Situasi 2
Noise dan pengukuran signal
(e.g. chromatographic or
spectrometric methods)
lndividual measurements
(e.g. gravimetric,
photometric, enzymatic,
titrimetric methods)

Situasi 1: Noise dan pengukuran signal
Spike blank samples dengan sejumlah kecil analit

Ukur signal dari base line hingga puncak peak (s)
dan bagi dengan noise (N)

Tentukan kadar analit yang memberikan perbandingan signall
noise 3 (LoD) atau 10 (Loa)

Jika blank sample tidak tersedia :
 Sampel dengan konsentrasi rendah tersedia, gunakan
prosedur yang sama dengan sampel konsentrasi rendah.
 Sampel konsentrasi rendah tidak tersedia, gunakan
prosedur yang sama dengan mengencerkan larutan
standard

Situasi 2: lndividual measurements
Lakukan pengukuran blank sampel 10 kali dan tetapkan
standard deviasi.

Apply the following formulas:
LoD = 3 * SD
LoQ = 10 * SD
Situasi 2: lndividual measurements

Special Situations
Jika blank sample
tidak tersedia?
Jika sampel
konsentrasi rendah
tidak tersedia?
Prosedur yang sama digunakan
dengan sampel konsetrasi rendah.
Prosedur yang sama digunakan
dengan reagen blank (dalam hal ini
penentuan LoD tidak diperlukan)

The Limit of decision (CCα) adalah konsentrasi terendah
dimana seseorang dapat yakin (dengan 1- α =99% confidence
level) bahwa analit ada dalam sampel :
• α is the probability of a false positive decision
= the result is positive although the analyte is not present
CCα ,CCβ

CCα ,CCβ
Detection capability (CCβ) adalah kandungan dari substance
terendah yang dapat dideteksi, diidentifikasi, dan atau
dikuantifikasi dalam sampel dengan tingkat kepercayaan 1- β
(umumnya 95%)
• β is the probability of a false negative decision = the
result is negative although the analyte is present

CCα ,CCβ
Bagaimana menetapkan CCc dan CC β?
• Procedure 1 : Prosedur kurva kalibrasi
• Procedure 2 : Variabilitas dari blank

Procedure 1: Kurva Kalibrasi
• Direkomendasi untuk metode kuantitatif bila blank sample
tersedia.
• Data yang digunakan untuk prosedur ini dapat juga
digunakan untuk penentuan trueness dan precision.

• Lakukan spike sampel dengan konsentrasi disekitar level
minimum performance yang diperlukan dan lakukan
pengulangan pengukuran sebanyak 6 kali.
• Analisa sampel dalam 3 periode yang berbeda
(repeatability dalam periode yang sama) dan
intermediate reproducibility antar periode)

• Plot response terhadap penambahan konsentrasi untuk
setiap periode.
• Hitunglah intercept untuk setiap periode
• Hitunglah standard deviasi dari intercept (SD intercept)

Procedure 2 :
Signal to noise or variability of the blank
a) Gunakan sampel konsentrasi rendah sesuai dengan level
performance yang diinginkan.
b) Analisa 10 kali sample tersebut
c) Hitunglah mean dan standard deviasi atau perbandingan
signal/noise.
d) CCα = Performance level + 1.64 SD or 3* . (signal to noise)
CCβ = CCU + 1.64 SD

Sensitivity, Linearity, Calibration
Curve

Linearity, calibration curve, sensitivity
Sensitivity
adalah perubahan respon karena perubahan
yang bersamaan dalam konsentarsi (slope of
the calibration curve)
penetapan kemampuan metode untuk
nendapatkan hasil test yang proporsional pada
konsentrasi analit
Linearity
Kurva
Kalibrasi
Menampilkan hubungan antara respon analit
dan konsentrasi.

Sensitivity
Sensitivity adalah perubahan dalam respon akibat
perubahan yang bersamaan dalam konsentrasi

Linearity : methodology
Ukur respon (paling sedikit 3 kali) pada paling sedikit 6 level
konsentrasi mengcover rentang 80-120o/o rentang kerja dan
rentang frequensi.

Plot konsentrasi analit yang berbeda-beda (X) terhadap respon
instrumen (Y) dan kaji secara visual.
Tetapkan kurva linier. Y = 10.034* X - "0012

Plot konsentrasi analit yang berbeda-beda vs respon
faktor respon/konsentrasi) dan kaji secara visual.

Linearity : Methodology
Correlation coefficient
Residual plot
Residual standard deviation
Standard error of regression coefficients
(slope and intercept)
Ases kesesuaian model (statistical parameters)

Ases kesesuaian model: correlation coefficient (r)
Aturan umum, ini harus sedekat mungkin dengan 1.

Assess kesesuaian model : correlation coefficient (r)

Assess kesesuaian model : Residual plot

Residual randomly distributed around the central line indicate
good linearity

A pattern in the residuals means a degree of non-linearity

In some cases the precision of the response is proportional to
the concentration of analyte

Dalam kasus – kasus tertentu, kemungkinan terjadi satu atau
lebih data outlier, ini harus diinvestigasi penyebabnya

Ases kesesuaian model: residual standard deviation (RSD)
memberikan suatu indikasi penyebaran nilai-nilai
disekitar fitted line.
Warning!! Berbeda dengan RSD (Relative Standard
Deviation)
Dapat digunakan dalam estimasi ketidakpastian dalam
konsentrasi
u(predicted concentration) = RSD / slope of calibration

Ases kesesuaian model: standard error of slope and intercept
- Check the confidence intervals of the slope and intercept
slope interval does not include zero
intercept interval includes zero
sound reason to use one-point calibration in routine analysis

Linearity : Methodology Summary
• Measure response (at least in triplicates) at least 6
concentrations levels covering a range going from 80-120 % of
the working range and evenly spaced
• Plot concentration against response factor
• Evaluate visually
• Plot concentration against response
• Calculate the fiffed line
• Plot of residuals
• Calculate statistical parameters
• Evaluate statistical parameters
• Critical evaluation of results

Linearity : Use of Q-Stat
Q-Stat Gives you graphics and coefficients that you need

Q-Stat Gives you graphics and coefficients that you need
Linearity : Use of Q-Stat

Non-Linear Calibration Curve
What if the response is not linear ?
1. Use the calibration curve only in the linear range

What if the response is not linear ?
2. Apply a transformation to your data to make it linear (log(x), 1/x ... )
Non-Linear Calibration Curve

To include in the validation file
 Parameters of the regression analysis
 Intercept, slope with 95% interval
 Correlation Coefficient
 Residual Standard Deviation
 Plot of the regression
 Residuals plot

Precision
Presisi menunjukkan kedekatan diantara hasil-hasil pengujian
yang independen dibawah kondisi yang ditentukan
(repeatability or reproducibility).

Precision Levels
Repeatability
(r)
Intermediate
Reproducibility (iR)
Reproducibility (R)
Laboratorium, analis dan peralatan
yang sama serta dalam interval waktu
yang pendek
Di dalam laboratorium: dilakukan pada
hari, oleh analis dan dengan peralatan
yang berbeda
Laboratorium, peralatan, dan analis
yang berbeda serta dalam interval
waktu yang lama.

How to express precision ?
Sebagai (Relative) Standard Deviation
- Ditentukan dari hasil replikasi pengujian dibawah kondisi
yang ditentukan.
Sebagai suatu Limit
- Mewakili maksimum toleransiterhadap perbedaan antar
duplikasi pada tingkat probalitas tertentu.
- Nilainya sama dengan 2.772.5D (at a 95% probability level)

Precision : Methodology
Bagaimana menghitung karakteristik presisi dari suatu metode?
1. Analisis beberapa sampel dalam replikat atau duplikat
(duplicates or replicates design)
2. Analisis satu sampel dalam replikat (simple design)

Repeatability designs
Duplicate/Replicate Design : analisis beberapa sampel dalam replikat
M : mean/median of
observations
SD(r) : Standard deviation
of repeatability
r : repeatability limit
Similar
Material
:
e.G
different
production)

Simple repeatability : analisis satu sampel dalam replikat
M : mean/median of
observations
of repeatability
r : repeatability limit

Duplicate/Replicate design
M : mean/median of
observations
of repeatability
iR : repeatability limit

Reproducibility designs
Simple reproducibility : analisis satu sampel
M : mean/median of
observations
of repeatability
iR : repeatability limit

Interlaboratories designs
• Dapat digunakan untuk
interaboratory study,
collaborative study atau ring
test
• Tujuan: Karakterisasi
reproducibility dan
repeatability untuk
digunakan lingkup
laboratorium yang luas
(banyak).

Precision: Summary
Simple designs (desain
sederhana)
• Analisa sampel dalam
replikat
• Jalankan test statistik"
detection nf outliers and
normality
• Tentukan karakteristik
presisi
• Evaluasi hasil
Duplicate/replicate designs
(desain duplikates/replikat)
• Analisa sampel dalan:
duplicates/replicates
• Jalankan test statistik :
detection of outiiers and
normality
• Tentukan karakteristik
presisi
• Evaluasi hasil

Precision: Summary
lnterlaboratory studies
• Analisa sampel oleh sejumlah laboratorium
• Jalankan test statistik
• Evaluasi hasil

Precision: How to decide?
Duplicate/Replicate
Analysis
- Untuk rentang yang luas
- Desain yang lebih disukai (umum)
- Baik dalam perhitungan repeatability
Single designs
- Untuk rentang yang sempit
- Hanya valid untuk satu level dan satu
matrik
Interlaboratory
studies
- Untuk metode yang
divalidasi/dikarakterisasi secara lengkap
- Untuk validasi penuh

Trueness (Kebenaran)
Trueness menunjukkan tingkat kedekatan antara nilai rata-
rata (average) yang didapat dari sejumlah serie pengukuran
dengan nilai reference (nilai benar)
Trueness ditunjukkan dengan nilai bias

Trueness: methodology
Bagaimana mengecek ada / tidak adanya bias ?
 Using certified reference materials (CRM)
 Using spiked samples
 Comparing two methods

Trueness: methodology (CRM)
Analyze certified reference material
X0 = reference value
µ = uncertainty associated to
the reference value
n = number of measures
(should be higher than 6)

Run Statistical Evaluation
M = mean/median of observation
SD = robust standard deviation of
observation
 Is M significantly different than
X0

Run statistical evaluation :
confidence intercals and significance test

Trueness: methodology (spiking)
Analyze spiked samples
X0 : native amount
Xs : spiked amount
X1 : final amount
u : uncertainty associated to
each value
n : number of measures (must be
higher than 6)

Analyze spiked samples
M = mean/median of observation
SD = robust standard deviation of
observation
 Is M significantly different than
X1 ??

Run Statistical evaluation : confidence intervals and significant
test

Run statistical evaluation:
confidence intervals and significance tests
Prefer TO USE CERTIFIED REFERENCE Materials

Design 1: Analyze one sample by the two methods

Trueness : methodology (comparison)
Design 1: Run statistical evaluation: confidence intervals
and significance test

Design 2: Analyze a number of samples oy the two methods
Ensure stobility befrteen pired measures

)
Design 2: Run statistical evaluation: analysis of differences
and analysis of regression
 Are method 1 and 2
comparable?
 Are the differences between
the result different from
zero?
 Are the two methods
correlated?

Trueness: Summary
Use of certified reference materials (CRM)
• Analyze cen-ified R*ference Material in repltcates
• Run stati*ctiealtests, detection of outliers and normaitty
• Run statisticatiests. confidence intervals and signifieance tests
• Evaluate results
Use of spiked samples
• Analyze spiked san:pies in replieates
• Run statistiealtests" detection cf outiiers and normality
• Run statistiealtest*, confidence intervals ancl signifi*ance tests
• Evaluate results
Comparing two methods
• Analyze samples by the two methocis
• Run statisiicaltests
• Evaiuate results

Trueness : Use of Excel files
Excel files give you the statistical evaluation and interpretation
that you need

Robustness
• Robustness (Juga disebut ruggedness) menunjukkan
kemampuan metode untuk tetap tidak terpengaruh oleh
perubahan kecil dari lingkungan dan/atau kondisi operasional.
• Robustness testing membolehkan analis mengidentifikasi
parameter eksperimen yang memiliki efek KUNCI pada
performance (kinerja) metode.
• Parameter kunci ini kemudian harus DIKONTROL

Robustness metode adalah menguji sebuah metode uji
dengan sengaja membuat perubahan kecil pada prosedur dan
mengevaluasi efeknya terhadap hasil uji.
Robustness

Typical key parameters
• pH of a solution
• Temperature of a reaction
• Extraction time
• Concentration of reagents...

How ?
• Setiap parameter diinvestigasi secara
terpisah masing - masing, tetapi …..
Time consuming and costly
• Desain eksperimen digunakan untuk
meminimise kondisi kerja yang
dipersyaratkan.

Experimental design : method
• ldentifikasi 3 parameter (A, B, c) untuk dipelajari
• ldentifikasi keadaan normal (levet 1) dan alternatif nilai –
nilai (level 2) untuk setiap masing-masing parameter.
• Lakukan 4 eksperimen yang dijelaskan berikut ini:
NEXT ….

Example
a) Suatu residu antibiotik diekstrak dari susu dengan
menggunakan pelarut.
b) Hasil ekstrak dituangkan kedalam suatu cartridge silika dan
dicuci dengan air.
c) Antibiotik kemudian dielusi dengan acetonitrile dalam air (5%
v/v) dan dikuantifikasi dengan RP-HPLC
d) Test robustness ini bertujuan untuk mengevaluasi step clean-
up
e) Test robustness digunakan pada sampel susu yang di"spike"
dengan antibiotik pada konsentrasi sekitaa 1,2 ug/l

Lakukan setiap eksperimen dengan replikat
(n=3) dan tentukan mean
Check masing - masing kelengkapan :
• Number of trials for each experiment
• Standard deviation of repeatability
• Number of replicates used for repeatability
calculation

• Check parameters yang mempunyai efek yang memberikan
efek significant terhadap metode.
• Kontrol parameter KUNCI dengan cara sedemikian rupa
sehingga tidak ada problem karena variasi parameter.
• lnilah cara yang disebut ROBUST

Working Range
• The working range defines the range of concentrations
where the method is applicable in terms of precision,
trueness ang linearity
• In terms of validation, it is necessary to evaluate working
range and confirm that it corresponds to the concentration
range demanded by the analytical requirement.
• Working range has to be larger than the application range !

How to determine the working range
One has to first precise:
The correct linearity range
The conect precision range
The correct trueness range
The intersection of these 3 ranges is the final working range

How to determine the working range

Penggunaan Data Validasi untuk
Quality Control Ghart
Program jaminan mutu pengujian klausul 5.9

Pembuatan Control Chart
• Control chart menampilkan nilai rata-rata untuk mendisply
kontrol mutu dari suatu proses analisis.
• Bila data standard deviasi dan mean dari sampel (QC sample)
dilakukan secara routine Control chart sangat disarankan
untuk
• Grafik Control Chart mengambarkan hubungan mutu hasil test
dari waktu ke waktu atau sequence pengujian dengan batasan
nilai (specs) sesuai dengan kontrol statistik yang telah
ditetapkan.

Tahapan rasional untuk membuat Control Chart:
Identifikasi elemen-elemen penting yang akan menyusun CC
Tetapan Tujuan
Pilih karakteristik yang akan diukur
Tetapkan how, where, and when karakteristik yang akan diukur
Tetapkan besarnya set data

Tahapan rasional untuk membuat Control Chart:
Tetapkan prosedur utk mendapatkan random sampel
Tentukan estimasi rerata proses dan SD utk jangka waktu lama
Buatlah lay out garis tengah (mean), garis peringatan dan batas
tindakan (action limit)

Types of control chart
1 Controls charts presisi dan akurasi didasarkan pada
material standard (CRM, SRM, Check Standard/working
Std):
• Kontrol standard harus di run 1 kali untuk setiap 20 sampel.
• 20 kali penentuan harus dibuat sebelum perhitungan statistik.

2 Controls charts presisi didasarkan pada duplikat analisis:
• Sampel test yang diuji haruslah di dalam range konsentrasi yang
sempit;
• SD selalu tergantung pada konsentrasi dan standard deviasi dari
perbedaan antara duplikat analisis juga tergantung pada
konsentrasi;
• Paling sedikit 10 duplikasi tgst (20 kali analisa) harus dilakukan
untuk membuat CC
• Perbedaan antara pasangan hasil diplot dengan nol sebagai nilai
yang diharapkan.

3
Controls charts presisi didasarkan pada "Spiking“
recovery tests
• CC ini ditujukan untuk penentuan bias dalam analisis, dan untuk
membuktikan berjalannya quality control dalam proses
pengujian;
• Spike recovery test hanya dapat digunakan dalam hal RSD
diketahui memiliki nilai yang kecil dan konsentrasi equivalen
"spike" yang ditambahkan berkisar antara 1 s/d 10 kali
konsentrasi analit dari "unspike" sample;

4
Plots of values of blank determinations on a segmented
chart
• lni sebenarnya bukan CC karena tidak ada nilai control limit;
• Chart sangat sederhana, plot respon yang diperoleh secara
sequential dengan nol sebagai base line.

Type of Control Charts (lanjutan)

Interpretation of Control Chart
Interpreting X-chart Interpreting R-chart
• Satu atau lebih titik ada di luar
tiga standard deviasi (3S)
lakukan tindakan, atau
• Dua atau lebih secara konsekutif
(berturut-turut) keluar dari dua
standard deviasi (2S) lakukan
tindakan, atau
• Suatu serie 7 titik atau lebih
dibawah atau di atas nilai rata-
rata, arnbil tindakan, atau
• Kecendrungan naik atau turun"
• Sama seperti X-chart,
lima atau lebih secara
konsekutif titik-titik ada
di atas 50 % confidence
limit menunjukkan
kecendrungan proses di
luar pengendalian.

Estimasi Besaran Ketidakpastian
Metode Uji
dari Data Validasi Metode

Ketidakpastian Pengujian
• Validasi Metode menggunakan larutan
baku (primer atau sekunder, RM/CRM),
maka standard deviasi dapat dianggap
sebagai ketidakpastian baku (individu) asal
larutan baku dan asal presisi metode. (type
A)
• Komponen lain (ketidakpastian baku lain)
diambil sesuai perlakuan metode
pengujian. (Type A/B)
Data hasil validasi metode sangat berguna dalam menentukan
ketidakpastian pengujian.
BILA

• Estimasi ketidakpastian pengukuran 100 mg sulfat (SO4) dalam
air buangan secara kromatografi ion dari data quality control
chart
• Estimasi ketidakpastian pengukuran ini ditentukan berdasarkan
data individual quality control chart ion sulfat.
• Laboratorium menggunakan control chart untuk menjamin mutu
pengujian sulfat dengan menggunakan secara teratur larutan
baku sekunder 10 mg/l yang diukur langsung, Standar deviasi
diperoleh sebesar 3,8%. Sementara 100 mg/l sampel dilarutkan
menjadi 10mg/L dan dilakukan pengukuran. Pengulangan
keseluruhan pekerjaan ini sebanyak 10 kali menghasilkan
standar deviasi 1 %.
Ketidakpastian Pengujian

Reporting
 lni sangatlah penting untuk mendokumentasikan semua
prosedur validasi dan hasil-hasilnya
 Laporan rinci haruslah berisi informasi yang cukup sehingga:
• Metode yang divalidasi dapat diimplementasi secara
ielas
• Tidak ada bukti yang meragukan sehingga metode
yang dimaksud dapat secara aman digunakan (untuk
tuiuan audit atauPeraturan (regulasi)

Reporting: Validation File Contents
1. Deskripsi metode, prinsip – prinsip
dan batasan – batasan penggunaan.
Deskripsi dari metode, prinsip dan
limitasi.
2. Peruntukan penggunaan (analyte yang
diukur , matrices dan concentrations)
serta rentang kerja (working range

3. Performance characteristics :
• selectivity (possible interferences)
• linearity range
• Limits of detection and quantification (if applieable)
• Truenes (reference materials, corparison with other
methods)
• Precision (r, iR, R)
• Measurement uncertainty
• External validation
4. References

1. Halaman Cover :
• Nama laboratorium, logo, Alamat Lab
• Laporan: Judul , No. Laporan dan Tanggal -Bulan – Tahun
Laporan
• Nama-nama yang terlibat dalam Validasi Metode Uji
2. Halaman Pengesahan:
• Berisi nama-nama pelaksana Validasi Metode, tanda tangan
dan tanggal pengesahan
• Nama Manajer Mutu, tanda tangan dan tanggal pengesahan
• Nama Manajer Teknis terkait, tanda tangan dan pengesahan
• ldentitas No. Rekaman Valldasi Metode
Format Laporan

3. Ringkasan
4. Daftar isi
5. Isi
6. Lampiran
Format Laporan

ANALISIS dan METODE STATISTIK
Uji statistik untuk nilai rata-rata (mean)
Uji statistik untuk standard deviasi
Confidence interval untuk Mean dan
Standar Deviasi
Tolerance interval
Outlier

Confidence Interval Untuk Standar Deviasi
S & Mean Lnterval
confidence interval s/x adalah nilai range dari standar deviasi atau
mean dimana di dalam nilai tersebut s/x masih dapat diterima
sesuai derajat kebebasan dan tingkat kepercayaan yang diambil
(α=0,05).

Tolerance lntervals
Tolerance interval menunjukan batas nilai dimana di dalamnya
populasi data diharapkan ada dengan tingkat probabilitas yang
ditetapkan.
• Tolerance interval (interval toleransi) = X ± ks
• Dengan k . faktor yang ditentukan berdasarkan persentasi
populasi p, probabilitas dan jumlah pengukuran n untuk
menghitung X dan s
• k diperoleh dari tabel tolerance interval dua arah untuk
normal distribusi.
X == rata – rata

Outlier
Outlier nilai individual yang berada di luar
populasi atau secara statistik memiliki
nilai kurang dari probabilitas yang
dipersyaratkan.
Cara menilai data outlier:
Aturan kesalahan Huge Dixon Test Grubbs Test

Outlier
Aturan Huge
Jika Xq adalah data yang diduga outlier, X dan s masing –
masing adalah mean dan standar deviasi.
M ditetapkan sebagai nilai batas M ≥ 4 sebagai batas
penolakan (outlier)

Outlier
Dixon Test
Berdasarkan data yang telah dibuat ranking :
X1 < X2 < X3 < X4< X5 < X … <Xn
Tetapkan apakah X1 atau Xn yang dicurigai outlier
Hitung rasio statistik berikut untuk X1 atau Xn
Bandingkan rasio (statistik) dengan nilai tabel Dixon Test
Bila ratio < dari nilai tabel yang sesuai nilai X tidak outlier

Outlier
Grubbs Test
 Buat rangking data berdasarkan kenaikan
X1 < X2 < X3 < X4< X5 < X … <Xn
 Tetapkan apakah X1 atau Xn yang dicurigai outlier
 Hitung standar deviasi s dengan seluruh data
 Hitung nilai T sebagai berikut :
 Bandingkan nilai T dengan nilai tabel Grubbs Test
 Bila T < T tabel Grubbs maka nilai X1 atau Xxn dapat diterima,
jika sebalaikanya berarti outlier

�ݺ�ߣ

Validasi-Metode-Analisis-Kimia. Tailand book

Recommended

More Related Content

Similar to Validasi-Metode-Analisis-Kimia. Tailand book (20)

More from AndrsPacompa (12)

Recently uploaded (6)

Validasi-Metode-Analisis-Kimia. Tailand book