More Related Content
What's hot (20)
Viewers also liked (11)
More from Dama Kamelijama (16)
Amilaza 2014
- 1. 1 留-Amilaza Predavanja iz Klinike enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija- medicinska biohemija kolska 2014/2015. godina
- 2. 2 Pankreasni enzimi Amilaza Lipaza Proteolitiki enzimi - zimogeni enzimi Tripsin Himotripsin Elastaza Karboksipeptidaza
- 3. 3 留-Amilaza Uloga amilaze Distribucija Izoenzimi Kliniki znaaj Analitika
- 4. 4 留-Amilaza Alfa-amilaza (EC 3.2.2.1.) 1,4-alfa-D-glukan glukanohidrolaza; AMY Klase hidrolaza Katalizuje hidrolizu 1,4-alfa-D-glikozidnu vezu u polisaharidima Enzim ne deluje na 1,6-glikozidnu vezu na mestima granjanja 1,4-alfa-D-glikozidna veza
- 6. 6 留-Amilaza Oba poliglikana i pravi lanci (linearni) kao 邸to je amiloza i razgranati poliglikan kao 邸to je amilopektin se hidrolizuju ali u razliitim koliinama U sluaju linearnih lanaca amiloze enzim cepa lanac na alternativnim alfa-1,4- hemiacetalnim vezama (-C-O-C-), dajui maltozu i ostatke glukoze; U sluaju razgranatih lanaca amilopektina nastaju maltoza, glukoza i neki dekstrini.
- 7. 7 留-Amilaza Struktura pankreasne alfa-amilaze Amilaze su metaloenzimi zavisni od kalcijuma Kalcijum je potreban za funkcionalni integritet Puna aktivnost se posti転e u prisustvu odreenih anjona: hlorida, bromida, nitrata, holata ili monohidrogen fosfata hlorid i bromid su najefikasniji aktivatori AMY iz humanog seruma ima pH optimum na 6,9-7,0 (vrlo uzak opseg) AMY iz humane plazme su mali molekuli Mm varira od 54000 do 62000 Da Enzim je dovoljno mali da prolazi kroz glomerularnu membranu bubrega AMY je jedini plazmatski enzim prisutan u urinu !
- 8. 8 留-Amilaza Najvi邸i nivoi su naeni u: salivarnim 転lezdama S-tip Deluje na hranu u ustima i ezofagusu pankreasu P-tip Deluje pri alkalnom pH duodenuma Distribucija po organima i telesnim tenostima AMY je prisutna i u semenoj tenosti, testisima, ovarijumi, falopijevim tubama, popreno-prugastim mi邸iima, pluima i adipoznom tkivu Enzim je prisutan i kolostrumu, suzama i mleku Epitelijalni tumori plua i ovarijuma isto tako mogu da sadr転e AMY AMY u ascitu i pleuralnoj tenosti se javlja zbog prisustva tumora ili kod pankreatitisa
- 9. 9 Izoenzimi 留-amilaze Enzim prisutan u normalnom serumu uglavnom je P-AMY ili S-AMY tip Ova dva izoenzima su produkti dva bliska lokusa na hromozomu 1 AMY izoenzimi podle転u post-translacionim modifikacijama: deamidaciji, glikozilaciji i deglikozilaciji i grade izoforme Neenzimska deamidacija je verovatno mehanizam za starenje koji se de邸ava kod pankreasne pseudociste ili usled produ転enog stajanja seruma Iako P-AMY nije glikoziliran, S-AMY mo転e da postoji u obe forme i kao glikoziliran i kao deglikoziliran Ove izoforme se mogu razdvojiti i u serumu i u urinu primenom izoelektrofokusiranja ili elektroforezom Osobe sa deficijencijom P-AMY u retkim sluajevima, pokazuju znake maldigestije ugljenih hidrata 邸to rezultira abdominalnom naduto邸u, gasovima, itd.
- 10. 10 Kliniki znaaj 留-amilaze Aktivnost AMY u krvi je fiziolo邸ki niska i konstantna Porast amilaze u serumu 1. Akutni pankreatitis 2. Inflamaciji salivarnih 転lezda Akutni pankreatitis Porast serumske amilaze 5 do 8 sati od pojave simptoma Aktivnosti se tipino spu邸taju na normalu posle treeg ili etvrtog dana Uobiajen je porast od 4 do 6 puta iznad URL Pik vrednosti za 12 do 72 sata Veliina porasta serumske amilaze nije povezana sa te転inom oboljenja Vei porast vea je verovatnoa akutnog pankreatitisa
- 11. 11 Kliniki znaaj 留-amilaze Akutni pankreatitis Postoje sluajevi normalnih vrednosti amilaze u akutnom pankreatitisu 19- 32% pri prijemu pacijenta Uzroci: 1. Odlo転eni porast amilaze 2. Insuficijencija pankreasa sekundarno kod hroninih alkoholiara 3. Hipertrigliceridemija interferencija sa odreivanjem alfa-amilaze La転no negativni rezultati Uklanjanje lipemije
- 12. 12 Kliniki znaaj 留-amilaze Izluivanje amilaze urinom klirens amilaze iz cirkulacije Deo povi邸ene amilaze se izluuje i putem urina Porast aktivnosti serumske amilaze odra転ava se i na porast amilaze u urinu U poreenju sa serumskom amilazom, porast amilaze u urinu je vei i perzistira du転e vremena Klinika specifinost Klinika specifinost amilaze u dijagnostici akutnog pankreatitisa je niska 20 do 60 %, zavisno od pacijenata koji su obuhvaeni u ovim proraunima Poveanje amilaze naeno i u nekim intrabdominalnim bolestima i u nekoliko ne-pankreasnih stanja (vidi tabelu)
- 13. 13 Pankreasne bolesti Intraabdominalne bolesti razliite od pakreatitisa Genito-urinarne bolesti Razne bolesti P-AMY Pankreatitis Trauma pankreasa P-AMY Bilijarne bolesti Intestinalne obstrukcije Mezenterini infarkt Perforacija peptikog ulkusa Gastritis Ruptira aortne aneurizme Akutni apendicitis Peritonitis Trauma P-AMY Ektopino kod rupture trudnoe u tubama Salpingitis Maligniteta ovarijuma Renalne insuficijencije P i S tip S-AMY O邸teenje salivarnih 転lezda Akutnog alkoholizma Dijabetine ketoacidoze Makroamilazemija P i S tip Septiki 邸ok Hirurgije srca Tumora Lekova Uzroci hiperamilazemije
- 14. 14 Kliniki znaaj pankreasne 留-amilaze Nedostatak specifinosti 留-amilaze je usmerilo ispitivanja na merenje P-amilaze umesto ukupne enzimske aktivnosti za diferencijalnu dijagnozu pacijenata sa akutnim abdominalnim bolom Ukoliko se primeni najbolja granica odluivanja (aktivnost koja je ekvivalentna poveanju od 3X URL) klinika specifinost P-amilaze za dijagnozu akutnog pankreatitisa je vea od 90 % Vrednosti P-AMY ostaju poveane u 80 % pacijenata sa nekomplikovanim pankreatitisom jednu nedelju posle pojave, dok samo 30 % jo邸 uvek pokazuje poveanje ukupne AMY Dugorono poveanje P-AMY u serumu samo utie na to da je izli邸no merenje ukupne AMY u urinu test koji se primenjuje da bi se postigla bolja dijagnostika senzitivnost u kasnoj fazi pankreatitisa
- 15. 15 Kliniki znaaj 留-amilaze Hronini hepatitis Vrednosti amilaze mogu biti i normalne Oboljenje bilijarnog trakta, kao 邸to je holecistitis, uzrokuje poveanje od 4 puta u aktivnosti serumske P-AMY, a kao rezultat primarnog ili sekundarne ume邸anosti pankreasa Razni intrabdominalni dogaaji dovode do znaajnog porasta u aktivnosti serumske P-AMY i do 4x i vi邸e Ova poveanja su posledica izlaska amilaze iz intestinuma u peritonealnu 邸upljinu a potom u cirkulaciju U renalnoj insuficijenciji aktivnost serumske amilaze se poveava proporcionalno o邸teenju bubrega obino ne vi邸e od 5x u odnosu na URL
- 16. 16 Kliniki znaaj 留-amilaze Hiperamilazemija se javlja u neoplastinim oboljenjima Tumori plua Kanceri ovarijuma serozni i me邸ani (serozni i mukozni) kanceri dovode do hiperamilazemije sa poveanim S-tipom izoenzima (tj.elektroforetska pokretljivost je kao S-izoenzima) poveanjem od 50 x URL Isto tako su opisani sluajevi produkcije amilaze kod multiplog mijeloma U sluajevima rupture ektopine trudnoe izoenzimi amilaze nisu dobro okarakterisani. Poveanje vrednosti amilaze mogu biti P-tipa (ukljuenost pankreasa u peritonitisu) iako je S-tip prisutan u falopijevim tubama Sni転enje serumske P-AMY (ispod donje granice) je visoko specifino za egzokrinu pankreasnu insuficijenciju i u tom sluaju se ne primenjuju intubacioni testovi Ukoliko je P-AMY normalna, redukovana funkcija pankreasa se ne mo転e iskljuiti
- 17. 17 Makroamilazemija Uestalost makroamilazemije: 1,95 % u sluajnom uzorku 2,56% kod osoba sa hiperamilazemijom 0,98 % kod osoba sa normalnom serumskom amilazom Kompleksi amilaze (vi邸e S-tipa) i IgG i IgA Ovi makroenzimi se ne mogu filtrirati kroz glomerule zbog njihove veliine (Mm vea od 200 000) i ostaju i plazmi gde njihovo prisustvo poveava vrednost amilaze u serumu 2-8x
- 18. 18 Makroamilazemija Stanje Serumska Serumska Amilaza u Cam:Ccr Serumska Amilaza Lipaza urinu makroamilaza Pankreasna odsutna Hiperamilazemija Salivarna N ili N ili N odsutna Hiperamilazemija Makroamilazemija N Tip 1 Makroamilazemija N ili N Tip 2 Makroamilazemija N N N ili N u tragovima Tip 3 Cam : Ccr = klirens amilaze : klirens kreatinina = (Ua/Sa)x (SCr/UCr
- 19. 19 Kliniki znaaj makroamilazemije Makroamilazemija nije nikakvo oboljenje zato 邸to nema klinikih simptoma koji prate njegovu pojavu To je steeno benigno stanje koje se javlja kod zdravih osoba i e邸e kod mu邸karaca Obino se javlja u periodu izmeu 5-7 decenije 転ivota. Pojava makroamilazemije mo転e biti rani znak pojave bolesti, ali vi邸e kao nespecifian marker Bole邸u indukovana disproteinemija dovodi do stvaranja kompleksa proteina sa amilazom Bolest vezana za stvaranje imunokompleksa
- 20. 20 Laboratorijska dijagnostika makroamilazemije Kliniki va転no je izdiferencirati makroamilazemiju od drugih stanja vezanih sa hiperamilazemijom Pacijent sa hiperamilazemijom, niskim odnosom amilaza/kreatinin klirens (< 1%) i normalnom renalnom funkcijom mora se testirati tj poi od predpostavke da je mogua makroamilazemija Definitivno identifikacija makroamilazemije zahteva direktan dokaz postojanja molekula tehnikom ultracentrifugiranja, hromatografije ili drugim fizikim metodama Detekcija hromatografijom je kori邸ena mnogo godina kao brza i jednostavna metoda zasnovana na selektivnoj precipitaciji makroamilaze u polietilen glikol rastvoru Napomena: Cam : Ccr = klirens amilaze : klirens kreatinina = (Ua/Sa)x (SCr/UCr)
- 21. 21 Odreivanje aktivnosti 留-amilaze Istorijski gledano postoje: saharogene, amiloklastine Wolgemunth hromolitike metode Supstrat je bio skrob Ranije su bile metode izbora za odreivanje aktivnosti AMY.
- 22. 22 Odreivanje aktivnosti 留-amilaze Nove metode Metoda sa dobro definisanim supstratom sa kraim glikozil lancima Kori邸enje definisanog supstrata kao i pomonih i indikatorskih enzima u AMY testu je pobolj邸alo stehiometriju reakcije i dovelo je do poveane kontrole i konzistentnih uslova hidrolize Supstrati koji se koriste ukljuuju kratke oligosaharide Kada se hidrolizuju sa AMY, mali oligosaharidni supstrati daju tano definisane produkte u odnosu na hidrolizu skroba Supstrati maltopentoza i maltotetroza pokazuju - dobru stabilnost - konzistentne produkte hidrolize - odgovarajuu stehiometriju reakcije
- 23. 23 Odreivanje aktivnosti 留-amilaze Nove metode A. Odreivanje amilaze metodom sa glukoza-6-fosfat dehidrogenazom B. Odreivanje amilaze metodom sa 4-nitrofenil-(4NP)-glikozidnim supstratom C. Odreivanje amilaze metodom sa blokiranim supstratom EBS D. Odreivanje amilaze direktnom metodom sa indikatorom 2-hlor-p- nitrofenil
- 24. 24 A. Odreivanje amilaze metodom sa glukoza-6-fosfat dehidrogenazom Supstrat maltotetroza Meri se NADH na 340 nm Svaka hidrolizovana veza daje 2 molekula NADH Nema glukoze i nema maltotrioze Ni転e vrednosti aktivnosti amilaze
- 25. 25 B. Odreivanje amilaze metodom sa 4-nitrofenil-(4NP)- glikozidnim supstratom Supstrat: 4-nitrofenil-(4NP)-glikozidni 4-NP-G(n) maltoheptoza Pomoni enzim: 留-glukozidaza
- 26. 26 B. Odreivanje amilaze metodom sa 4-nitrofenil-(4NP)- glikozidnim supstratom 4-NP-glikozidni supstrati se pripremaju vezivanjem 4-nitrofenil ostatka na redukujui kraj definisanog oligosaharida Oligosaharid maltoheptoza (G7) onda je supstrat 4-NP-G7 AMY cepa supstrat i nastaju slobodni oligosaharidi (G5,G4 i G3) i 4- NP-G2 (9%), 4-NP-G3 (31 %) i 4-NP-G4( (60%) Specifinost izoenzima P-AMY hidrolizuje supstrat u veoj koliini nego S-tip u odnosu od 1,8:1 G6, G1, 4-NP-G6 i 4-NP-G5 ne stvaraju se u dovoljnim koliinama
- 27. 27 B. Odreivanje amilaze metodom sa 4-nitrofenil-(4-NP)- glikozidnim supstratom U originalnoj metodi rezultat kombinovane hidrolize AMY iz uzorka i sa reagensom 留-glukozidazom (EC 3.2.1.20; maltaza) nastaje vi邸e od 30 % slobodnog NP Slobodan NP se meri na 405 nm 留-glukozidaza ne reaguje sa oligosaharidom du転im od 4 glikozil ostataka po jednom molekulu G4 se hidrolizuje ali vrlo sporo
- 28. 28 C. Odreivanje amilaze metodom sa blokiranim supstratom EBS Supstrat: EBS (ethylidene protected substrate) etilidin blokirajui supstrat blokirajua grupa je 4,6-etilidin Kovalentna veza Na neredukujui kraj Va転nost ove metode ? Stehiometrijski odnos
- 29. 29 C. Odreivanje amilaze metodom sa blokiranim supstratom EBS Fragmenti koji nastaju iz etilidin-4-NP-G7 supstrata su: 4-NP-G2 (40%), 4-NP-G3 (40%) i 4-NP-G4 (20%) Oslobaanje 4-NP je poveano, a reakciona brzina smanjena proporcionalno, tako da ova dva efekta kompenzuju jedan drugi Novi tip 留-glukozidaze (rekombinantni enzim AGH-211) koji u potpunosti hidrolizuje nitrofenilatnisupstrat Kao rezultat cepanje jedne 留-glikozidne veze sa AMY dolazi do oslobaanja jednog molekula 4-NP IFCC je optimizirao ovu metodu na 370C i preporuuje se kao referentna metoda
- 30. 30 Supstrat: 2-hlor-p-nitrofenil-alfa-D-maltotriozid (CNP-G3) D. Odreivanje amilaze direktnom metodom sa indikatorom 2-hlor-p-nitrofenil Karakteristike metode: Direktna metoda Nedostatak je mala brzina konverzije supstrata u poreenju sa sa esejom G4, G5 i G7; Varijacija u molarnoj apsorpciji CNP je vezana za promene: u temperaturi, pH i sadr転aju proteina prisustva aktivatora, kalijum tiocijanata, koje dovodi do alosternih promena amilaze
- 31. 31 Biolo邸ki materijal Amilaza u serumu ili hepariniziranoj plazmi Izuzev heparina svi ostali antikoagulansi inhibiraju aktivnost amilaze tako 邸to vezuju kalcijum Citrat, oksalat i EDTA inhibiraju aktivnost 15 % Odreivanje u porciji urina Stabilnost Amilaza je stabilna 4 dana na sobnoj temperaturi 2 nedelje na 4oC 1 godina na -25oC 5 godina na -75oC Referentne vrednosti Zavise od metode IFCC preporuuje 37oC i onda su RV 28 do 100 U/L
- 32. 32 Metode separacije i odreivanja izoenzima 留-amilaze elektroforeza jonoizmenjivaka hromatografija izoelektrofokusiranje selektivna inhibicija S-AMY pomou inhibitora iz klice 転itarica imunoprecipitacijom sa monoklonalnim antitelima i imunoinhibicijom
- 33. 33 Metode separacije i odreivanja izoenzima 留-amilaze Selektivna inhibicija izoenzima pomou monoklonalnih antitela pokazuju zadovoljavajuu preciznost i tanost Praktino i analitiki dovoljno brzi da omogue uvoenje P-AMY u klinikoj praksi Esej sa duplim monoklonalim antitelima je komercijalno dostupan koji koristi sinergistiko dejstvo dva imunoinhibitorna antitela na S-AMY Nakon inhibicije S-AMY aktivnosti, neinhibirana aktivnost P-AMY se meri kori邸enjem supstrata EPS-4-NP-G7 Ovaj esej je specifiniji i obzirom na cenu i mogunost primene automata on mo転e u potpunosti da zameni ukupnu AMY
- 34. 34 Metode separacije i odreivanja izoenzima 留-amilaze La転no pozitivni rezultati P-AMY kod makroamilazemije Imunoglobulin je kompleksiran sa amilazom i spreava monoklona antitela de efikasno inhibiraju S-AMY Razdvajanje makroenzima elektroforezom Ukoliko nije mogua elektroforetsko razdvajanje makroenzima kompleks se mo転e precipitirati sa PEG rastvorom 6000 (240 g/L) Rezidualna aktivnost AMY je manja od 30% u supernatantu je indikativno da je u pitanju makroamilazemija
- 35. 35 Elektroforetsko razdvajanje izoenzima amilaze M- makroamilazemija P/S sme邸a dva uzorka pankreasnog soka i salive S saliva Posle elektroforeze, makro-AMY obino daje 邸iroku traku, jasno razdvojenu od homogenih traka izoenzima amilaze prisutnih u serumu
- 36. 36 Kod zdravih osoba P-AMY je oko 40-50 % od ukupne aktivnosti AMY u serumu Primenom imunoinhibicije na 37o C referentni interval za aktivnost P-AMY je 13-53 U/L Serumska P-AMY se ne mo転e detektovati kod dece manje od 6 meseci, ali aktivnost se polako poveava i dosti転e vrednost odraslih do 5 godine 転ivota i ovo je rezultat postnatalnog razvoja egzokrine funkcije pankreasa Kod dece ne mo転e koristiti amilaza za dijagnozu akutnog pankreatitisa ve se onda koristi lipaza Referentne vrednosti za izoenzime 留-amilaze