More Related Content
What's hot (15)
More from Dama Kamelijama (9)
Analitika izoenzima 2014
- 1. AnalitiAnalitike metode separacijke metode separacijee ii odre単ivanjodre単ivanjaa izoenzimaizoenzima Predavanja iz Klinike enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija-medicinska biohemija kolska 2014/2015. godina
- 2. Razlike u osobinamaRazlike u osobinama multiplihmultiplih formiformi enzimaenzima Katalitike razlike Izoenzimi sa multiplim genskim lokusima Km za supstrate se razlikuje Osetljivost na inhibitore Aktivnost sa analozima supstrata Izoenzimi nastali post traslacionim modifikacijama Sline katalitike aktivnosti Antigenska svojstva Rezistencija na denaturaciju Toplotom Koncentrovanim rastvorima ureje Naelektrisanju molekule Zonska elektroforeza Jonoizmenjivaka hromatografaija Izoelektrofokusiranje Molekulskoj veliini Molekularno prosejavanje Gel filtracija
- 3. Metode separacijeMetode separacije izoenzimaizoenzima Elektroforetske Hromatografske Hemijska i temperaturna inaktivacija Kinetika svojstva Imunohemijske metode
- 4. ElektroforetskeElektroforetske tehnike u analizitehnike u analizi izoenzimaizoenzima Razne elektroforetske tehnike su u upotrebi za separaciju izoenzima, ali generalno one se ne koriste rutinski zato 邸to: dugo traju te邸ko je kvantifikovati relativno su skupe Izoelektrofokusiranje se uspe邸no primenjuje za separaciju izoformi koje se razlikuju samo u koliini kovalentno vezanih ostataka 邸eera, kao 邸to je sijalinska kiselina.
- 5. Jonoizmenjivaka hromatografija omoguava da se izoenzimske molekule razdvajaju na osnovu naelektrisanja molekule pri odre単enom pH Tipian jonoizmenjivaki materijal je DEAE celuloza u kojoj se jonizabilne DEAE grupe vezane za matrix inertnu celulozu Jonoizmenjivaka hromatografija generalno ne razdvaja tako dobro kao zonska elektroforeza vrlo sline proteine, ali zato se vee koliine proteina-enzima mogu razdvojiti sa dobrom enzimskom aktivno邸u ova tehnika ima veliki znaaj za prei邸avanje enzima Druge forme hromatografije se koriste za frakcionisanje izoenzimskih sme邸a i to su HPLC i afinitivna hromatografija. Afinitivna hromatografija se zasniva na razlikama izoenzima u njihovom afinitetu za specifine ligande koji su vezani za inertan nerastvoran potporni nosa koji se koristi kao stacionarna faza u hromatografskoj koloni HromatografskeHromatografske tehnike u analizitehnike u analizi izoenzimaizoenzima
- 6. Hemijska i toplotnaHemijska i toplotna inaktivacijainaktivacija Selektivna inaktivacija izoenzima pod kontrolisanim uslovima Metoda se zasniva na razlikama u stabilnosti koja proistie iz malih promena u strukturi proteinskih molekula. Denaturacija enzima: Povi邸ena temperatura Koncentrovani rastvor ureje ili drugih reagenasa Brzina enzimske inaktivacije ovim agensima je kritino zavisna od uslova eksperimenta. Uslovi se moraju strogo kontrolisati ukoliko se uzorci 転ele porediti Primer: razdvajanje izoenzima i izoformi ALP toplotnom inaktivacijom
- 7. KatalitiKatalitika svojstvaka svojstva izoenzimaizoenzima Razlike u katalitikim svojstvima izoenzima: 1. Razlike u vrednostima Km relativnim brzinama reakcija sa analozima supstrata Kada specifinost enzima omoguava varijacije u strukturi supstrata 2. pH optimum 3. Uticaj inhibitora - Razlike izme単u izoenzima produkata multiplih genskih lokusa Razlike predstavljaju osnovu za metode identifikacije i merenja odre単enog izoenzima Ove tehnike se generalno ne koriste rutinski i uglavnom su zamenjene sa imunohemijskim metodama
- 8. ImunohemijskeImunohemijske metode odre単ivanjametode odre単ivanja izoenzimaizoenzima Imunohemijske metode analize izoenzima se praktino mogu primeniti za izoenzime produkte multiplih genskih lokusa antigenski razliiti izoenzimi Primena monoklonskih antitela je uvelo imunohemijske metode u odre単ivanju multiplih formi enzima jer je vea mo razdvajanja Dve vrste imunohemijskih metoda: 1. Merenje mase 2. Merenje aktivnosti Neke metode koriste katalitiku aktivnost izoenzima Na primer rezidualna aktivnost izoenzima se meri posle reakcije sa antitelima Radioimunoesej Kompeticija radioaktivno obele転enih izoenzima sa neobele転enim izoenzimima za vezujua mesta na antitelima Ne zavise od katalitike aktivnosti odre単ivanog izoenzima Automatizovane imunohemijske metode za merenje izoenzima uobiajene rutinske metode za merenje izoenzima primer: merenje masene koncentracije izoenzima CK-MB ELISA na vrstoj fazi
- 9. ElektroforetskeElektroforetske tehnike razdvajanjatehnike razdvajanja izoenzimaizoenzima Razliiti potporni medijumi Razdvajanje na osnovu naelektrisanja Celuloza acetata Agaroza Razdvajanje na osnovu naelektrisanja i veliine molekule Skrobni gel Poliakrilamidni gel Razdvajanje slino razdvajanju proteina seruma
- 10. Aparatura zaAparatura za elektroforetskoelektroforetsko razdvajanjerazdvajanje izoenzimaizoenzima HorizontalnaHorizontalna elektroforezaelektroforeza
- 11. ElektroforetskiElektroforetski sistem za analizusistem za analizu izoenzimaizoenzima VertikalnaVertikalna elektroforezaelektroforeza Vertikalna elektroforezaSistem nano邸enja uzoraka
- 12. ispravlja struje kada za elektroforezu sudovi za bojenje i odbojavanje aplikator ElektroforetskiElektroforetski sistem za analizusistem za analizu izoenzimaizoenzima
- 14. Metode detekcije razdvojenihMetode detekcije razdvojenih izoenzimaizoenzima Hromogene metode bojenja Kisela fosfataza bojenje za fenolftalein fosfatom Fluorogene metode bojenja 4-metilumberiferil NADH i NADPH Radioaktivno bojenje Hemijsko bojenje derivatima alfa i beta-naftola Enzimske reakcije gde dolazi do prenosa elektrona U upotrebi su dva sistema bojenje: MTT metil tiazolil tetrazolijum kao akceptor za dehidrogenaze 3-amino-9-etilkarbazol kao akceptor za oksidaze i peroksidaze
- 15. FluorogeneFluorogene metode bojenjametode bojenja
- 17. Hemijske formule alfa i betaHemijske formule alfa i beta--naftolanaftola za hemijskoza hemijsko bojenjebojenje izoenzimaizoenzima
- 18. Druga komponentaDruga komponenta diazodiazo bojenjabojenja
- 19. Hemijska detekcija sa diazo reakcijom: alfa-naftol i FAST GARNET
- 20. Esteraza 3 Beta naftil acetata Fast blue RR
- 21. Dehidrogenaze DetekcijaDetekcija reakcija sa transferom elektronareakcija sa transferom elektrona U upotrebi su dve boje: 1. MTT metil tiazolil tetrazolijum akceptor za dehidrogenaze 2. 3-amino-9-etilkarbazol akceptor zaza oksidazeoksidaze ii peroksidazeperoksidaze Reagens rastvor sadr転i MTT i PMS (Fenazin metosulfat) Redukcijom MTT donorom elektrona nastaje tamno plavi, nerastvoran formazan
- 22. BojenjeBojenje tetrazolijumtetrazolijum solimasolima Stvaranje nerastvornog formazana redukcijom: a) MTT metiltiazolil blue b) NBT nitroblue tetrazolium
- 23. Boje sa transferom elektronaBoje sa transferom elektrona 3-amino-9-etilkarbazol akceptor za oksidaze i peroksidaze
- 24. Metode separacije iMetode separacije i kvantifikacijekvantifikacije izoenzimaizoenzima LDLD 1. Elektroforeza na agaroznom gelu i celuloza acetatu je metoda koje se naje邸e koristi za razdvajanje izoenzima LD Nakon razdvajanja izoenzima LD elektroforezom reakciona smesa se preliva preko potpornog medijuma. Reakciona smesa: L-laktat 500 mmol/L, NAD+ 13 mmol/L, pufer pH 8,0. Oslobo単eni NADH u zonama LD aktivnosti se detektuje: fluorescencijom na UV 365 nm redukcijom tetrazolijum soli u obojeni formazan. Referentne vrednosti LD-1 4-26% LD-2 29-39% LD-3 20-26% LD-4 8-16% LD-5 6-16 %
- 25. DenzitometriranjeDenzitometriranje izoenzimaizoenzima laktatlaktat dehidrogenazedehidrogenaze Analiza zimograma A normalni serum (1) B akutni infarkt miokarda LD1 (8) C malignitet LD3 (4) D kongestivno o邸teenje srca i LD5 povean zbog kongestivnog o邸teenja jetre (5)