More Related Content
What's hot (20)
Viewers also liked (15)
More from Dama Kamelijama (11)
Laktat dehidrogenaza 2014
- 1. Laktat dehidrogenaza Predavanja iz Klinike enzimologije Integrisane akademske studije: Farmacija- medicinska biohemija kolska 2014/2015. godina
- 2. Laktat dehidrogenaza Enzim anaerobne faze glikolize EC 1.1.1.127 L-laktat: NAD+ oksidoreduktaza; LD ili LDH Katalizuje reakciju oksidacije L-laktata u piruvat NAD+ je akceptor vodonika
- 3. Uloga koenzima NAD u reakciji laktat dehidrogenaze
- 5. Katalitiki ciklus laktat dehidrogenaze Vezivanje koenzima za enzim i pomak petlje 98-111 Katalitika trijada: arginin 171 histidin 195 i arginin 109 Vezivanje supstrata za aktivni centar Redoks reakcija: transfer vodonika sa NADH na piruvat transfer protona Oslobaanje laktata Pomak petlje i oslobaanje NAD+
- 6. Izoenzimi LDH 5 izoenzima LD-1 (HHHH; H4); LD-2 (HHHM; H3M) ; LD-3 (HHMM; H2M2); LD-4 (HMMM; HM3) i LD-5 (MMMM; M4). Obele転avanje prema elektroforetskoj pokretljivosti LD-1 najvea anodna pokretljivost
- 7. Struktura LD: H i M subjedinice Kinetike karakteristike M-muscle mi邸ini Sadr転i vi邸e bazne aminokiseline Putuje sporije Tkiva sa visokom glikolitikom aktivno邸u Anaerobni uslovi LD M4 ima nisku Km za piruvat Favorizuje redukciju piruvata Visoka konc piruvata ne inhibira M4 izoenzim Genski lokus na hromozomu 11 H-heart srani Sadr転i vi邸e kisele ostatke aminokiselina Negativno naelektrisan Putuje br転e anodno Tkiva sa poveanom potro邸njom kiseonika Aerobna tkiva (srani mi邸i) LD H4 ima vi邸u Km za piruvat Vi邸ak piruvata alosterno inhibira LDH4 Vi邸e oksidacija laktata Genski lokus na hromozomu 12 Dva gena su specijalizovana za razliita tkiva Razlike H i M subjedinica u afinitetu za supstrat, vrednostima Km i inhibiciji piruvatom
- 8. Distribucija LD i izoenzima LD LD aktivnost je prisutna u svim elijama organizma Citoplazmatini enzim Koncentracija enzima u svim tkivima je 1500 do 5000 puta vea nego u serumu Svako o邸teenje elije pa i minimalno znaajno poveava aktivnost LD u serumu Mala dijagnostika specifinost ovog serumskog enzima Serumski izoenzimski profil: LD 2 >LD 1> LD 3 > LD 4 > LD 5
- 9. Distribucija LD i izoenzima LD Razliita tkiva pokazuju razliit izoenzimski profil Srani mi邸i, bubrezi i eritrociti Elektroforetski br転i izoenzimi Anodni izoenzimi LD-1 i LD-2 dominiraju Jetra i skeletni mi邸ii Elektroforetski sporiji izoenzimi Katodni izoenzimi LD-4 i LD-5 dominiraju Mada u sluaju o邸teenja mi邸ia javljaju se i anodni izoenzimi Izoenzimi intermedijarne pokretljivosti se nalaze u mnogim tkivima: slezini, plua, limfne 転lezde, leukociti i trombociti
- 10. Distribucija izoenzima laktat dehidrogenaze u razliitim organima
- 11. Distribucija izoenzima laktat dehidrogenaze u serumu Serumski izoenzimski profil laktat dehidrogenaze: LD 2 >LD 1> LD 3 > LD 4 > LD 5
- 12. Distribucija izoenzima LD u testisima Neki genski lokusi mogu biti eksprimirani samo u jednom tkivu, kao rezultat odreenog stupnja razvoja. Pored dva genska lokusa koji odreuju dve uobiajene subjedinice laktat dehidrogenaze, trei lokus je aktivan samo u zrelim testisima. Trei tip subjedinica, X ili C, koji daje specifian izoenzim, LD-X ili LD-C koji se nalazi u testisima esti izoenzim Sedmi izoenzim ili LD-6 je identifikovan u serumu te邸ko obolelih.
- 13. Promene u distribuciji izoenzima kod fetusa i beba Moj glavni izoenzim LD je HM3 ?? Kod fetusa srce je u anaerobnim uslovima Dominira M4 izoenzim Prelaz postepeni u HM3 Bebe imaju na roenju HM3 Posle H2M2 1.godina H3M 2.godina H4
- 14. Primeri razlika u distribuciji izoenzima laktat dehidrogenaze u srcu i jetri kod odraslih i fetusa
- 15. Kinetike karakteristike LD Specifinost prema supstratima HBD izoenzim Inhibicija LD 1. LD je inhibiran reagensima koji deluju na SH grupe Merkuri jon i p-hloromerkuribenzoat Reverzibilna inhibicija Dodatak cisteina ili glutationa 2. Kompetitivni inhibitori za supstrat ili produkt reakcije Borat i oksalacetat Kompeticija sa laktatom za vezivanje za isto mesto na enzimu Oksamat Kompeticija sa piruvatom za isto mesto vezivanja. 3. Inhibicija supstratima Piruvat i laktat u vi邸ku inhibiraju enzimsku reakciju Piruvat vi邸e inhibira Inhibicija supstratom se smanjuje ako se povea pH 4. EDTA inhibira enzim verovatno vezujui Zn.
- 16. Kliniki znaaj LD i izoenzima Obzirom na 邸iroku rasprostranjenost u svim tkivima, poveane vrednosti aktivnosti LD u serumu se javlja u raznim klinikim stanjima: infarktu miokarda hemolizi bolesti jetre, bubrega, plua i mi邸ia Odreivanje aktivnosti serumske LD u dijagnostici: infarkta miokarda, hemolitike anemije, tumora ovarijuma i tumora germinalnih elija testisa. Za praenje bolesti LD je relevantna kao prediktor pre転ivljavanja kod Hodkinsonove bolesti i non-Hodkinovog limfoma i za praenje disgerminoma.
- 17. Kliniki znaaj LD Akutni infarkt miokarda Ukupna LD Izoenzimski profil Izoenzimi LD LD-1 i LD-2 (留-HBD) Specifinost prema supstratu 留-hifroksibutirat Dinamika promena LD i izoenzima 留-HBD u akutnom infarktu miokarda Porast enzima posle AIM u satima ili danima Poreenje sa ostalim sranim markerima
- 18. 18 Biohemijski markeri akutnog infarkta miokarda Neenzimski Mioglobin Troponin I Troponin T Enzimski CK CK MB aktivnost CK MB masa AST LD HBD Glikogen fosforilaza BB Rani markeri Do 6 sati od simptoma Kasni markeri 6 sati od simptoma i ostaju nekoliko dana
- 19. 19 Biohemijski markeri akutnog infarkta miokarda Specifini cTnT cTnI CK-MB masena CK-MB aktivnost Novi markeri Glikogen fosforilaza bb Laki lanci miozina LMC LMC-myosin light chains Nespecifini Mioglobin AST LD CK
- 20. 20 Kriterijumi za kardijane biomarkere Kardijani biomarkeri su biolo邸ki analiti koji se mogu detektivati u cirkulaciji u toku KVB ili posle o邸teenja miokarda Idealni kardijani marker se karakteri邸e Visoko specifian za tkivo sranog mi邸ia i odsutan u drugim ne-sranim tkivima Visoku dijagnostiku senzitivnost Biomarker da bude lako dostupan Biomarkeri rane dijagnoze Mali solubilni molekuli sa br転om kinetikom oslobaanja i brzim klirensom iz o邸teenog tkiva se smatraju odgovarajuim biomarkerima rane dijagnoze Biomarkeri kasnije dijagnoze Stabilan biomarker sa dugim polu転ivotom u plazmi Pik vrednosti (maksimalne vrednosti biomarkera) se moraju brzo dostii i da ostanu visoke vrednosti u cirkulaciji nekoliko sati Ovo je karakteristika cTnI i cTnT Brz klirens biomarkera je va転an za povratna o邸teenja reinfarkt
- 21. Dinamika u promenama enzimske aktivnosti izoenzima LD i HBD u odnosu na druge enzime u infarktu miokarda LD HBD Rani markeri Kasni markeri
- 22. LD i izoenzim LD-1 u dijagnostici akutnog infarkta miokarda Kasni markeri AIM LD LD-1 Porast posle AIM 12-18 h 10-12 h Pik aktivnosti 48-72 h 72-144 h Pad na URL 6-10 dana 10 dana Dug polu転ivot izoenzima Doprinosi dijagnostikoj osetljivosti posle 24 h 90 % Pomak LD-1 u odnosu na LD-2 LD-1/LD-2 > 1 Specifinost ovog koeficijenta je 75 % Izoenzimi LD-1 i LD-2 HBD alfa-hidroksibutirat dehidrogenaza 22
- 23. Akutni infarkt miokarda LD-2 LD-1 Normalan uzorak LD i izoenzim LD-1 u dijagnostici akutnog infarkta miokarda Elektroforetsko razdvajanje izoenzima LD Pomak LD-1 u odnosu na LD-2 LD-1/LD-2 > 1
- 24. Kliniki znaaj LD Hemolizne anemije Razliiti uzroci: uroeni defekti membrane eritrocita, uroeni nedostaci enzima, talasemije, hemoglobinopatije, paroksizomalna nona hemoglobinurija, antitela, splenomegalije, mehanika trauma i direktni toksini efekti Hemoliza, ukoliko je velika, produkuje izoenzimski profil koji je slian kao kod infarkta miokarda Megaloblastna anemija posledica nedostatka vitamina B12 raspadanje prekurzora eritrocita u ko邸tanoj sr転i (neefektivna eritropoeza) oslobaanje velikih koliina LD-1 i LD-2 izoenzima LD se poveava u megaloblastnoj anemiji i do 50 X URL Primena adekvatne terapije brzo sni転ava LD na normalu
- 25. Kliniki znaaj LD Oboljenja jetre LD je povean u bolestima jetre Poveanja nisu tako velika kao poveanje aminotransferaza Velika poveanja kod toksinog hepatitisa sa 転uticom i do 10x Malo poveanje kod virusnog hepatitisa i infektivne mononukleoze gde je obino povean LD 3 Kod ciroze jetre i opstruktivne 転utice LD je normalna ili dva puta uveana u odnosu na URL Izoenzim LD-5 je znaajno povean kod pacijenata sa primarnim oboljenjem jetre ili kod hipoksije jetre sekundarno zbog sni転ene perfuzije kiseonikom
- 26. Kliniki znaaj LD Maligniteti LD je povean kod 70 % pacijenata sa metastazama na jetri 20 do 60 % pacijenata sa drugim nehepatinim metastazama imaju poveanu ukupnu LD LD-1 je povean kod tumora germ elija (61% sluajeva) Kod pacijenata sa seminomima LD-1 je povean u 63% sluajeva u odnosu na 60% koji nemaju ovaj tip tumora Broj pacijenata sa poveanim LD-1 zavisi od stupnja bolesti Pokazalo se da je LD-1 koristan prediktor ishoda kod pacijenata sa tumorom na germitivnim elijama testisa LD kao tumorski marker Mala specifinost
- 27. Poreenje aktivnosti laktat dehidrogenaze u normalnoj eliji i u kanceroznoj eliji LD i malignitet Aktivnost LD u kanceroznim elijama
- 28. Promene u distribuciji izoenzima LD u bolestima Onkofetalni enzimi Pojava fetalnih uzoraka distribucije izoenzima je pojava maligne transformacije u mnogim tkivima. Prvi enzim koji je izuavan je laktat dehidrogenaza Maligni tumori u naelu pokazuju znaajan pomak u ravnote転i izoenzima ka elektroforetski vi邸e katodnim formama poput LD-4 i LD-5 Pad aktivnosti izoenzima LD-1 i LD-2 rezultuje pojavom profila koji je reminiscencija enzimskog profila u embrionalnom tkivu Tumori prostate, cerviksa, dojki, mozga, 転eluca, kolona, rektuma, bronha i limfnih 転lezdi pokazuju ove transformacije. Benigni gliomi pokazuju relativni porast u anjonskim izoenzimima.
- 29. Kliniki znaaj LD LD u likvoru Kod zdravih osoba LD u likvoru je mnogo ni転a od serumske LD Obino LD-4 i LD-5 se ne mogu detektovati Uzorak je te邸ko protumaiti ako je prisutna i hemoragija ili o邸teenje mo転dane barijere bole邸u pri emu LD iz cirkulacije prelazi u likvor Izoenzimi LD se mogu osloboditi iz elija koje su infiltrirane u likvor Bakterijski meningitis - granulocitoza dovodi do povi邸enja LD-4 i LD-5 Virusni meningitis - limfocitoza dovodi do vi邸ih izoenzima od LD-1 do LD-3 Malignitet metastaze dovode do povi邸enja LD-5
- 30. Makro LD Stvaranje autoantitela - enzimski kompleks Poveava aktivnost enzima u cirkulaciji Uestalost 1: 10000 Dodatna abnormalna traka na elferogramu Znaaj odreivanja makroenzima: da se izbegnu dodatna ispitivanja
- 31. Reakcija je reverzibilna i reakciona ravnote転a favorizuje reversnu reakciju redukcije piruvata u laktat (P L). Uslovi Reakcija L P pH optimum 8,8 do 9,8 u optimiziranoj reakcionoj smesi za LD-1 temp 370 C. NAD+ 9 mmol/L L-laktat 80 mmol/L Reakcija P L pH optimum 7,4 do 7,8; temperatura 370 C NADH 300 umol/l piruvat 0,85 mmol/L Laktat dehidrogenaza: odreivanje aktivnosti
- 32. Optimalan pH varira u zavisnosti od dominantnog izoenzima u uzorku temperature koncentracije supstrata pufera Specifinost prema supstratu pojedinih izoenzima: Supstrati: laktat, 2-hidroksi kiseline ili 2-oksokiseline Katalitika oksidacija 2-hidroksibutirata, sledeeg vi邸eg homologa laktata, u 2- oksobutirat odgovara izoenzimu 2-hidroksibutirat dehidrogenazi (HBDH ili 留- HBDH). LD ne deluje na D-laktat NAD+ slu転i kao koenzim Laktat dehidrogenaza: odreivanje aktivnosti
- 33. Metode odreivanja aktivnosti LD Supstrati Rutinske metode koriste i piruvat i laktat kao supstrat Reakcija L P ili Reversna reakcija P L Referentna metoda Poslednjih godina vi邸e se koristi reakcija L P kao kontinuirana referentna metoda Optimizirana za LD-1 Preporuena od strane IFCC komiteta za enzime Referentna metoda za odreivanje ukupne LD je ova metoda na 370C Warburgov optiki test Merenje porasta apsorbancije NADH na 340 nm 334 nm, 340 nm i 366 nm
- 34. Biolo邸ki materijal Prednost se daje serumu za odreivanje aktivnosti LD Plazma mo転e biti kontaminirana trombocitima koji sadr転e puno LD Serum se mora odvojiti odmah od koaguluma Hemolizovan serum se ne mo転e koristiti jer eritrociti sadr転e ak 150 puta vi邸e LD (uglavnom LD-1 i LD-2) Stabilnost enzima i izoenzima i uvanje uzoraka Izoenzimi se meusobno razlikuju po osetljivosti na hladnou, pri emu LD-4 i LD-5 su posebno labilni i njihova se aktivnost gubi ukoliko se uvaju na -200 C Najbolje je serum uvati na 40C u toku 3 dana Referentne vrednosti Zavise od direkcije reakcije tj od supstrata RV za IFCC metodu na 370C su 125 do 220 U/L RV su vi邸e kod dece 180-360 U/L i postepeni pad u toku detinjstva Metode odreivanja aktivnosti LD
- 35. Metode separacije i kvantifikacije izoenzima LD 1. Elektroforeza na agaroznom gelu i celuloza acetatu Metoda koje se naje邸e koristi za razdvajanje izoenzima LD Nakon razdvajanja izoenzima LD elektroforezom reakciona smesa se preliva preko potpornog medijuma Reakciona smesa obino sadr転i L-laktat 500 mmol/L, NAD+ 13 mmol/L obino rastvoreno u puferu pH 8,0 Osloboeni NADH u zonama LD aktivnosti se detektuje: 1. fluorescencijom detektuje se UV 365 nm 2. redukcijom tetrazolijum soli u obojeni formazan Bojenje tetrazolijum solima plavi formazan
- 36. Detekcija razdvojenih izoenzima LD redukcijom tetrazolijum soli u obojeni formazan
- 37. Elektroforetsko razdvajanje izoenzima LD Denzitometrijska kvantifikacija izoenzima LD Referentne vrednosti LD-1 4-26% LD-2 29-39% LD-3 20-26% LD-4 8-16% LD-5 6-16 %
- 38. Normalan uzorak Akutni infarkt miokarda LD-1 LD-2 Malignitet LD-3 Kongestivno o邸teenje srca sa poveanim LD-5 zbog kongestije jetre i hipoksije LD-5
- 39. Metode separacije i kvantifikacije izoenzima LD 2. Selektivna inhibicija LD-2 do LD-5 i omoguavaju odreivanje samo izoenzima LD-1 Inhibitori su: 1,6-heksandiol, natrijum perhlorat, gvanidin tiocijanat 3. Imunoprecipitacija Antiserum (kozji) na LD-5 se koristi za merenje LD-1 Antiserum precipitira LD-2 do LD-5 U supernatantu ostaje LD-1