Gsワークショップ2017 資料(細谷将先生講演）
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2017年11月12日開催ワークショップ「NGSデータの多彩な活用」https://sites.google.com/site/radseqincer/ngs-workshop2017 での細谷先生ご講演分のスライドです
![[DDBJing33] ゲノムワイド多型を利用した遺伝解析の実際](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/33ddbjingshirasawa-151120004737-lva1-app6891-thumbnail.jpg?width=560&fit=bounds)
![[All-in-one2016] ゲノム配列と蛋白質立体構造の統合的検索とモデリング](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/kawabata-180109063341-thumbnail.jpg?width=560&fit=bounds)
![[DDBJjing34] DRA(DDBJ Read Sequence Archive) の紹介](https://cdn.slidesharecdn.com/ss_thumbnails/34ddbjingfukuda-171228013306-thumbnail.jpg?width=560&fit=bounds)
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Gsワークショップ2017 資料(細谷将先生講演）
- 2. 狈骋厂による多型解析革命
- 7. 全部を比べるのは効率がわるい ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ?? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
- 8. 一部の標識（マーカー）を比べる ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
- 9. 表現型と関連性のあるマーカーが見つかる ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
- 15. 多型解析すると何ができる？ GWAS (genome-wide association study)-log10(Pvalue) コンセンサス C A T G A G T A T C G A T T T A C T - - - - - - - - - - - - - A - - - C - - - - - - - - - - T - - - - - - C - - - T - - A - - G - - G - - - - - - C - - - - - C - - - - - - - - - - - - - - - A - - - - - C - - - - - - - - - - - - - - - - - - G - - G T - - - - - T - A - - G - - G - A G T - - - - T - - A C - G - - G - - G T - - C - - - - - - - - - C G - - G - - - - - - - A A - - - - C - - - G - - 小さい個体 大きい個体 大きさを決めるSNP(gttgttだと大きい)
- 16. (表現型) ＝ (個体の能力) ＋ (性などの影響) ＋ (残差) 表現型の類似性 ≒ ゲノムの類似性 多型解析すると何ができる？ GS/GP (genomic selection/prediction) 全ゲノム上に配置した無数のSNP座の アリルの共有具合（ゲノムの類似性）から 表現型を予測できる。
- 18. 制限酵素断片長（RFLP/AFLP）多型 ? PCR産物の制限酵素処理後の断片長の多型 ? DNA配列の差を検出する遺伝マーカー ? 配列そのものの情報を必要としない ? 頻度は制限酵素の認識配列依存 L: サイズマーカー A: ホモ接合 C: (カウンター) ホモ接合 D: ヘテロ接合
- 19. 祖 父 祖 母 父 母 子 1 子 2 子 3 子 4 マイクロサテライト ? DNAの単純繰り返し構造の多型 ? (CA)n, (GAC) n など ? 数千塩基に一回の頻度で出現 ? 代表的な遺伝マーカー
- 20. 一塩基多型（SNP） ? DNA一塩基の多型 ? A, C, G, T のどれか（大抵は2種類） ? 数百塩基に一回の頻度で出現 ? 最近では主要な遺伝マーカー
- 21. 一塩基多型（SNP） ? DNA一塩基の多型 ? A, C, G, T のどれか（大抵は2種類） ? 数百塩基に一回の頻度で出現 ? 最近では主要な遺伝マーカー
- 22. 一塩基多型（SNP） ? DNA一塩基の多型 ? A, C, G, T のどれか（大抵は2種類） ? 数百塩基に一回の頻度で出現 ? 最近では主要な遺伝マーカー 課題は、 どうやって見つけてくるのか
- 23. どうやって多型サイトを見つけてくる? ? 古典はコロニーハイブリダイゼーションや クローニングなど ? 最近では次世代シーケンサーで読めば良い CHR POS REF ALT N01 N2 N3 20 14370 G A 0|0 1|0 1/1 20 17330 T A 0|0 0|1 0/0 20 1110696 A G,T 1|2 2|1 2/2 20 1230237 . T 0|0 0|0 0/0
- 24. どうやって多型判定(ジェノタイピング)する? ? 古典は電気泳動やサンガーシーケンス ? 最近ではSNP chip/array ? あるいは次世代シーケンサーで読めば良い SNP chip/array NGS (Miseq)
- 26. どうやって多型判定(ジェノタイピング)する? 電気泳動によるマイクロサテライト解析 200個体、150遺伝子座 → 3か月 NGSによるSNP解析 300個体、3000遺伝子座 → 2週間 革命的にハイスループット化された
- 27. 必要 リシーケンス GBS ターゲットPCR GBS = Genotype-by-sequencing マーカー数 対象解析 104～106 103～105 ～103 手法 リシーケンス RAD-seq ddRAD-seq … etc. Ampliseq TruSeq … etc. 参照配列 不必要 MIG-seq GRAS-Di … etc. ランダムPCR 102～104 必要不必要 GWAS GS 集団解析 GWAS GS 集団解析 GS 集団解析 GWAS? GS 集団解析 バイアス 低い コスト 高い 中くらい 低い 低い低い 中くらい 高い 開発コスト 低い 低い 高い低い NGSを用いた主な多型解析法とその特徴
- 34. ? Hiseq2000 ? 1レーンあたり200Mリード（single end） ? 100個体解析の場合、2.0Mリード/個体 ? 平均25xで読む場合、80,000遺伝子座/個体 SNP座がどのくらい含まれる？ 個体間で共通して取れてくるSNP座はどのくらい？ １．RAD-seq（宮城県のギンザケ）
- 35. ? Hiseq2000 ? 1レーンあたり200Mリード（single end） ? 100個体解析の場合、2.0Mリード/個体 ? 平均25xで読む場合、80,000遺伝子座/個体 SNP座がどのくらい含まれる？ 個体間で共通して取れてくるSNP座はどのくらい？ １．RAD-seq（宮城県のギンザケ） トライ&エラーが必要
- 36. １．RAD-seq（宮城県のギンザケ） n = 89 n = 61 家系1 家系2 1対1交配で得た2家系を利用 多型のコール or 連鎖地図作製 R/qtl ddRAD-seq De novo dDocent Reference map + FreeBayes Hiseq2000 1 lane
- 37. １．RAD-seq（宮城県のギンザケ） 166 サンプル 平均リード数：79,081 平均：50k loci 平均：211k loci Reference based genotyping by FreeBayes De novo genotyping by dDocent (被覆率 7x 以上)
- 38. １．RAD-seq（宮城県のギンザケ） ジェノタイプ率 ≧ 90%以上, MAF ≧ 0.05, SNP数 ≧ 3 連鎖地図の作製 dDocent Mapping 家系1 ♂ 連鎖群数：30 総SNP数：470 連鎖群数：33 総SNP数：584 連鎖群数：79 総SNP数：3,611 連鎖群数：87 総SNP数：4,308 家系2♂
- 39. １．RAD-seq（宮城県のギンザケ） ジェノタイプ率 ≧ 90%以上, MAF ≧ 0.05, SNP数 ≧ 3 連鎖地図の作製 dDocent Mapping 家系1 ♂ 連鎖群数：30 総SNP数：470 連鎖群数：33 総SNP数：584 連鎖群数：79 総SNP数：3,611 連鎖群数：87 総SNP数：4,308 家系2♂ ? 参照配列がなくても十分なデータが 取れるが、あった方がデータ量多い。 ? 参照配列の有無が影響しない解析法 の開発が望まれる。
- 40. ? Miseq reagent v2 kit = 出力4Gbp ? 350個体、3,000サイト、 150bp でシーケンス ? データ量：被覆率20x： 3.15Gbp ? データ量：被覆率25x： 3.95Gbp いわゆるカタログ値 ２．Amplicon sequence （長崎県のトラフグ）
- 41. ? Miseq reagent v2 kit = 出力4Gbp ? 350個体、3,000サイト、 150bp でシーケンス ? データ量：被覆率20x： 3.15Gbp ? データ量：被覆率25x： 3.95Gbp いわゆるカタログ値 ２．Amplicon sequence （長崎県のトラフグ） トライ&エラーが必要
- 42. ? Miseq (v2) 300cycle kit ? 326個体、3182SNP座 ? トラフグ参照配列にマッピング（BWA） ? Samtools/GATK ２．Amplicon sequence （長崎県のトラフグ）
- 45. ２．Amplicon sequence （長崎県のトラフグ） 相関係数=0.99 1回目のラン 2回目のラン 被覆率の再現性 （ 濒辞肠耻蝉毎の平均?异なる326个体）
- 48. ２．Amplicon sequence （長崎県のトラフグ） ? 予想される規模のデータが得られた ? シーケンス後の解析はシンプル ? プライマーの設計にかかる労力が大きい ? ターゲットサイトを恣意的に選んでいるので、 個体群動態などの推定に利用できるかは不明
- 49. まとめ ? NGSにより多様なデータ取得法が開発された ? 必要なサンプル数、loci数で手法を選択 ? プールできる検体数とシーケンスする領域は トレードオフ ? DRY解析（下流の解析）の複雑さとプライ マー設計の労力もトレードオフ
Editor's Notes
- #45: 各サイトの被覆率について、最小値、Q1、Q2、average、Q3、最大値を出す。 最小値で昇順にソートして、5未満のサイト数を数えると2031サイト。 Q1で昇順にソートして、5未満のサイト数を数えると530サイト。 最小値→各サイトにおけるcoverageの最小値が5未満のサイト数 Q1 →各サイトにおけるcoverageのQ１が5未満のサイト数 中央値→各サイトにおけるcoverageの中央値が5未満のサイト数 平均値→各サイトにおけるcoverageの平均値が5未満のサイト数 Q3 →各サイトにおけるcoverageのQ3が5未満のサイト数 最大値→各サイトにおけるcoverageの最大値が5未満のサイト数