Pasquale Saldarelli – La piattaforma genomica di sequenziamento massivo della rete SELGE: genomi, metagenomica ed elaborazione bioinformatica dei dati
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La piattaforma genomica di sequenziamento massivo della rete SELGE: genomi, metagenomica ed elaborazione bioinformatica dei dati
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Pasquale Saldarelli – La piattaforma genomica di sequenziamento massivo della rete SELGE: genomi, metagenomica ed elaborazione bioinformatica dei dati
- 1. La piattaforma genomica di sequenziamento massale della rete SELGE: genomi, metagenomica ed elaborazione bioinformatica dei dati P. Saldarelli Istituto di Virologia Vegetale del CNR UOS-Bari, Dipartimento di Scienze del Suolo, della Pianta e degli Alimenti, Università degli Studi di Bari “A.Moro”
- 2. Il progetto Reti di Laboratori SELGE SELGE si propone di innovare i laboratori istituzionalmente impegnati nelle attivita di miglioramento genetico e diagnosi fitosanitaria presenti nel territorio regionale al fine di introdurre innovazioni tecnologiche al caratterizzazione varietale indagine genetica controllo organismi nocivi quarantena servizio della , dell’ biochimica e e da e del degli
- 3. La piattaforma di sequenziamento Tecnologia Illumina ‘Sequencing by synthesis’ Cella a flusso HiScanSQ (Illumina)
- 4. La piattaforma di sequenziamento ed analisi bioinformatica Output 150 Gb Single reads: 750 milioni/flow cell Paired ends: 1,5 miliardi/flow cell Lunghezza reads: 2x100bp % basi con Q>30 85% HiScanSQ (Illumina) Servizi di bioinformatica Server di analisi/acquisizione/conservazione dati Dell Power edge R900 Powervault MD3000
- 5. Servizi in conto terzi Indagine nuovo agente virale (Cooperativa Mezzocorona) Scoperta di un nuovo virus della vite in Trentino small RNA sequencing 5’ CP RdRpol AAAAA3’ MP Grapevine Pinot gris virus Giampetruzzi et al. 2013
- 6. small RNA sequencing Silenziamento genico dell’RNA nelle piante un sistema immunitario RNA virus RNA a doppia elica Dicer vsiRNA 21-24 nt smallRNA p AGO OH p OH 21 mer CUAUAACCGCGCCGAGUUAGU p OH AGO RISC 21-24 nt RNA virale Una istantanea del contenuto in RNA virali/viroidali e del progredire del silenziamento dell’RNA in una data condizione fenologica e/o patologica Degradazione target CUAUAACCGCGCCGAGUUAGU AGO
- 7. Analisi bionformatica small RNA de novo assembly di small RNA con Velvet creazione di contigs ed analisi BLAST assembly su genoma di riferimento con SOAP
- 8. Collaborazioni per lo studio di patogeni di quarantena Scoperta di un nuovo virus degli agrumi in Turchia Small RNA e DNA sequencing Initiation site (TAATATTAC conserved across geminiviruses) 3462 3510 V2 (MP) C1 (Rep) P3 P1 V1 (CP) P2 C2 (Rep) T3 T 1 T2 V3 (MP) Loconsole et al. 2012 Citrus chlorotic dwarf associated virus
- 9. Progetti Mendel University, Faculty of horticulture – Department of virology, Brno, Czech Republic - librerie da piccoli RNA di vite per studio viroma viroma di 8 viti CRA-PAV di Roma - librerie di piccoli RNA da pesco suscettibile/tollerante a PPV Università degli Studi della Tuscia (Viterbo) - librerie di piccoli RNA per lo studio del mirnoma in piante di Leccino dwarf vs wild type. Regione Puglia “Progetti integrati per la biodiversità” “Recupero del Germoplasma Viticolo Pugliese” (Re.Ge.Vi.P.)
- 10. Servizi per il territorio Stato sanitario di 4 cloni fenotipicamente distinti di Primitivo di Manduria Viroma prima del risanamento Clone 1: GVA, GLRaV-3, GSyV1 Clone 2: GFLV, GRSPaV, HSVd Clone 3: GYSVd, HSVd Clone 4: GFLV, GVA Viroma dopo risanamento 1 2 Clone 1: sano 3 4 Clone 2: GRSPaV Clone 3: sano Clone 4: sano Small RNA sequencing CNR CISIA - Valorizzazione delle risorse genetiche di colture mediterranee attraverso approcci di metagenomica, trascrittomica e analisi funzionale per la caratterizzazione di germoplasma autoctono, endofiti, agenti di biocontrollo e fitopatogeni (METAGERM).
- 11. Servizi per il territorio Studi di comparazione del profilo dei sRNA e del transcrittoma (RNASeq) in cultivar di olivo ad alto e basso contenuto in acido grasso linolenico cv TOSCANINA, NOCIARA basso contenuto acido linolenico vs cv OGLIASTRO alto contenuto acido linolenico Pipeline Analisi in corso -Preprocessing -Assembling denovo transcripts (Velvet/Oases) -BLASTN searching homologies of trancripts vs olea mRNA -Bowtie alignment on transcripts--RSEM alignment -RSEM quantification of gene expression - Isolamento della isoforma plastidiale del gene Fad7 (Sabetta et al. 2013)
- 12. Servizi di sequenziamento : Analisi del trascrittoma (RNASeq) Purificazione mRNA Sintesi cDNA Sequenziamento high-throughput del cDNA Analisi bioinformatica dei dati Allineamento reads sul genoma di riferimento Normalizzazione e valutazione dell’espressione genica
- 13. Attività di ricerca RNA-Seq Escoriosi della vite Phomopsis viticola Vitis vinifera Studio dell’interazione Trattato (campione infetto) Non Trattato (campione sano) Progetto Fondazione Cassa di Risparmio di Puglia De Miccolis et al. 2013
- 14. Servizio in conto terzi Induzione di resistenza in vite Vitis vinifera Trattato (induzione dei meccanismi di difesa ) Non Trattato (controllo di riferimento) Estrazione RNA totali Botrytis cinerea Plasmopara viticola Sequenziamento librerie di mRNA Analisi trascrittomica (RNA-Seq) Azienda di fitofarmaci
- 15. Attività di ricerca RNASeq Marciumi radicali Portinnesti di Pesco (Prunus spp.) P. domestica selezione Tetra Armillaria mellea P. persica GF305 Trattato Non Trattato (campione infetto) (campione sano) Interazione pianta patogeno) De novo assembly del trascrittoma del fungo
- 16. Analisi bioinformatica dei dati RNASeq Numero totale di sequenze trascritte Campione Filtrate per la qualità QS≥30 Generate Totali Uniche Sano 36.388.913 29.541.451 15.543.933 Infetto 37.471.358 30.077.419 15.869.459 Analisi di espressione genicaRNA-Seq Campione CLCbio Non allineate Allineate ArrayStar (Q-Seq) Non allineate Allineate http://genomes.cribi.unipd.it/ Sano 7.194.822 22.346.629 4.227.046 25.314.405 Infetto 7.651.459 Vitis vinifera (12x) – PN40024 22.425.960 4.618.291 25.459.128 genoma: 486.265.420 bp geni annotati (V1): 29.971
- 17. Comparazione dei valori di espressione genica RNASeq 19068 20000 18000 16000 Sovraespressi: 3374 Numero geni 14000 12000 Sottoespressi: 2029 10000 8000 6000 2600 4000 2000 53 60 209 1908 452 93 24 4 0 0 Fold change Fold change: Rapporto tra i valori di espressione di ogni singolo gene in due campioni posti a confronto
- 18. Attività di ricerca Lotta a patogeni del post-raccolta Bicarbonato di sodio elettrolizzato per induzione di resistenza alla muffa grigia degli agrumi Penicillium digitatum Trattamenti/Librerie Individuazione delle vie metaboliche indotte nei frutti trattati e non mediante RNASeq Testimone (acqua) Sodio bicarbonato Acqua elettrolizzata in assenza di sale Sodio bicarbonato elettrolizzato
- 19. Attività di ricerca RNASeq in patotipi defolianti e non defolianti di Verticillum dahliae Espressione differenziale degli mRNA nei due patotipi in esame
- 20. Attività di ricerca RNASeq in Aspergillus carbonarius in condizioni inducenti e non la sintesi di Ocratossina A Over-expressed genes in inducing conditions for OTA biosynthesis 2 17 17 1 4 2 2 5 1 7 13 8 6 12 Secondary metabolites biosynthesis Carbohydrate metabolism Amino acid metabolism Lipid metabolism Nucleotide/nucleoside metabolism Energy production and conversion General function Transcription and translation Signal transduction mechanisms Transporter Cell wall/membrane/envelope biogenesis Protein integral to membrane Hypotetical protein No functional annotation
- 21. Applicazioni di metagenomica Viroma di un vigneto: Chiumenti et al. 2012 Libreria dsRNA Libreria sRNA N° contigs N° contigs Vitis vinifera 479 97 Grapevine leafroll-associated virus 3 132 - Grapevine rupestris stem pitting associated virus 131 - Grapevine leafroll-associated virus 2 80 12 Grapevine leafroll-associated virus 1 65 91 Grapevine leafroll-associated virus 9 40 - Grapevine virus A 37 3 Grapevine leafroll-associated virus Pr 15 - cv. Grapevine leafroll-associated virus 5 Panse precoce, Trani 5 - Grapevine virus B 3 - Grapevine yellow speckle viroid 1 - 7 Grapevine fleck virus - 5 Hop stunt viroid - 2 PoolGrapevine fanleaf da 7 piante con manifesti sintomi di enazioni di tessuti virus 1 16
- 22. Servizi per il territorio • Studio dell’eziologia del complesso del disseccamento rapido dell’olivo • Caratterizzazione della subspecie di Xylella fastidiosa associata alla malattia Paired end sequencing of a DNA library • Impatto: attività vivaistica ambientale economia agricola regionale
- 23. Ringraziamenti CNR-CISIA - Valorizzazione delle risorse genetiche di colture mediterranee attraverso approcci di metagenomica, trascrittomica e analisi funzionale per la caratterizzazione di germoplasma autoctono, endofiti, agenti di biocontrollo e fitopatogeni (METAGERM). www.selge.uniba.it Rotolo Pollastro Saponari Ippolito Savino V C Gerin S Minafra M Nigro A Faretra D A F F De Miccolis Angelini RM Giampetruzzi A Loconsole G Chiumenti M Sanzani S Antelmi I Montemurro C Sabetta W