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张美如
- 1. Viability of cell treated Carthamus tinctorius L. under oxidative stress in Spinocerebellar Ataxias-3 disease 张美如 長榮大學生物科技學系 實習單位：彰化基督教醫院 血管暨基因體研究中心 實習指導老師：張瑞芝 博士 摘要 利用細胞的活性評估，是否因加入紅花的萃取物(CT)而可以有效的抑制因為氧化壓力而造成受傷的細胞，在過去的研究中發現，紅花的 萃取物可能可以被使用做抗氧抗氧化劑，降低因為氧化壓力所引發的毒性。這次的實驗使用正常人人類淋巴球細胞株(Normal LCL)及患 有小腦萎縮症第三型病人的淋巴球細胞株(SCA-3 LCL)，分別做為處理tert-butyl hydroperoxide/Rotenone以及沒有處理tert-butyl hydroperoxide/Rotenone兩組，加入tert-butyl hydroperoxide及Rotenone是為了模擬在氧化壓力的狀況下。觀察氧化壓力受傷的細胞，在加入 CT後細胞的存活率。 前言 Spinocerebeller ataxia type 3 (SCA3) Spinocerebeller ataxia type 3 (SCA3)是脊髓小腦病變的三型，也被稱為Machado-Joseph disease（MJD),是中樞神經系統發生病變的一系列遺傳 病的一種。和其他遺傳性共濟失調疾病一樣，SCA3由於一種特定的基因缺陷而導致腦部和從腦部發送和接受信號的神經纖維中的神經細胞出 現障礙而形的。 Carthamus tinctorius L. 紅花紅色素體外對超氧自由基和β-胡蘿蔔素-亞油酸氧化體系均有顯著的抑制作用。 花、種子、芽的提取物及所含酚性成分，葉所含的槲皮素、木犀草素等黃酮類成分均有抗氧化活性。 tert-butyl hydroperoxide(tBH) 是一種有機的過氧化物，廣泛的用於各種氧化過程。 Rotenone 是一種無味的化學物質，由於會干擾mitochondria的電子傳遞鏈，因此和帕金森氏症的發展相關。 本實驗欲探討利用細胞的活性評估，是否因加入紅花的萃取物(CT)而可以有效的抑制因為氧化壓力而造成受傷的細胞，在過去的研究中發現， 紅花的萃取物可能可以被使用做抗氧抗氧化劑，降低因為氧化壓力所引發的毒性。這次的實驗使用正常人人類淋巴球細胞株(Normal LCL)及 患有小腦萎縮症第三型病人的淋巴球細胞株(SCA-3 LCL)，分別做為處理tert-butyl hydroperoxide/Rotenone以及沒有 處理tert-butyl hydroperoxide/Rotenone兩組，加入tert-butyl hydroperoxide及Rotenone是為了模擬在氧化壓力的狀況下。觀察氧化壓力 受傷的細胞，在加入CT後細胞的存活率。 實驗步驟 After seeding Each conc( 0.1.5 and 10 μg/ml ) After treating 48 Reaction 2 hrs SCA-3 LCL 2 hrs hrs 測OD Seeding cells to 96 well of reagent must be 3 reapeat 加WST-1 (1:10) plate(5x104cells/ml) (450nm偵測) Normal LCL CT+tBH(300μM)/CT+Rotenone(2μM) 實驗結果 (一).Normal cell處理CT/CT+t-BH (二).Normal cell處理CT/CT+Rotenone (三).SCA-3 cell處理CT/CT+t-BH Normal cell viability Normal CT/CT+Rotenone SCA-3 CT/CT+tBH Cel l vi abi l i t y( % ) ) ) ) ) 120% 120% 120% Cel l vi abi l i t y( % ) 100% Cell viability(%) 100% 100% 80% 80% 80% CT CT CT 60% 60% 60% CT+tBH CT+Rotenoe CT+tBH 40% 40% 40% 20% 20% 20% 0% 0% 0% 0 1 5 10 0 1 5 10 0 1 5 10 CT conc.(μ g/ml) (tBH300uM) Conc. of CT(μ g/ml) (Rotenone=2μ M) Conc. of CT(μ g/ml) (Tbh=300μ M) 在Normal cell加入CT後，發現濃度1、5μg/ml的 在Normal cell處理Rotenone(2μM)所引發 在SCA-3 cell 處理CT+t-BH (300μM) CT可能不會造成毒性，濃度10μg/ml可能會造成毒 的氧化傷害，加入CT後，並沒有明顯的抑 後的cell viability，和未處理t-BH 的 性。在Normal cell處理CT+t-BH (300μM) 後的 制細胞凋亡，可能是 SCA-3 cell的cell viability相比，可 cell viability，明顯的降低了cell viability， Rotenone(2μM)的濃度對Normal LCL還不 能不會造成毒性。 因此，t-BH(300μM)可能對Normal cell會造成毒 足以造成養氧化傷害。 性。 (四).SCA-3 cell處CT/CT+Rotenone 討論 SCA-3 CT/CT+Rotenone 初步的實驗結果發現，當Normal LCL加CT(1μg/ml)可以有效的抑制處於因t-BH(300μM)所引發的氧化 120% Cel l vi abi l i t y( % ) 傷害下，但是，在加入Rotenone(2μM)所引發的氧化傷害，加入CT後，並沒有明顯的抑制細胞凋亡,因 100% 此，可能(2μM的Rotenone對Normal LCL並不會造成氧化傷害，下一次的實驗可以加重濃度。而SCA3 80% CT LCL處於因為t-BH(300μM)及Rotenone(2μM)所引發的氧化傷害下，加入CT皆可以明顯的抑制細胞凋亡。 60% CT+Rotenone 40% 但是，SCA3 LCL處理CT後的Cell viability兩次實驗並不一致，因此，有可能是因為seeding cells時 20% 不均勻，因此必須再做三重複實驗，已達實驗的準確度。 0% 誌謝 0 1 5 10 實習期間，謝謝張瑞芝 博士、毓琪 學姊的指導還有科宏學長的協助以及實驗室各位學長、學姊的互相幫忙。 Conc. of CT(μ g/ml) (Rotenone=2μ M) 參考文獻 在SCA-3 cell 處理CT+Rotenone (2μM) Cite this article as: Shen et al.: Ginkgo biloba extract(EGb761) inhibits mitochondria-dependent caspase pathway and prevents apoptosis in hypoxia-reoxygenated cardiomyocytes. Chinese Medicine 2011 6:8. 後的cell viability，和未處理Rotenone Eun Mi Choi1, Gun-Hee Kim1,2 and Yong Soo Lee1,3* 的SCA-3 cell的cell viability相比，可 1Plant Resources Research Institute, Duksung Women’s University, Seoul, Korea 能不會造成毒性。